Summary
En protokol til kroniske infusioner af glukose og Intralipid i rotter er beskrevet. Denne model kan anvendes til at undersøge virkningen af næringsstof overskud på organfunktion og fysiologiske parametre.
Abstract
Kronisk eksponering for høje niveauer af næringsstoffer postuleres at påvirke funktionen af flere organer og væv og bidrage til udviklingen af mange komplikationer forbundet med fedme og det metaboliske syndrom, herunder type 2-diabetes. At studere de mekanismer, som høje niveauer af glukose og fedtsyrer påvirker pancreas beta-celle og udskillelsen af insulin, har vi etableret en kronisk næringsstof infusion model i rotter. Proceduren består i catheterizing den rigtige halsfedt og venstre halspulsåre under fuld narkose, så en 7-dages rekreation periode forbinder katetre til pumperne ved hjælp af en drejelig og modvægt system, der gør det muligt for dyret at bevæge sig frit i buret og infusion glucose og / eller Intralipid (en sojabønneolieemulsion som genererer en blanding af omkring 80% unsaturated/20% mættede fedtsyrer, når infunderes med heparin) i 72 timer. Denne model tilbyder flere fordelagtigeGES, herunder muligheden for at fint modulere målet niveauer af cirkulerende glukose og fedtsyrer, mulighed for at infunderes farmakologiske forbindelser, og den relativt korte tidsramme, i modsætning til kosten modeller. Det kan bruges til at undersøge mekanismerne i næringsstof-induceret dysfunktion hos en række organer og for at teste effektiviteten af lægemidler i denne sammenhæng.
Introduction
Kronisk forhøjede niveauer af glucose og lipider i kredsløbet er blevet foreslået at bidrage til patogenesen af type 2-diabetes ved at ændre funktionen af flere organer impliceret i opretholdelse af glukose homøostase, herunder, men ikke begrænset til, pancreas-beta-celler (revideret i 1). De glucotoxicity hypotese postulerer, at kronisk hyperglykæmi forværrer beta-cell mangel, som gav anledning til hyperglykæmi i første omgang, og dermed skabe en ond cirkel, og bidrager til en forværring af glukose ved type 2-diabetes patienter. Ligeledes glucolipotoxicity hypotese foreslår, at samtidig forhøjelse af glukose-og lipid niveauer, så ofte observeret i type 2-diabetes, er til skade for den beta-celle.
Decifrere de cellulære og molekylære mekanismer af de skadelige virkninger af kronisk forhøjede næringsstoffer på pancreas beta-celle funktion er nøglen til understanding af patogenesen af type 2-diabetes 1.. Til det formål har en lang række undersøgelser undersøgt de mekanismer af kronisk næringsstof overskydende ex vivo i isolerede Langerhanske øer eller in vitro i klonede, insulinproducerende cellelinjer. Imidlertid oversættelse af resultaterne opnået i disse modelsystemer til hele organismen er kompleks, især fordi koncentrationerne af fedtsyrer anvendes i dyrkede celler eller holme sjældent matche de cirkulerende niveauer i nærheden af beta-celler in vivo 2. På den anden side har de mekanismer af beta-celle svigt i respons på næringsstof overskud blevet undersøgt i gnavermodeller for diabetes, som eksemplificeret ved Zucker Diabetic Fatty rotte 3,4, gerbil Psammomys obesus 5 og fedtrig kost- fodret mus 6.. Disse modeller er imidlertid kendetegnet ved iboende metaboliske abnormiteter og er ikke let modtagelig for manipulationer af blodsukkerog / eller lipid niveauer i en mere kontrolleret og mindre kronisk indstilling. At være i stand til at ændre cirkulerende næringsstof niveauer i en tidsramme på dage i ellers normale dyr, har vi udviklet en kronisk infusion model i normale rotter, som gør det muligt at undersøge virkningerne af lipider og glukose, alene eller i kombination, på fysiologiske parametre og funktion 7,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Oversigt: Proceduren består i catheterizing den rigtige halsfedt og venstre halspulsåre under fuld narkose, så en 7-dages rekreation periode forbinder katetre til pumperne ved hjælp af en drejelig og modvægt system, der gør det muligt for dyret at bevæge sig frit i buret; og infusion af glucose og / eller Intralipid (en sojabønneolieemulsion som genererer en blanding af omkring 80% unsaturated/20% mættede fedtsyrer, når infunderes med heparin 9) i 72 timer.
