Design af et Bio-responsiv Robot fra DNA Origami

Summary

DNA-origami er en stærk metode til fabrikere præcise nanoskala objekter ved at programmere den selv-samling af DNA-molekyler. Her beskriver vi, hvordan DNA-origami kan anvendes til at designe en robot robot kan registrere biologiske signaler og reagerer ved form flytte efterfølgende videresendes til en ønsket virkning.

Abstract

Nukleinsyrer er forbavsende alsidig. Ud over deres naturlige rolle som lagermedium for biologisk information ^1, kan de anvendes i parallel computing ^2,3, genkender og binder molekylære eller cellulære mål ^4,5 katalyserer kemiske reaktioner ^6,7, og generere beregnede reaktioner i en biologisk systemet ^8,9. Vigtigt er det, kan nukleinsyrer programmeres til selv samle ind 2D-og 3D-strukturer ^10-12, gør det muligt at integrere alle disse bemærkelsesværdige funktioner i en enkelt robot forbinder sensing af biologiske signaler til en forudindstillet reaktion for at udøve en ønsket effekt.

Oprettelse figurer fra nukleinsyrer blev først foreslået af Seeman ^13, og flere variationer over dette tema er siden blevet realiseret ved hjælp af forskellige teknikker ^11,12,14,15. Men den mest betydningsfulde er måske den, der foreslås af Rothemund, betegnes scaffolded DNA-origami16.. I denne teknik er foldningen af en lang (> 7.000 baser) enkeltstrenget DNA 'stillads »rettet til en ønsket form af hundredvis af korte komplementære strenge kaldes» hæfteklammer. Foldning udføres ved temperatur annealing rampe. Denne teknik blev succesfuldt demonstreret i skabelsen af ​​en bred vifte af 2D figurer med bemærkelsesværdig præcision og robusthed. DNA-origami blev senere udvidet til 3D samt ^17,18.

Den nuværende papirbaserede vil fokusere på caDNAno 2.0-software ¹⁹ udviklet af Douglas og kolleger. caDNAno er et robust, brugervenligt CAD-værktøj gør det muligt at udformningen af ​​2D-og 3D-DNA-origami figurer med alsidige funktioner. I designprocessen er afhængig af en systematisk og præcis abstraktion ordning for DNA strukturer, hvilket gør det relativt enkelt og effektivt.

I dette papir viser vi udformningen af ​​en DNA-origami nanorobot der er for nylig blevet beskrevet ^20. Denne robot er "robot" i den forstand, at det links sensing aktivering, for at udføre en opgave. Vi forklarer, hvordan forskellige sensing ordninger kan integreres i strukturen, og hvordan dette kan videresendes til en ønsket effekt. Endelig bruger vi Cando ²¹ at simulere de mekaniske egenskaber af den designede facon. Konceptet vi diskutere kan tilpasses til mange forskellige opgaver og indstillinger.

Protocol

Robotten vil vi designe i dette papir imødekommer et protein P ved at lave en last C tilgængelig til at binde til receptorer på overfladen af en udvalgt målcelle. Robotten er vist i figur 1 C, kan være en receptor-blokerende stof,. En vækstfaktor etc., og en måde at kemisk knytte det til et DNA-oligonukleotid skal være til rådighed, der ikke ødelægger dens funktion. Robotten har to stater. Når inaktive, DNA porte på de to eksterne læber «er hybridiseret, og sørg for robotten forbliver lukket, så ethvert lastet inden den er sikkert afsondret. I nærvær af protein P,. Portene åbne ved den ene af flere mekanismer (beskrevet nedenfor) tillader robotten at åbne og eksponere lasten Ved udformningen af ​​strukturen, mener, at robotten skal være fleksibel nok til at lukke på sig selv i den lukkede tilstand, og fjederen til den åbne tilstand, når portene gør det muligt at gøre det. Modellering opførsel af et DNA struktur integrerer termodynamiske og mekaniske komponenter er svært, og det faktiske objekt måske kræve nogle iterativ forbedring. Ikke desto mindre, her er vi fokusere på design processen ved hjælp af en generel arbejdsmodel, der kan bygges videre på.

Bemærk

For en mere omfattende forståelse af processen med DNA-origami design og foldning, stærkt anbefaler vi at læse den oprindelige caDNAno papir af Douglas og kolleger ^19, hvilket forklarer den abstrakte repræsentation af DNA i design interface og hvordan det relaterer til den faktiske molekylære struktur af et 3D-DNA form. Dette papir er ledsaget af to video-tutorials beskriver caDNAno repræsentation og grænseflade på en meget klar måde. Derudover anbefaler vi, at læse den nyere papir ved Dietz og kolleger beskriver mange vigtige aspekter og detaljerede protokoller folde proces, herunder Cando analyseværktøj ^21..

