Het ontwerpen van een Bio-responsieve Robot van DNA Origami

Summary

DNA-origami is een krachtige methode voor het vervaardigen van nauwkeurige nanoschaal objecten door de zelf-assemblage van DNA-moleculen programmeren. Hier beschrijven we hoe origami DNA kan worden gebruikt om een ​​robot robot kan voelen biologische signalen en reageren door vormverandering vervolgens doorgegeven aan een gewenst effect te ontwerpen.

Abstract

Nucleïnezuren zijn verbazingwekkend veelzijdig. Naast hun natuurlijke rol als opslagmedium voor biologische informatie ^1, kunnen ze worden gebruikt in parallel computing ^2,3, herkennen en binden moleculaire of cellulaire doelwitten ^{4,5, 6,7} katalyseren chemische reacties en genereren berekend reacties in een biologisch systeem ^8,9. Belangrijk is dat nucleïnezuren worden geprogrammeerd om zichzelf assembleren tot 2D-en 3D-structuren ^10-12, waardoor de integratie van deze opmerkelijke functies in een robot die de detectie van biologische signalen om een geprogrammeerde reactie om een gewenst effect uitoefenen.

Vormen van nucleïnezuren werd eerst voorgesteld door Seeman ^13, en diverse variaties op dit thema inmiddels gerealiseerd met behulp van diverse technieken ^11,12,14,15. Echter, het belangrijkste is misschien wel de door Rothemund voorgesteld een, genaamd de steigers DNA-origami16. In deze techniek wordt het vouwen van lange (> 7000 basen) enkelstrengs DNA "scaffold" betrekking op een gewenste vorm door honderden korte complementaire strengen zogenaamde "nietjes". Vouwen wordt uitgevoerd door de temperatuur gloeien helling. Deze techniek werd succesvol gedemonstreerd in de creatie van een uiteenlopende reeks van 2D-vormen met opmerkelijke precisie en robuustheid. DNA-origami werd later uitgebreid naar 3D en ^17,18.

De huidige papieren zal zich richten op de caDNAno 2.0 software ¹⁹ ontwikkeld door Douglas en collega's. caDNAno is een robuuste, gebruiksvriendelijke CAD-tool waarmee het ontwerpen van 2D-en 3D-DNA origami vormen met veelzijdige functies. Het ontwerpproces is gebaseerd op een systematische en nauwkeurige abstractie regeling voor DNA-structuren, waardoor het relatief eenvoudig en efficiënt.

In dit document het ontwerp van een DNA origami na laten wenorobot die onlangs beschreven ^20. Deze robot is 'robot' in de zin dat het Verwijzingen sensing te bedienen, om een ​​taak uit te voeren. Uitgelegd hoe verschillende sensing systemen kunnen worden geïntegreerd in de structuur, en hoe dit kan worden doorgegeven aan een gewenst effect. Tenslotte gebruiken we Cando ²¹ te simuleren de mechanische eigenschappen van de ontworpen vorm. Het concept we bespreken kunnen worden aangepast aan meerdere taken en instellingen.

Protocol

De robot ontwerpen we in dit document wordt aan een eiwit P door een vracht C zich kan binden aan receptoren op het oppervlak van een doelcel gekozen. De robot wordt getoond in figuur 1 C kan receptor-blokker zijn,. Een groeifactor etc., en een manier om het chemisch koppelen aan een DNA oligonucleotide moet beschikbaar die functionaliteit niet vernietigen. De robot heeft twee staten. Wanneer inactief, DNA-poorten op de twee externe 'lippen' gehybridiseerd zijn, zorg ervoor dat de robot blijft gesloten, zodanig dat elke lading geladen binnen deze goed is afgezonderd. In de aanwezigheid van eiwitten P, de poorten open op een van verscheidene mechanismen (hieronder besproken) waardoor de robot om de lading te openen en bloot. Bij het ontwerpen van de structuur, van mening dat de robot moet flexibel genoeg zijn om te sluiten op zichzelf in de gesloten toestand, en in het voorjaar naar de open toestand toen de poorten staat te stellen dit te doen. Modelleren het gedrag van DNA structuur integreren thermodynamische en mechanische componenten is moeilijk, en de werkelijke object zou kunnen vereisen een aantal iteratieve verbetering. Niettemin, hier richten we ons op het ontwerpproces met behulp van een algemeen werkend model, dat kan worden voortgebouwd.