1.. Canulation af Right halsvenen og venstrefløjen halspulsåren
- Sterilisere kirurgiske instrumenter. Canulation Slangen skal også være kold steriliseret ved hjælp af et flydende steriliseringsmiddel (2,6% glutaraldehyd) forud for proceduren. Fordyb slangen i en autoklaveret beholder til 16-24 timer. Skyl og skylles grundigt med sterilt destilleret vand for at fjerne alle spor af glutaraldehyd før brug.
- Afvejes rotte til at beregnemedikamentdoser:
Carprofen 5 mg / kg: fortynding 1/10 = Legemsvægt (g) x 0.001 ml SC (smertestillende middel)
Glycopyrrolat 0,01 mg / kg: fortynding 1/10 = BW (g) X 0,0012 ml SC (antikolinerg) - Bedøver rotten hjælp isofluran og oxygen.
- Placer rotte på maven. Barbere området bag ørerne til bunden af skuldrene. Lay rotte på ryggen. Barbere området under halsen til forpoterne.
- Prep operationsstedet med chlorhexidin, alkohol og iod. Administrere lægemidler.
- Overfør rotte til det kirurgiske område.
- Anvendelse af aseptisk teknik, den højre halsvene og den venstre carotidarterie med et PE-50 kanylen fastgjort til en 1 ml sprøjte fyldt med 5 U hepariniseret saltvand canulate. Skyl kanyler med 50 U hepariniseret saltvand for at undgå koagulation i løbet af restitutionsperioden. Brug sløvet 23G nåle. Luk hver kanylen med en 23G nål.
- Efter operationen, trim ca 2,5 mm frabund fortænder og placere rotten i en infusion jakke for at forhindre, at kanyler fra at blive spist.
- Give ilt (1 L / min i 10 min) for at hjælpe evakuere isofluran.
- Placer rotte i en opvarmet bur indtil det er helt vågen.
- Betjen fire rotter til at bruge én pr infusion tilstand (tabel 1).
2.. Postoperativ pleje (Post-kirurgisk behandling og tilslutning af Katetre)
- Afvej rotter på dag 1 og dag 2 efter kirurgi.
- Administrere Glycopyrrolat (BW (g) x 0,00048 ml) subkutant to gange på dag 1 efter operationen og en gang på dag 2 efter kirurgi.
- Yderligere støttende behandlinger kan indgives, hvis det er nødvendigt: væsker, varmepude, våd kost, ilt terapi, analgetika, antikolinergika.
- På dag 7 post-kirurgi, vejer rotterne til at beregne flow til infusion.
- Tilslut hver rotte til et infusionssystem med en forankring og drejelig monteret på et bur grill top (figur 1).
- Skyl kanyler med 5 U hepariniseret saltvand til fjernelse blodpropper. Skyl kanyler endnu engang med 50 U hepariniseret saltvand for at forhindre koagulation.
- Lad rotterne at akklimatisere til tøjret og drej for mindst 24 timer før infusionen.
3.. Infusion
- Tegn 0,15 ml blod fra carotis af hver rotte og måle glykæmi. Skyl jugularis kanyler. Brug 50 U hepariniseret saltvand for at forhindre koagulation i begge kanyler af hver rotte.
- Overfør blodprøven til en 0,5 ml opsamlingsrør indeholdende 2% EDTA. Centrifugeres ved 10.000 rpm i 2 min og fryse plasmaet ved -20 ° C.
- Fyld to 60 ml sprøjter for hver af infusion nedennævnte tilstande. Placer Sprøjte 1 på den forreste position af pumpen og sted Sprøjte 2 på bagsiden position af pumpen.
- Deltag hvert par af løsninger sammen med y-stik og CO-EX T22 slanger, der er blevet steriliseret. Placer sprøjter på en Harvard 33dobbelt sprøjtepumpe.
- Skift buret bund og fjerne alle fødevarer fra buret grill top.
- Afvejes 150 g standard chow og sted på buret grill top.
- Slut sprøjterne til den drejelige på buret rist. Skyl sprøjter korrekt at fjerne fanget luft fra linjerne.
- Beregn infusions strømningshastigheder hjælp af kropsvægt, der blev taget forud for etablering af rotte til infusionssystemet. Priser er beregnet med en Microsoft Excel-fil, der konverterer glukose infusionshastigheden (GIR) ind ml / h.
- Indstille pumpen at administrere strømningshastigheder i 60 ml sprøjter ifølge producentens indstillinger. Indtast satsen for sprøjte 1 (front sprøjte) og prisen for sprøjte 2 (back sprøjte).
- Start pumpen.
4.. Overvågning
- Efter opstart, kontrollere, at der ikke er nogen lækage fra den drejelige eller fra kanyler og at infusionsslange ikke er snoet. Kontroller også, at der ikke er nogen luftbobler islangen.