TLE "> 1.. Hent og installer caDNAno 2.0 og Autodesk Maya 2012

Bemærk: Autodesk software er gratis for studerende og akademisk brug. Instruktionerne nedenfor nævnes oprettelsen af ​​en akademisk konto på Autodesk.

1. Opret en akademisk konto på http://students.autodesk.com/ . Efter at have modtaget kontoopsætningen e-mail, klik på aktiverings linket og udfyld dine præferencer som ønsket.
2. Hent den gratis version af Maya 2012 fra Download Center.
3. Installer Maya 2012 på din computer.
4. Kør Maya gang før du installerer caDNAno 2.0.
5. Download og installer den nyeste version af caDNAno 2,0 fra http://cadnano.org/ .
6. Kør Maya 2012. En caDNAno ikon skal vises i øverste højre hjørne af den grafiske brugergrænseflade. Klik på ikonet for at gå ind i caDNAno.

2.. OutlIne den ønskede form og Scaffold Strand Path

1. Udformningen interface caDNAno inden Maya omfatter 3 paneler (figur 2):
   1. Topplade: gitter visning, hvor formen er i første omgang skitseret. Dette panel muliggør dobbelt helix-aktioner og giver et tværsnit af formen.
   2. Bundplade: redigering panel, så enkelt base-level handlinger.
   3. Højre panel: en Maya-genereret real time 3D-model af formen
2. Klik på "Honeycomb"-ikonet. Zoome ind på og ud af gitter i den øverste panel kan gøres ved mus rulle op og ned, hhv.
   caDNAno giver to mulige design lattices, bicelle og offentlig, i dette papir vil vi bruge honeycomb layout, selvom kvadratisk gitter kan generelt bruges som godt ^22.
3. Start med at trække den del af den ønskede form på venstre panel.
   Hver cirkel repræsenterer en dobbelt DNA-helixen. Til choose helixerne der bygger formen, blot venstre-klikker på deres center (Figur 3). Fortsæt helix af helix indtil hele figuren er skitseret. Alternativt kan formen trækkes ved at trykke på venstre museknap og løbende trække figurens kontur. Enhver handling kan fortrydes ved at klikke på menuen Rediger og "Fortryd" eller ved tastaturgenvejen CTRL + Z (pc) eller CMD + Z (Mac).
   På dette tidspunkt vil de udvalgte helixerne forekommer gul. Samtidig vil det nederste panel viser et sidebillede af formen, der består af disse helixer. Helix nummerering i det nederste panel er i overensstemmelse med nummereringen i den øverste.
4. Observere det nederste panel. Hver helix er repræsenteret ved to rækker af kvadrater: rækkerne er de to dele af den dobbelte helix, med hver firkant repræsenterer en base (Figur 4).
   Den orange lodrette linje afgør, hvor redigeringshandlinger finde sted langs en helix. Basen position langs Gitteret vises somet tal over den orange streg. Helix rammer default længde er 42 baser. Længden kan udvides ved at klikke på en af ​​de grå pil ikoner øverst højre hjørne af redigering panelet og vælge forlængelsen længde (i multipla af 21, der svarer til to fulde drejninger af DNA helix, hvor en tur spænder 10,5 baser) (Figur 4). Nettet vil udvide til retningen af den valgte pil.
5. For at plotte den faktiske stillads strand sti hele figuren, skal du trykke på museknappen, skal du starte fra den første helix og gå kontinuerligt over alle helixerne efter samme rækkefølge, som de oprindeligt blev udvalgt i afsnit 2.3. Bemærk, at:
   1. Helixerne valgte denne gang vil skifte farve til orange.
   2. I det nederste panel, vil stillads streng fragmenter automatisk trukket på de udvalgte helices.
   3. Det højre panel viser 3D-model af formen bygges i realtid. Ved afslutningen af ​​detteproces, et udkast af stilladset streng vej vil automatisk blive trukket i den nederste panel (Figur 5).
6. Tegn et rektangel omkring alle længst til venstre kanter af stilladset stien. Bemærk, at kanterne, så valgte vises rød (figur 6).
7. Forlæng skafottet stien ved at trække de udvalgte kanter som en gruppe til venstre side af nettet. Gentag denne proces for de rigtige kanter, indtil stien er korrekt forlænges. Bemærk, at stilladset udvidelse udvider også 3D-form i højre panel (Figur 7).
8. Find stilladset sti dele, der er isoleret fra resten, og forbinde dem. I vores form, for eksempel helixer 0-9 udgør en isoleret del. Helix 9 skal forbindes til helix 12 (bemærk, at spiraler 9 og 10 ikke støder i form [toppanelet], så de ikke kan tilsluttes).
9. Zoom ind på strengene, der skal tilsluttes, og ved hjælp af "Select" værktøj klikke på ethvert punkt på enaf strengene. Ved at klikke på ethvert punkt langs en blå stillads fragment, forekomme 'bro' ikoner mellem spiraler, der betegner de positioner, hvor delefiltre er tilladt. I disse positioner står baser i tilstødende helices hinanden direkte, så strengene at krydse over fra helix til helix uden at deformere eller vridning DNA'et. Tallet vises ved siden af hver bro ikon angiver antallet af helix det vil crossover til (Figur 8).
10. Hvis du vil oprette crossovers, venstre klik broen ikon valg. Et stillads crossover vil blive genereret, hvilket stilladset krydser på dette punkt fra helix til helix (figur 9). Gentag denne proces, indtil stilladset gennemløber alle helixer og skaber et lukket kredsløb, der spænder over hele figuren, efterlader ingen regioner, der er isoleret fra resten af ​​formen.
    Bemærk, at mens delefiltre synes at spænde en afstand i softwaren, i virkeligheden de ikke indeholder nogen DNA base. Fysisk, crossover"Bro" kun indeholder én fosfat enhed af DNA rygrad, der forbinder de to baser fra de tilstødende helices sammen.
11. Før vi går videre til næste trin, skal du sørge for hele stilladset er kontinuerlig, og ingen del af det er isoleret fra de andre.