Nota

Voor een beter begrip van het proces van DNA-origami design en vouwen, we raden het lezen van de oorspronkelijke caDNAno papier door Douglas en collega's ^19, die de abstracte voorstelling van DNA in de ontwerp-interface en hoe deze betrekking heeft op de werkelijke moleculaire structuur van een verklaart 3D DNA vorm. Dit document gaat vergezeld van twee video-tutorials beschrijven de caDNAno vertegenwoordiging en de interface op een zeer duidelijke manier. Daarnaast raden wij het ​​lezen van de meer recente paper van Dietz en collega's beschrijven vele belangrijke aspecten en gedetailleerde protocollen van het vouwen proces, met inbegrip van de Cando analyse-instrument ^21.

tle "> 1. Downloaden en installeren caDNAno 2.0 en Autodesk Maya 2012

Opmerking: Autodesk software is gratis voor studenten en academisch gebruik. De onderstaande instructies omvatten het opzetten van een academische account bij Autodesk.

1. Maak een academische account op http://students.autodesk.com/ . Na ontvangst van de rekening setup e-mail, klik op de activatie link en in uw voorkeuren invullen zoals gewenst.
2. Download de gratis versie van Maya 2012 van het download center.
3. Installeer Maya 2012 op uw computer.
4. Run Maya keer voordat u caDNAno 2.0.
5. Download en installeer de nieuwste versie van caDNAno 2.0 van http://cadnano.org/ .
6. Run Maya 2012. Een caDNAno icoon moet verschijnen op de rechterbovenhoek van de grafische gebruikersinterface. Klik op het pictogram om te gaan in caDNAno.