- Efter 3 timer af infusionen, tage en blodprøve for at overvåge glycemia. Gentag efter 6, 24, 48 og 72 timer af infusionen. Som en forholdsregel, glycemia overvåges også efter 30, 34, 54, og 60 hr af infusionen. Blodsukker kan måles ved hjælp af en dråbe af fuldblod ved hjælp af en bærbar glukosemonitor. Dette begrænser mængden af blod udtaget under infusionen og undgår derfor væsentlig ændring blodvolumen og / eller hæmatokrit.
- Satsen for injektionssprøjte 1 ændres baseret på glycemia værdier til at opretholde blodsukker på 220-250 mg / dl. Satsen for Syringe 2 ikke ændre sig under 72 timer af infusionen, fordi frie fedtsyrer fastholdes på 1 mmol / L.
- Infusionshastigheder betingelser er parret således at volumenet modtaget for kontroldyrene svarer til den mængde modtaget til forsøgsdyr (tabel 1).
- Efter 24 timer af infusionen, ændre kurvens bund og vejes fødevarer tilbage i buret rist. Retur levnet portion to buret rist. Gentag efter 48 timer.
- Refill sprøjter dagligt om nødvendigt under 72 timer af infusionen.
- Under infusion, observere altid rotten for tegn på betændelse eller ubehag. Indgiv passende pleje, hvis nødvendigt.
5.. Post-infusion Eutanasi
- Efter 72 timer af infusionen, er rotter bedøvet intravenøst med 0,5 ml af en ketamin / xylazin cocktail (182 mg / kg ketamin og 11,6 mg / kg xylazin fortyndet 1:2 med 0,9% NaCl).
- Tå-pinch refleks anvendes til at kontrollere niveauet af anæstesi. Yderligere bedøvelsesmiddel administreres efter behov.
- Når rotten er bedøvet, er bughulen åbnes med kirurgiske sakse. Rotten afblødt ved at trække 10-15 ml blod i en sprøjte fra aorta eller vena cava.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ud af en serie af 42 rotter, som blev opereret, blev 5 rotter tabt under den post-operative periode, og 1 rotte gik tabt under infusionen, der repræsenterer en samlet succesrate på 86%. Den gennemsnitlige kropsvægt af de 37 rotter, der i sidste ende blev infunderet var 608 ± 5 g før kirurgi og 588 ± 6 g ved indledningen af infusion (gennemsnit ± SE, n = 37, p <0,0001 ved parret t-test). De følgende repræsentative resultater blev opnået i 2 infusion grupper:. Saline (SAL) og glucose + Intralipid (GLU + IL) Tal 2A og 2B viser blodsukker og fedtsyrer niveauer, henholdsvis under 72 timers infusionsperiode. Ved design, blodsukkerniveauet opretholdes omkring 220-250 mg / dl gennem hele infusionen, baseret på regelmæssige målinger og justeringer af glukose infusionshastigheden (GIR) som vist i figur 3. Gnavere har en stærk evne til at kompensere for glucoseinfusionen ved at øge endogen insulinsekretion SEcretion. Derfor skal GIR øges i løbet af infusionen for blodsukkerniveauet opretholdes ved en relativ stabil tilstand. Alligevel blodsukkerniveauet tendens til at falde mod slutningen af infusionen, som det ses i figur 2A. Da dyrene er infunderes med kaloriefattige næringsstoffer, de spontant nedsætte deres fødeindtagelse (fig. 4).
| Infusion Tilstand | Injektionssprøjte 1 (front position) | Sprøjte 2 (back position) |
| 1 | Dextrose 70% | Saline |
| 2 | Saline | Saline |
| 3 | Dextrose 70% | Intralipid 20% + Heparin 20U/ml |
| 4 | Saline | Intralipid 20%% + Heparin 20U/ml |
Tabel 1. Infusion regimer.
Figur 1. Fotografi af infusionen, der viser rotten med katetre på plads, og tøjret, drejning og modvægt arm monteret på buret grill.
Figur 2. . Plasma niveauer af glukose (A) og frie fedtsyrer (B) under infusion af saltvand (SAL) eller co-infusion af glucose og Intralipid (GLU + IL) i 6 måneder gamle Wistarrotter data er gennemsnit ± SEM af 3 - 4 dyr i hver gruppe.
Figur 3 "src =" / files/ftp_upload/50267/50267fig3.jpg "/>
Figur 3. Justering af glukose infusionshastigheden under co-infusion af glucose og Intralipid (GLU + IL) i 6 måneder gamle Wistarrotter. Data er gennemsnit ± SEM af 4 dyr.