3.. Definer åbningsmekanisme Axes

Den beskrevne robotten åbner som reaktion på en defineret biologisk input til eksponere sin nyttelast. Åbningen finder sted i en shell-lignende måde, med to halvdele (helixer 0-29 udgør halvdelen, helices 30-61 udgør den anden halvdel) kredser omkring to akser. Akserne er dannet af crossovers mellem spiraler 29-30 og 61-0, som er de eneste crossovers mellem disse halvdele og er placeret kun i eller tæt på den venstre kant af nettet. Den højre kant vil indeholde gate strenge (beskrevet nedenfor).

1. Slet den eksisterende crossover mellem skruelinier 29-30. For at slette crossover, klik på "knæ" point i begge streng.Dette efterlader et nick i begge strenge, hvor crossover plejede at være. Til søm de nicks, SHIFT trykke på og klikke på hver nick.
2. Opret en ny crossover mellem helixerne 29-30 så tæt som muligt på den venstre kant af nettet (Figur 10).
3. Opret en ny crossover mellem spiraler 61 og 0 så tæt som muligt på den venstre kant af nettet.

4.. Definer Payload Attachment Sites

Efter at vi er færdig plotte stilladset strand stien, er vi nødt til at definere nyttelasten vedhæftede (lastning) sites. Lastning sites er i virkeligheden korte tråde, som strækker sig ud af deres spiraler som enkelte strandede "grene". Det er derfor vigtigt at definere meget præcist, hvor langs helix denne forgrening sker, for at sikre det strækker sig til den ønskede retning. Hvis vi definerer korte forlængelser vilkårligt kan lastning sites forekomme på den udvendige side af robotten stedet for den interne side.

To Sørg et dagligt syn strækker sig til en bestemt retning, vi plotte en ekstra helix, der tjener som retningslinjer for den retningsbestemte forgrening af korte fra hoveddelen. Efter forlængelse af den ønskede belastning webstedet korte, er guide helix fjernet.

1. Lad os definere 4 lastning sites vender ud mod indersiden af ​​robotten. De lastning sites vil forgrene ud af spiraler 3, 27, 34 og 58.. For hvert site, klik i det øverste panel helix umiddelbart støder op til disse helices, der vender den interne side (figur 11). Dette vil tilføje helixerne til gitteret i det nederste panel. Må ikke andet på disse helixerne endnu.