2. Outline de gewenste vorm en Steiger Strand Pad

1. Het ontwerp-interface van caDNAno binnen Maya bevat 3 panelen (Figuur 2):
   1. Bovenpaneel: rooster uitzicht, waar de vorm in eerste instantie wordt geschetst. Dit paneel maakt dubbele helix-niveau acties en biedt een doorsnede van de vorm.
   2. Bodempaneel: editing paneel, waardoor enkele base-level acties.
   3. Rechter paneel: een Maya-gegenereerde real time 3D-model van de vorm
2. Klik op de "Honeycomb" icoon. Inzoomen op en uit het rooster in het bovenste paneel kan gedaan worden door de muis omhoog en omlaag, respectievelijk.
   caDNAno kunnen twee mogelijke uitvoering roosters, honingraat plein, in dit document zullen we de honingraat layout, hoewel het algemeen vierkant rooster kan ook worden gebruikt ^22.
3. Begin met het tekenen van het deel van de gewenste vorm op het linker paneel.
   Elke cirkel staat voor een dubbele DNA-helix. Om choose de helices die de vorm te bouwen, gewoon links-klik op hun centrum (Figuur 3). Blijven helix door helix totdat de hele vorm wordt geschetst. Als alternatief kan de vorm worden getrokken door op de linker muisknop en voortdurend tekenen van schets van de vorm. Elke actie kan ongedaan gemaakt worden door te klikken op het menu Bewerken en "Undo", of door de sneltoets CTRL + Z (PC) of CMD + Z (Mac).
   Op dit punt, zal de geselecteerde helices geel lijken. Tegelijkertijd zal het bodempaneel een zijaanzicht van de vorm uit deze helices geven. De helix nummering in het onderste paneel in overeenstemming met de nummering in de bovenste.
4. Observeer het onderste paneel. Elke helix wordt vertegenwoordigd door twee reeksen van velden: de rijen zijn de twee strengen van de dubbele helix, waarbij elke vierkante die een base (figuur 4).
   De oranje verticale balk bepaalt waar bewerkingsacties plaatsvinden langs een helix. De basispositie langs het raster weergegeven alseen getal boven de oranje balk. Standaardlengte van de helix raamwerk is 42 basen. De lengte kan worden uitgebreid door te klikken op een van de grijze pijl pictogrammen in de rechterbovenhoek van het paneel te bewerken en het kiezen van de lengte extensie (in veelvouden van 21, die overeenkomen met twee volledige slagen van de DNA-helix, waarbij een beurt overspant 10.5 basen) (Figuur 4). Het rooster wordt uitgebreid tot de richting van de pijl gekozen.
5. Om de werkelijke schavot streng pad gehele vorm plotten, drukt u op de muisknop, starten vanaf de eerste helix en gaan continu over alle helices volgens dezelfde volgorde waarin ze werden aanvankelijk in paragraaf 2.3 gekozen. Merk op dat:
   1. De helixen geselecteerde ditmaal zal van kleur veranderen naar oranje.
   2. In het onderste paneel, zal steiger streng fragmenten automatisch worden opgesteld op het geselecteerde helices.
   3. In het rechterdeel worden de 3D-model van de vorm wordt gebouwd in real time te tonen. Aan het einde van dezeproces, een ontwerp van de steiger streng pad wordt automatisch getekend in het onderste paneel (figuur 5).
6. Teken een rechthoek om alle meest linkse randen van de steiger weg. Merk op dat zo gekozen randen rood (figuur 6) verschijnt.
7. Verleng de steiger weg door de geselecteerde randen slepen als groep aan de linkerzijde van het raster. Herhaal dit proces voor de juiste hoeken totdat het pad goed is verlengd. Merk op dat de steiger extensie verlengt ook de 3D-vorm in het rechter paneel (figuur 7).
8. Zoek de steiger weg onderdelen die los staan ​​van de rest, en sluit ze. In onze vorm bijvoorbeeld helices 0-9 vormen een geïsoleerd deel. Helix 9 moet worden aangesloten op helix 12 (merk op dat helices 9 en 10 zijn niet aangrenzend in de vorm [bovenpaneel] zodat ze niet kunnen worden aangesloten).
9. Zoom in op de draden aan te sluiten, en met behulp van de functie "Select" op een willekeurig punt op eenvan de strengen. Na het klikken op een punt langs een blauw schavot fragment, 'bridge' iconen verschijnen tussen helices, aanduiding van de posities waar crossovers zijn toegestaan. In deze posities, bases in aangrenzende helices tegenover elkaar direct, waardoor de strengen om over te steken van helix naar helix zonder te vervormen of verdraaien van de DNA. Het nummer naast elke brug pictogram geeft het aantal helix zal het viaduct aan (figuur 8).
10. Om viaducten maken, klik links de brug icoon van keuze. Een steiger crossover gegenereerd, waardoor de steiger kruist op dit punt van helix naar helix (Figuur 9). Herhaal dit proces tot het schavot doorkruist alle helices en creëert een gesloten lus die de hele vorm omspant, waardoor er geen gebieden die geïsoleerd zijn van de rest van de vorm.
    Merk op dat hoewel crossovers blijken een afstand in de software omvatten, in werkelijkheid bevatten geen DNA base. Fysiek, de crossover"Bridge" bevat een fosfaat eenheid van DNA backbone dat de twee bases van de naburige schroefgangen elkaar verbindt.
11. Voordat we naar de volgende stap, zorg ervoor dat het hele steiger is continu, en geen enkel deel van het is geïsoleerd van de anderen.

3. Definieer openingsmechanisme Assen

De beschreven robot opent in reactie op een gedefinieerde biologische ingang tot de lading bloot. Opening vindt plaats in een shell-achtige manier, met twee helften (helices 0-29 vormen een halve, helices 30-61 uitmaken van de tweede helft) draait om twee assen. De assen worden gevormd door cross-overs tussen helices 29-30 en 61-0, die de enige crossovers tussen de helften en alleen in of nabij gepositioneerd aan de linkerzijde van het raster. De rechterrand zal de poort strengen (hieronder besproken) bevatten.