Figur 4.. Gennemsnitlig daglig fødeindtagelse af 6-måneder gamle Wistarrotter tilført med saltvand (SAL) eller co-infunderes med glucose og Intralipid (GLU + IL). Data gennemsnit ± SEM af 3-4 dyr i hver gruppe. ** P <0,01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om en række tidligere undersøgelser har anvendt kroniske infusioner af glukose (f.eks 10-15) eller lipider (f.eks 16,17) i gnavere, vores viden kombineret infusion af begge brændstoffer er kun blevet rapporteret i mus 18. Den kroniske infusion model præsenteres her giver flere fordele at studere virkningerne på næringsstof overskud på en række biologiske funktioner hos rotter. Først, betyder det ikke involverer genetisk fede gnavere, og siden almindelig fedme hos mennesker er polygenisk 19 resultaterne er derfor mere tilbøjelige til at være relevante for virkningerne af næringsstoffer overudbud i den almindelige befolkning. For det andet, denne model giver mulighed for at afprøve virkningerne af forskellige næringsstoffer (især sukker eller fedt) ved forskellige cirkulerende niveauer, ved at ændre deres art og infusionen strømningshastighed. Tredje IV indgivelsesvej muliggør co-infusion af forbindelser eller lægemidler sammen med nutrients 20. Endelig relativ kort tidshorisont af forsøget (72 hr vs uger fedtrig kost inducerede modeller) er omkostningseffektiv og tid-effektiv for prækliniske studier.
Denne model har også nogle ulemper og begrænsninger. Først som enhver kirurgisk model kræver højt uddannede og kvalificerede medarbejdere i aseptisk kirurgi. Det andet, som nævnt i Repræsentative resultater sektionen dyrene har tendens til at kompensere for glukose infusion ved at øge endogen insulinsekretion, som kræver hyppig kontrol af blodsukkeret og justeringer af GIR at opretholde målet blodsukkerniveauer hele infusionen. For det tredje, er proceduren ikke er let for mus, som ville være nødvendige for at bruge det i genetisk modificerede dyr. Det er vores erfaring, er kateterisation både halsfedt og halspulsåren i mus i teknisk udfordrende og den nemmeste tilgang i disse mindre dyr at placere en jugular kateter til infusion og til prøve fra en perifer fartøj. Dette er imidlertid væsentligt begrænser omfanget og hyppigheden af prøveudtagningen i løbet af infusionen.
Da fokus for vores laboratorium har vi brugt denne model til at studere de mekanismer af glucolipotoxicity i pancreas beta-celle 7,8. Dog kan det anvendes til at studere virkningerne af næringsstoffer overskud i enhver væv og organer, såsom, men ikke begrænset til, hjerte 21, skeletmuskulatur, 22 og lever 23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vincent Poitout er medstifter af og modtog forskningskontrakter fra Bêtagenex Inc., en kontrakt forskning organisation, som tilbyder infusionen model præsenteres i denne artikel som en kommerciel service.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (R01DK58096 til Vincent Poitout). Vincent Poitout holder Canada Research Chair i diabetes og pancreas betacellefunktion. Bader Zarrouki modtog ph.d.-stipendier fra Merck og Eli Lilly. Ghislaine Fontes blev understøttet af en post-ph.d.-stipendium fra den canadiske Diabetes Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline 0.9% | BD | JB1324 | |
| Dextrose 70% | McKesson | ||
| Intralipid 20% | Fresenius Kabi | JB6023 | |
| Metricide (Glutaraldehyde 2.6%) | Metrex | 11-1401 | |
| Heparin Sodium 10,000 USP u/ml | PPC | ||
| Carprofen | Metacam | ||
| Glycopyrrolate | Sandoz | ||
| Isoflurane | Abbott | ||
| Chlohexidine 2% | |||
| Alcohol 70% | |||
| Iodine | |||
| PE-50 | BD | 427411 | |
| CO-EX T22 | Instech Solomon | BCOEX-T22 | |
| Connector 22G | Instech Solomon | SC22/15 | |
| Swivel 22G | Instech Solomon | 375/22PS | |
| Y-Connector 22G | Instech Solomon | ||
| Counterbalance and arm | Instech Solomon | CM375BP | |
| 23 G blunted needles | Instech Solomon | LS23 | |
| 23 G canulation pins | Instech Solomon | SP23/12 | |
| Tethers (12 inch) | Lomir | RT12D | |
| Infusion jackets | Lomir | RJ01, RJ02, RJ03, RJ04 | |
| (SM-XL) | |||
| Tether attachment piece | Lomir | RS T1 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| 1 ml syringe | BD | 309602 |
References
- Poitout, V., Robertson, R. P. Glucolipotoxicity: fuel excess and beta-cell dysfunction. Endocr. Rev. 29, 351-366 (2008).