5.. Tilføj og rediger Staples

1. Klik på "AutoStaple". Softwaren vil automatisk tilføje korte sekvenser i forskellige farver (figur 12). Bemærk, at hæfteklammer er blevet tilføjet til 3D form i højre panel. Staple farver er konsekvent i de nederste og højre paneler. Endvidepå, at der er en indikator på den nederste venstre hjørne af grænsefladen, hvilket indikerer en hæfteklamme.
   Bemærk: hæfteklammer kan ikke være for lang, for kort eller cirkulær. De fleste af de hæfteklammer genereret her ikke opfylder disse kriterier, og har skal redigeres. Det første skridt i at redigere dem er automatisk (se næste trin).
2. Klik på "autobreak". En dialogboks vil åbne (Figur 13), beder om brugerdefinerede parametre for denne handling:
   1. Target længde (bp): forventede længde af korte om muligt
   2. Min længde (bp): minimal tilladte længde for et dagligt syn
   3. Max længde (bp): maksimal tilladte længde for et dagligt syn
   4. MIN dist til Xover (bp): det minimale antal basepar et dagligt syn kan krydse mellem sine kant og en crossover eller mellem to delefiltre.
      Brug standard parametre, skal du klikke på OK. Softwaren vil bryde hæfteklammer i disse parametre til den bedste evne (figur 14).
3. Slet alle korte crossovers mellem spiraler 29-30 og 61-0, så disse helixerne at adskille og gøre det muligt for robotten at åbne. Sletning korte crossovers vil kræve nogle manuel redigering til rette hæfteklammer, der bliver for kort eller irrationelle som et resultat af denne handling. For at gøre dette ordentligt, skal du følge instruktionerne i de følgende afsnit.
   Sørg for at forlade stilladset crossovers oprettet i afsnit 3.2 og 3.3 intakt.
4. Betragt for eksempel den første korte crossover (cyan og sort hæfteklammer) fra venstre mellem helixer 29 og 30 (fig. 15). Slet begge broer af denne crossover ved at klikke på hvert knæ point eller bro, så det ser rødt, og derefter trykke DELETE (Figur 16).
5. Seam de to hæfteklammer på helix 29 ved at trykke på SKIFT og klikke på nick mellem dem. Tilsvarende søm de tre hæfteklammer på streng 30 til en enkelt hæfteklamme (fig. 17). Staples kanmanuelt forlænget eller forkortet, ved at klikke en kant og trække det som ønsket. Passe på ikke at cirkularisere nogen korte. Figur 18 viser forskellen mellem helixerne 29-30 efter fuldstændig redigering af korte delefiltre. Gentag denne proces for helixerne 0 og 61, og manuelt redigere alle hæfteklammer i hver helix.
6. Find hæfteklammer, der er tegnet af en tyk linje, hvilket betyder at de kræver yderligere redigering. Undersøg hver enkelt og korrigere om nødvendigt. For eksempel kan hæfteklammer, der er for korte slettes (figur 19) eller forlænges, hvis det er muligt.

6.. Opret Loading Sites og Gates

1. Second-klik på lastning webstedet helixerne i det øverste panel, og udvide de resulterende stillads streng fragmenter i det nederste panel ved at klikke på en kant og trække det som ønsket (Figur 20).
2. Manuelt tilføje hæfteklammer til disse stillads fragmenter ved at placere den orange lodrette bjælke på den ønskede position langs tHan stillads, går over de vejledende helices i venstre panel, holder SHIFT og klikke. Dette vil tilføje en hæfteklamme forstadium på hver helix (figur 21).
3. Udvid korte forstadier til fuld længde samt ved at klikke og trække.
4. Find de røde bro ikoner, der angiver tilladte crossover positioner mellem vejledning streng (for eksempel helix 62) og chassiset (f.eks helix 3).
5. Vælg den mest bekvemme beliggenhed til at indføre en crossover, og klik på broen ikonet (Figur 22). En bekvem beliggenhed kræver minimal redigering af eksisterende hæfteklammer i chassiset.
6. I guiden helix (helix 62), slet korte del, der ikke er en del af lastning site, og forkorte den deltagende del til den ønskede længde. Den ønskede længde bør give både specificitet for ilægning af forskellige typer gods, og bindende styrke. Typisk skal en 18-mer hale være fint. Sørg for korte forbliver DRAwn af en tynd linje, ellers redigere det, indtil det er.
7. I kabinettet, redigere de ændrede hæfteklammer som nødvendigt.
8. Slet vejledning (helix 62) så kun den korte forlængelse.
9. Gentag trin 6,4-6,8 til alle læsse websteder (Figur 23).

7.. Design Gate Strands

Porten tråde er de eneste dele, undtagen for akserne, der forbinder helices 29-30 og 61-0. I modsætning til akserne, er porten tråde ikke crossovers. Snarere, de hybridiserer til dannelse af et dobbeltstrenget segment, der tjener som sensor for biologiske input valg. Når porten dobbelthuse forskydes, kan hele robot entropically centreret omkring akserne og åbne.