1. Wis de bestaande crossover tussen helices 29-30. Om de crossover te wissen, klikt u op de "knie" punt in beide strengen.Dit laat een inkeping in beide strengen, waar de crossover gebruikt te worden. Tot naad de nicks, drukt u SHIFT ingedrukt en klikt u op elke nick.
2. Een nieuwe crossover tussen helices 29-30 zo dicht mogelijk links van het raster (fig. 10).
3. Maak een nieuwe crossover tussen helices 61 en 0 zo dicht mogelijk bij de linkerrand van het raster.

4. Definieer Payload Attachment Sites

Nadat we klaar plotten het schavot streng pad, moeten we de lading beslag (laden) locaties te definiëren. Laden sites zijn in feite nietje strengen die zich uitstrekken van hun helices als enkelstrengs 'takken'. Het is daarom belangrijk om heel precies te bepalen waar langs de helix deze vertakking doet om ervoor te zorgen dat het zich uitstrekt tot de gewenste richting. Als we nietje extensies willekeurig te definiëren, kunnen laden plaatsen voordoen op de externe kant van de robot in plaats van de binnenkant.

To zorg ervoor dat een nietje uitstrekt tot een specifieke richting alleen, plotten we een extra helix, die als leidraad voor de directionele vertakking van de nietjes van het belangrijkste lichaam dient. Na de uitbreiding van de gewenste laadplaats nieten, wordt de gids helix verwijderd.

1. Laat ons 4 laden websites gericht naar de interne kant van de robot te definiëren. Het laden sites zal uit tak van schroeflijnen 3, 27, 34, en 58. Voor elke site, in het bovenste paneel op de helix direct grenzend aan deze helices dat de interne kant (figuur 11) wordt geconfronteerd. Dit zal de helices toevoegen aan het raster in het onderste paneel. Geen tweede-click nog deze helices.

5. Toevoegen en bewerken Staples

1. Klik op "AutoStaple". De software zal automatisch nieten sequenties in diverse kleuren (figuur 12) toe te voegen. Merk op dat nietjes zijn toegevoegd aan de 3D-vorm in het rechter paneel. Nietje kleuren consistent zijn voor de bodem en rechts panelen. In additiop, is er een indicator op de linkerbenedenhoek van de interface, die een nietje aangeeft.
   Opmerking: nietjes kan niet te lang, te kort of cirkelvormig. De meeste van de nietjes gegenereerde hier niet aan deze criteria voldoen, en moeten worden bewerkt. De eerste stap in het bewerken van hen is automatisch (zie volgende stap).
2. Klik op "autobreak". Er wordt een dialoogvenster geopend (figuur 13), vragen om door de gebruiker gedefinieerde parameters voor deze actie:
   1. Doellengte (bp): verwachte lengte van stapelvezels indien mogelijk
   2. Min. lengte (bp): minimaal toegestane lengte voor een nietje
   3. Max length (bp): maximaal toegestane lengte voor een nietje
   4. Min afstand tot Xover (bp): het minimale aantal basenparen een nietje kan doorkruisen tussen de rand en een crossover of tussen twee viaducten.
      Gebruik de standaard parameters, klikt u op OK. De software zal de nietjes te breken op basis van deze parameters om de beste van haar vermogen (Figuur 14).
3. Wis alle nietje crossovers tussen helices 29-30 en 61-0, in staat te stellen deze helices te scheiden en kan de robot te openen. Wissen nietje crossovers zal enige handmatige bewerking om de juiste nietjes die te kort of irrationeel als gevolg van deze actie worden vereist. Om dit goed te doen, volg de instructies in de volgende secties.
   Zorg ervoor dat u het schavot crossovers gemaakt in de punten 3.2 en 3.3 intact te laten.
4. Overweeg, bijvoorbeeld, het eerste nietje crossover (cyaan en zwart nietjes) van links tussen helices 29 en 30 (figuur 15). Wissen beide bruggen van deze crossover door te klikken op elke knie punt of brug zodat het lijkt rood, dan raken DELETE (figuur 16).
5. Naad van de twee nietjes op helix 29 met SHIFT en klikken de nick tussen hen. Evenzo naad de drie nietjes op streng 30 om een nietje (figuur 17). Staples kanhandmatig worden verlengd of verkort door te klikken op een rand en sleept deze naar wens. Pas op dat u geen nieten circulariseren. Figuur 18 toont de kloof tussen de helices 29-30 na volledige bewerking van nieten crossovers. Herhaal dit proces voor helices 0 en 61, en alle nietjes in elke helix handmatig bewerken.
6. Zoek nietjes die worden getrokken door een dikke lijn, wat betekent dat ze nodig hebben verder te bewerken. Onderzoeken elk een en corrigeren als dat nodig is. Zo kunnen nietjes te korte gewist (figuur 19) of verlengd indien mogelijk.