- Poitout, V., et al.
- Unger, R. H. Minireview: weapons of lean body mass destruction: the role of ectopic lipids in the metabolic syndrome. Endocrinology. 144, 5159-5165 (2003).
- Harmon, J. S., Gleason, C. E., Tanaka, Y., Poitout, V., Robertson, R. P. Antecedent hyperglycemia, not hyperlipidemia, is associated with increased islet triacylglycerol content and decreased insulin gene mRNA level in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 50, 2481-2486 (2001).
- Bachar, E., Ariav, Y., Cerasi, E., Kaiser, N., Leibowitz, G. Neuronal nitric oxide synthase protects the pancreatic beta cell from glucolipotoxicity-induced endoplasmic reticulum stress and apoptosis. Diabetologia. 53, 2177-2187 (2010).
- Peyot, M. L., et al. Beta-cell failure in diet-induced obese mice stratified according to body weight gain: secretory dysfunction and altered islet lipid metabolism without steatosis or reduced beta-cell mass. Diabetes. 59, 2178-2187 (2010).
- Hagman, D. K., et al. Cyclical and alternating infusions of glucose and intralipid in rats inhibit insulin gene expression and Pdx-1 binding in islets. Diabetes. 57, 424-431 (2008).
- Fontes, G., et al. Glucolipotoxicity age-dependently impairs beta cell function in rats despite a marked increase in beta cell mass. Diabetologia. 53, 2369-2379 (2010).
- Stein, D. T., et al. Essentiality of circulating fatty acids for glucose-stimulated insulin secretion in the fasted rat. J. Clin. Invest. 97, 2728-2735 (1996).
- Leahy, J. L., Cooper, H. E., Weir, G. C. Impaired insulin secretion associated with near normoglycemia. Study in normal rats with 96-h in vivo glucose infusions. Diabetes. 36, 459-464 (1987).
- Hager, S. R., Jochen, A. L., Kalkhoff, R. K. Insulin resistance in normal rats infused with glucose for 72 h. The American Journal of Physiology. 260, 353-362 (1991).
- Laybutt, D. R., Chisholm, D. J., Kraegen, E. W. Specific adaptations in muscle and adipose tissue in response to chronic systemic glucose oversupply in rats. The American Journal of Physiology. 273, E1-E9 (1997).
- Jonas, J. C., et al. High glucose stimulates early response gene c-Myc expression in rat pancreatic beta cells. The Journal of Biological Chemistry. 276, 35375-35381 (2001).
- Tang, C., et al. Glucose-induced beta cell dysfunction in vivo in rats: link between oxidative stress and endoplasmic reticulum stress. Diabetologia. 55, 1366-1379 (2012).
- Alonso, L. C., et al. Glucose infusion in mice: a new model to induce beta-cell replication. Diabetes. 56, 1792-1801 (2007).
- Magnan, C., Gilbert, M., Kahn, B. B. Chronic free fatty acid infusion in rats results in insulin resistance but no alteration in insulin-responsive glucose transporter levels in skeletal muscle. Lipids. 31, 1141-1149 (1996).
- Goh, T. T., et al. Lipid-induced beta-cell dysfunction in vivo in models of progressive beta-cell failure. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 292, 549-560 (2007).
- Pascoe, J., et al. Free fatty acids block glucose-induced beta-cell proliferation in mice by inducing cell cycle inhibitors p16 and p18. Diabetes. 61, 632-641 (2012).
- Bell, C. G., Walley, A. J., Froguel, P.
- Fontes, G., Hagman, D. K., Latour, M. G., Semache, M., Poitout, V. Lack of preservation of insulin gene expression by a glucagon-like peptide 1 agonist or a dipeptidyl peptidase 4 inhibitor in an in vivo model of glucolipotoxicity. Diabetes Res. Clin. Pract. 87, 322-328 (2010).
- Crawford, P. A., Schaffer, J. E. Metabolic stress in the myocardium: Adaptations of gene expression. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. , (2012).
- Kewalramani, G., Bilan, P. J., Klip, A. Muscle insulin resistance: assault by lipids, cytokines and local macrophages. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab Care. 13, 382-390 (2010).
- Cusi, K. Role of obesity and lipotoxicity in the development of nonalcoholic steatohepatitis: pathophysiology and clinical implications. Gastroenterology. 142, 711-725 (2012).