1. Find de rigtige positioner for gate tråde. Disse vil blive hæfteklammer på spiraler 29, 30, 61, og 0.
2. For eksempel undersøger 29-30 gate-regionen. Der er praktisk korte tråde flankerende helixerne 29 og 30 omhøjre side af nettet, som kan bruges som gate tråde. Bemærk, at de står over for modsatte retninger.
3. Klik på kanten af ​​en af ​​de potentielle gate tråde at udvide det uden for figuren. Hvis kanten ligger over en stillads crossover, kunne sin udvælgelse forenkles ved at sørge for kun "Stap" (les) kan vælges ved at klikke off "SCAF" (fold) i "Valgbar" værktøjslinjen i øverste højre side af interfacet .
4. Udvid begge hæfteklammer at danne gate tråde. Rediger hæfteklammer hvis denne forlængelse kræver det (fig. 24). Gentag dette for porten dele af helixerne 0 og 61.
   Bemærk, at for nu, er den faktiske længde ligegyldigt, da sensoren dna (f.eks aptamer), vil erstatte de gate streng sekvenser på sekvensen afslutning skridt.

8.. Vælg Scaffold Sequence

1. Klik på "Seq" værktøj. Placer markøren et vilkårligt sted på skafottet strand og klikke. En dialogboks vil åbne beder os om atvælge stilladset DNA kilde (Figur 25).
2. Valg af kilden DNA høj grad afhænger af robotten størrelse. For eksempel, som M13mp18 ssDNA (p7249) og dens udvidede derivater (p7308 etc.) har generelt været valg til store DNA-origami figurer, passer, når stilladset aktionsdel er ~ 7 kb lang. Hvis stilladset af det designede form er betydeligt kortere end den valgte kilde, vil den overskydende stillads streng, der ikke hybridiserede til nogen hæfte skabe en løkke af ssDNA rager ud fra den foldede form. Mens dette udgør som regel lille problem i relativt korte sløjfer, kan multi-kb lange sløjfer drastisk interferere med foldning og funktion af robotten. Derfor er det vigtigt at passe den valgte kilde til formen stillads længde.

For eksempel nødvendigt, hvis stilladset streng at folde en lille form er ~ 1.600 baser lang, hvilket er betydeligt kortere end de forudindstillede kilder i dialogboksen en brugerdefineret sekvens kanbruges som stillads. Adskillige kilder kan overvejes. For eksempel kan M13mp18 kan fordøjes med en særlig restriktion enzym, som producerer et fragment af den ønskede længde. Design en sådan kilde kan gøres på NebCutter ( http://tools.neb.com/NEBcutter2/ ) ved at indsætte M13mp18 sekvensen i NebCutter input vinduet, og kortlægning restriktionssteder. En anden mulighed er at bruge pre-fordøjet ssDNA, såsom phiX174 virion ssDNA HaeIII digest, tilgængelig fra New England Biolabs.

3. I dialogboksen, klik på "M13mp18". Bemærk, at den valgte DNA-sekvens er blevet tilføjet til stilladset og korte strenge i det nederste panel.

9.. Export Staple Sequence som et regneark

1. Klik på "Eksporter" på den øverste værktøjslinje, og vælg en destination filnavn til korte liste. Klik på "Gem".
2. Find destinationen. Csv-fil og åbne den.
3. Regnearket viser den korte liste, der kan sendes som er et DNA-syntese selskab. De første to kolonner viser start og slut koordinater, idet antallet udenfor parentes betegner helix og antallet indeni parenteser betegner baseposition.