6. Maak laden Sites en Gates

1. Tweede op de laadplaats helices in het bovenpaneel en verlengt de resulterende schavot streng fragmenten in het onderste paneel door te klikken op een rand en sleept deze naar wens (figuur 20).
2. Handmatig nietjes deze steiger fragmenten door het plaatsen van de oranje verticale balk op de gewenste positie langs tHij steiger, gaan over de gids helices op het linker paneel, SHIFT en klikken. Dit zal een nietje voorloper bij elke helix (figuur 21) toe te voegen.
3. Verleng het nietje voorlopers van volledige lengte maar ook door te klikken en te slepen.
4. Zoek de rode brug pictogrammen, duidt toegestaan ​​crossover posities tussen de gids streng (bijvoorbeeld helix 62) en het chassis (bijvoorbeeld helix 3).
5. Kies de meest geschikte locatie om een crossover te introduceren en klik op de brug icoon (figuur 22). Een gunstige locatie vereist een minimale bewerking van bestaande nietjes in het chassis.
6. In de gids helix (spiraal 62), verwijder het nietje deel dat is geen deel van de laadplaats, en verkorten van de deelnemende gedeelte op de gewenste lengte. De gewenste lengte moet bieden zowel specificiteit voor het laden van verschillende soorten lading, en bindende kracht. Normaal gesproken moet een 18-mer staart wel goed. Zorg ervoor dat het nietje blijft drawn door een dunne lijn, anderszins bewerken totdat het is.
7. In het chassis, bewerken de veranderde nietjes als nodig.
8. Wis de gids (helix 62) waardoor alleen het nietje extensie.
9. Herhaal stappen 6,4-6,8 voor loading sites (Figuur 23).

7. Ontwerpen Gate Strengen

De poort strengen zijn de enige onderdelen, behalve de assen koppelen helices 29-30 en 61-0. In tegenstelling tot de assen, de poort strengen niet crossovers. Integendeel, hybridiseren ze een dubbelstrengs segment dat als de sensor voor de biologische ingang van keuze vormen. Zodra de poort duplexen worden verplaatst, kan de hele robot entropisch draaien om de assen en open.

1. Zoek de juiste positie voor gate strengen. Deze zullen nietjes op helices 29, 30, 61 en 0.
2. Zo onderzoekt de poort regio 29-30. Er zijn handige nietje strengen flankerende helices 29 en 30 op derechterzijde van het rooster, die kan worden gebruikt als gate strengen. Merk op dat zij geconfronteerd tegengestelde richtingen.
3. Klik op de rand van een van de mogelijke poort strengen uit te breiden buiten de vorm. Als de rand ligt over een steiger crossover, kon zijn selectie worden vereenvoudigd door te zorgen dat alleen "Stap" (les) kunnen worden geselecteerd, door te klikken off "Scaf" (vouw) in de "selecteerbaar" werkbalk aan de rechter bovenkant van de interface .
4. Breiden zowel nietjes aan de poort strengen te vormen. Bewerk de nietjes als dit toestel vereist (figuur 24). Herhaal dit voor de poort strengen van helices 0 en 61.
   Merk op dat voor nu, de werkelijke lengte doet er niet toe, omdat de sensor DNA (bv. aptamer) zal de poort streng sequenties vervangen in de volgorde voltooiing stap.