10.. Tildel Gate og Loading sekvenser

1. På korte liste, vil du bemærke, at nogle sekvenser begynde eller slutte med en perlerække af spørgsmålstegn "???". Disse spørgsmålstegn betegne, at eftersom der ikke stillads streng hybridiserer med disse specifikke korte regioner, kan de ikke få tildelt komplementære sekvenser. Disse er i virkeligheden de udvidelser, vi designet til gate tråde og lastning sites, og derfor er disse skal tildeles manuelt nu. Gate:
   1. Lågerne bestemme arten af ​​den biologiske input hvorpå robotten skifter fra inaktiv til aktiv tilstand og eksponere dens nyttelast. Hver enkelt dsDNA gate kan indkode svar på en biologisk indgang (eller flere), så en profil input kræves for robot aktivering kan defineres.
      Lad os antage, for dette eksempel, at den biologiske cue udløser robot aktivering er et restriktionsenzym, hvilket kunne indikere tilstedeværelsen af ​​smitsomme bakterier.
   2. Først overveje at porten ssDNA tråde ikke hybridiserer umiddelbart efter forgrener sig ud af deres spiraler. Design porten ellers kunne hindre hybridisering under foldning. Derfor bør hver gren begynde med en spacer streng. Vi bruger typisk poly-T som spacer strenge, da denne sekvens giver fleksibilitet.
   3. Vi antager også, at længden af ​​porten hybridisering regionen er 20 baser, indeholdende mål begrænsning siddee i sin midten.
   4. Derfor porten kan se sådan ud:
      [Helix 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTxxxxxxGCTAGAG-3 '
      [Helix 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAxxxxxxCGATCTC-5 '
      Den "....." betegne den korte region, der hybridiserer med stilladset streng, det har derfor en sekvens allerede og bør ikke ændres.
      Den tilfældige duplex "GTGAGTT" og dens komplement sikrer begrænsningen site er ikke delvist åben, og giver nogle ekstra baser til at sikre en effektiv fordøjelse af enzymet.
      "X" angiver restriktionssite.
      Den tilfældige duplex "GCTAGAG" og dens komplement give nogle ekstra baser til enzymet til at arbejde effektivt, men gør også sikker porten streng er tilstrækkelig lang til at sikre en god robot lukning.
      Før du vælger en begrænsning websted som et mål, at sikre, at hele robot struktur, lastning sites og andre dele af porten ikke selv fordøjes afenzym valg. I denne undersøgelse. Den NEBCutter 0-cutter listen (enzymer, der ikke skære hele sekvensen) fremhævede EagI, isoleret fra Enterobacter Pantoea agglomerans, som en potentiel enzym, der kunne indikere tilstedeværelsen af ​​en enterobakterielle smitsom
   5. Porten ser nu sådan ud (gul mærker Eagl restriktion websted):
      [Helix 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTCGGCCGGCTAGAG-3 '
      [Helix 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAGCCGGCCGATCTC-5 '
      Bemærk, at denne konstruktion forudsætter, at efter fordøjelsen, rækkefølgen "GTGAGTTCGG" (T _m = 32 ° C) ikke er tilstrækkeligt lang eller termodynamisk stabil til at holde robotten lukket længere. Denne antagelse vil sandsynligvis skal efterprøves eksperimentelt.
   6. Den anden port kan være den samme, i hvilket tilfælde robotten vil kun reagere på ét enzym, eller kan være udformet med et andet sted, øge specificitet robot. Flere restriktionssteder kan tilføjes på samme streng, i krølning kompleksitet og specificitet af robotten.
2. Henter brancher:
   1. Lastestedet kan være en universel sekvens. Alternativt kan loading sites være baseret på unikke sekvenser, som vil falde modularitet, men forbedre kontrollen med fragt orientering og nøgletal (for forskellige typer af gods).
   2. Endelig bør lastestedet oligonukleotider omfatte en kemisk funktionel gruppe sætter dem i stand til at konjugere med enhver nyttelast: protein, nanopartikel, osv. Sørg den kemiske gruppe er monteret på den korrekte ende (5 'eller 3'), ifølge den korte retning .

11.. Simuler Resultater i Cando

1. Når jobbet er gemt som en. JSON-fil, kan det blive uploadet til Cando til analyse. Cando er en finite-element baseret simulation af DNA struktur, der kan anslå dens stivhed og stabilitet i opløsning ^21..
2. Gå tilami.org / "target =" _blank "> http://cando-dna-origami.org/
3. Klik på "Indsend et caDNAno fil til analyse" og udfylde alle de nødvendige oplysninger.
4. Analyse i Cando tager normalt op til 15-20 min. I slutningen, lader en e-mail os vide analysen er færdig, giver et link til download af simulationen resultater (figur 26).

12.. Bestil DNA og Fold Robot

Når designprocessen er komplet og Cando analyse viser tilfredsstillende forudsigelse af produktet, korte streng liste genereret i afsnit 9-10 kan bestilles. Typisk, behøver korte tråde ikke kræver særlig rensning, men anbefales det særlige formål tråde såsom porte eller lastning sites renses ved HPLC.

Trinnene følgende DNA rækkefølge, nemlig foldning, oprensning og evaluering af produktet, herunder visualisering af den foldede struktur af enten atomic forcemikroskopi (AFM) eller transmission elektronmikroskopi (TEM), er ikke omfattet af dette papir, og kan findes i tidligere rapporter ^17,18,20,21. Et TEM billede af robotten udformet her er fremsat som et eksempel (Figur 27). Prøveforberedelse og farvning blev udført præcis som beskrevet andetsteds ^21..

Representative Results

Tal 1-25 er screenshots af caDNAno 2.0 interface viser designprocessen trin-for-trin. Tværsnittet af formen blev første gang beskrevet (figur 3), efterfulgt af automatisk tilsætning af stillads streng fragmenter og færdiggørelse af hele stilladset sti (figur 7). Staple tråde tilføjes automatisk (Figur 12), fordelt efter brugerdefinerede parametre (figur 14), og manuelt redigeret for at tilpasse hæfteklammer til den ønskede funktion på enheden (figur 15-18). Figures 23-24 beskriver, hvordan lastning websted og gate tråde tilføjes og redigeres. Endelig Figur 27 viser et TEM billede af modellen udformet her.

"/>
Figur 1.. En 3D-model af det færdige robot, designet af caDNAno 2.0 og genereret af Autodesk Maya 2012.

Figur 2.. En udsigt over caDNAno 2.0/Autodesk Maya 2012 Design interface. Topplade: gitter panel for at skitsere den indledende form. Bundplade: redigering panel. Højre panel:. 3D-model generator (se afsnit 2.1) Klik her for at se større figur .

Figur 3.. Tegning den del af formen på den øverste panel (se afsnit 2.3).

Figur 4.. Den nederste (redigering) panel af caDNAno 2,0. Den orange lodrette linje afgør, hvor langs grid redigeringsfunktioner vil forekomme. De grå pile på øverste højre hjørne bruges til at udvide nettet til begge sider (se afsnit 2.4).

Figur 5.. Et udkast af stilladset streng efter den indledende skitse i det øverste panel (se afsnit 2.5). Klik her for at se større figur .

ogether.within-page = "altid">
Figur 6.. Hvis alle stillads streng sti kanter og forlængelse af stien til den ønskede længde (se punkt 2.7).

Figur 7.. Et overblik over de nederste og højre paneler demonstrerer, hvordan 3D-modellen ændringer i realtid sammen med redigering handlinger. Klik her for at se større figur .

8/50268fig8highres.jpg "/>
Figur 8.. De blå bro ikoner mellem spiraler betegne de positioner, hvor stillads crossovers er tilladt (røde ikoner refererer til korte crossovers og endnu ikke vist, se afsnit 2.9).

Figur 9.. Opretter ny stillads overgange ved at klikke på bro ikoner af valg (se afsnit 2.10).

Figur 10.. Oprettelse af en akse (et crossover en tæt som muligt på den venstre side af nettet) mellem helixerne 29 og 30 (se afsnit 3.2).

Figur 11.. Tilføjelse helices der styrer forgrening af lastning sites (se afsnit 4.1).

Figur 12.. Den plan efter "AutoStaple" handling. De korte farver i det nederste panel, og i højre panel er i overensstemmelse (se afsnit 5.1). Klik her for at se større figur .

Figur 13.. Den "autobreak" dialogboks, hvor Brugeren kan definere autobreak parametre (se afsnit 5.2).

Figur 14.. Den plan efter "autobreak" handling (se afsnit 5.2). Klik her for at se større figur .

Figur 15 Manuel redigering af hæfteklammer I:. Lokalisere hæfteklammer, der krydser over fra helix 29 og 30, og bør slettes.

5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50268/50268fig16highres.jpg "/>
Figur 16 Manuel redigering af hæfteklammer II:. Slette bro mellem placeret hæfteklammer.

Figur 17 Manuel redigering af hæfteklammer III:. Falsning de nicks langs fragmenterede hæfteklammer (se afsnit 5.5).

Figur 18. Hele kløft mellem helixerne 29-30 viser ingen delefiltre forbinde de to (se afsnit 5.5). Klik her for at se større figur .

= "Jove_content" fo: keep-together.within-page = "altid">
Figur 19. Manuel redigering af hæfteklammer trukket i tyk linje (betegner de enten for kort, for lang eller cirkulære, se afsnit 5.6).

Figur 20.. Tilføjelse guide helices til lastning hjemmeside forgrening (se afsnit 6.1). Klik her for at se større figur .

1highres.jpg "/>
Figur 21. Manuel tilsætning af korte tråde til guiden helixerne, så forgreningspunkterne kan placeres (se afsnit 6.2). Klik her for at se større figur .

Figur 22.. Indførelse af en belastning websted crossover til robotten chassis stillads i en bekvem beliggenhed (en, der kræver minimal redigering af chassis hæfteklammer, se afsnit 6.5).

Figur 23. Se de lastning webstedet hæfteklammer som ses i the nederste panel efter fjernelse vejledning helixerne, som ikke længere er nødvendigt (se afsnit 6.9).

Figur 24. Udvidelse to hæfteklammer, som vil blive brugt som gate tråde, fra helixerne 29 og 30. Bemærk, at de to strenge ansigt modsatte retninger, som er obligatorisk for dannelsen af porten duplex (se afsnit 7.4). Klik her for at se større figur .

Figur 25. Stilladset sekvens tilføjelse ("Seq" værktøj) dialogkasse, gør det muligt at vælge den ene af foruddefinerede stilladser eller at indsætte en brugerdefineret sekvens (se afsnit 8.1).

Figur 26. Resultater af Cando analyse af designet beskrevet her. Simuleringen genererer en. Zip-arkiv, der indeholder de forskellige filer, der giver de ønskede oplysninger. Her RMSF (root mean square udsving)-filer (. Png) er afbildet, viser en model af designet fra 3 synsvinkler, farvet efter den fordelingsnøgle, beskrevet i den medfølgende fil med navnet "HeatMap4RMSF.txt". I dette tilfælde er minimum RMSF (bluest) 1.03 nm, og 95% RMSF (redest) er 3.19 nm. Gradient farve hele modellen stammer fra polariteten af ​​robotten (porte i "front", akse i præcis «) og den kendsgerning, at der ikke forbinder hæfteklammer langs helixer 29-30 og 61-0, forårsager" forsiden "side til at svinge mere end det 'tilbage'side.

Figur 27. TEM billede af robotten er designet i denne artikel. Prøveforberedelse og farvning blev udført præcis som beskrevet andetsteds ^21..

Discussion

DNA-origami gør os til at fabrikere præcist definerede objekter med vilkårlige funktioner på nanoskala. Et vigtigt næste skridt ville være at integrere funktionen i disse mønstre. Mens mange applikationer og udfordringer kan løses med denne teknologi, der er en særlig interesse i opdigte terapeutiske og videnskabelige robotter fra DNA-origami, da disse udgør en naturlig miljø af DNA. DNA allerede grænseflader med molekylære maskineri i celler som en genetisk information lagermedium. Interessant, kan den foldede DNA i en nanorobot eller anden maskine stadig tjene som genetisk information ud over at være et byggemateriale, som kan videresendes til ekspression af et ønsket protein efter nanorobot nedbrydes, som dele af en sekvens af udgange.

I eksemplet drøftes i dette dokument, bruger vi et restriktionsenzym til at betjene robotten. Men yderligere mekanismer, som DNA-robotter kan ansvard til input omfatter følgende.

Molekylær genkendelse: vi for nylig demonstreret aptamer-baserede porte til DNA robotter, genkender proteinmolekyler på overfladen på target-cellerne ^20. Aptamerer kan vælges in vitro ved anvendelse af fremgangsmåder, såsom SELEX ^23, outsourcet fra virksomheder, eller anvendt fra aptamer databasen ( http://aptamer.icmb.utexas.edu/ ). Når aptamere anvendes, er det vigtigt at overveje, at streng komplementær til aptamer, som tilsammen danner indgangen, kan være konstrueret til at omfatte uoverensstemmelser, hvilket vil lette binding af aptamer s ligand og forskydning af den komplementære streng. Mens den mekanisme, der giver dette er ukendt, kan følsomheden og specificiteten af ​​en aptamer-baserede gate indstilles ved at øge eller mindske% af misforhold mellem de to strenge, at få enten en meget streng, men ineffektiv port, eller en hurtigmen utætte én.

Enzymatisk spaltning: for dette, bør portene være udformet sådan, at de indeholder substratet af dette enzym. For eksempel kan et lille peptid substrat af en protease opbindes fra begge sider til porten, som vil holde robotten lukket i fravær af enzymet.

Fjernbetjening: en potentiel tilgang, der ikke har været anvendt til DNA-maskiner bruger en gold nanocrystal antennen et højfrekvent elektromagnetisk felt til at fremkalde dsDNA smeltning ^24.. Dette kan give en bruger betjent switch udover bio-responderende dem. Selvom DNA-origami robotter er relativt ligetil at designe og lave, de udgør flere tekniske udfordringer som en terapeutisk platform. DNA er ikke et ideelt materiale til drug delivery, da det er meget sårbare over for spaltning med nukleaser. Endvidere kan det udløse en immunrespons. En grundig undersøgelse af adfærd DNA-origami objekter i en organisme er needed at definere deres skæbne og sørg for at de ikke samlet i væv eller integrere i værtens genom.

Sammenfattende præsenterede vi brugen af ​​caDNAno, en enkel, robust CAD-værktøj til at designe DNA-origami figurer. Vi håber at begynde at se anvendelsesorienteret forskning i DNA-origami, på områder som lægemidler, energi, metamaterialer og uddannelse. I alle disse steder, caDNAno forventes at have en betydelig indvirkning på at realisere løsninger. I fremtiden kan det blive en industriel og design standard, som kan udskiftes (eller dele heraf kan) af enhver bruger, fordi de er alle kompatible.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autodesk Maya 2012	Autodesk		A student/academic account needs to be created first (see platform-specific instructions in http://cadnano.org)
caDNAno 2.0 (software)	(Open source)		Software for the design of DNA origami structures http://cadnano.org
Cando (webpage)	(Open source)		Webpage running a simulator of DNA origami shapes http://cando-dna-origami.org