8. Kies Steiger Sequence

1. Klik op de functie "Seq". Plaats de cursor ergens op het schavot streng en klik. Er wordt een dialoogvenster geopend met de vraag ons naarkiest u het schavot DNA bron (Figuur 25).
2. Het kiezen van de bron DNA sterk afhankelijk van de robot grootte. Bijvoorbeeld, M13mp18 ssDNA (p7249), en zijn uitgebreide derivaten (p7308 enz.) die zijn over het algemeen de keuze voor grote DNA-origami vormen, past bij het schavot streng is ~ 7 kb lang. Indien de steiger van de ontworpen vorm is aanzienlijk korter dan de gekozen bron, zal de overtollige steiger streng die niet wordt gehybridiseerd aan een nietje een lus van ssDNA uitsteken van de gevouwen vorm te maken. Hoewel dit vormt meestal weinig probleem voor relatief korte loops, kunnen multi-kb lange lussen drastisch verstoren vouwen en functie van de robot. Daarom is het belangrijk om de gekozen bron bij de vorm schavot lengte.

Als bijvoorbeeld de steiger streng nodig is om een ​​kleine vorm ~ 1600 basen lang, die aanzienlijk korter is dan de ingestelde bronnen in het dialoogvenster vouwen, een aangepaste sequentie kanworden gebruikt als steiger. Verschillende bronnen kunnen worden beschouwd. Bijvoorbeeld kan de M13mp18 worden gedigereerd met een restrictie-enzym dat specifiek een fragment met de gewenste lengte geproduceerd. Het ontwerpen van een dergelijke bron kan op NebCutter (gedaan worden http://tools.neb.com/NEBcutter2/ ) door het plakken van de M13mp18 volgorde in de NebCutter invoervenster, en mapping restrictie sites. Een andere optie is voorverteerd ssDNA, zoals PhiX174 virion ssDNA HaeIII digest, verkrijgbaar van New England Biolabs gebruiken.

3. In het dialoogvenster, klikt u op "M13mp18". Merk op dat de gekozen DNA-sequentie is toegevoegd aan de steiger en nieten strengen in het onderste paneel.

9. Export Staple Sequence als een spreadsheet

1. Klik op "Exporteren" in de bovenste werkbalk en kies een bestemming bestandsnaam voor het nietje lijst. Klik op "Opslaan".
2. Zoek de bestemming. CSV-bestand en open het.
3. De spreadsheet toont de stapelvezels lijst, die kan worden verzonden volgens een DNA synthese bedrijf. De eerste twee kolommen geven het begin en eind coördinaten, met het nummer buiten de haakjes duidt helix-nummer en het nummer binnen de hoeken aanduiden basispositie.

10. Toewijzen Gate en laden Sequences

1. In het nietje lijst, zult u merken dat sommige sequenties beginnen of eindigen met een koord van vraagtekens "??? '. Deze vraagtekens duiden dat aangezien er geen steiger streng hybridiseert met deze specifieke nietje regio's, kunnen ze niet worden complementaire sequenties toegewezen. Dit zijn in feite de extensies ontwierpen wij de poort strengen en losplaatsen, en daarom deze moeten nu handmatig worden toegewezen. Gate:
   1. De poorten bepalen de aard van de biologische ingang waarop de robot zal van inactieve tot actieve toestand en bloot zijn lading. Elke afzonderlijke dsDNA poort kan een biologische reactie op invoer (of meer) coderen, zodat een profiel van inputs die voor robot activering kan worden gedefinieerd.
      Laten we aannemen dat voor dit voorbeeld de biologische cue triggering robot activatie is een restrictie enzym, wat de aanwezigheid van besmettelijke bacteriën kunnen wijzen.
   2. Eerst van mening dat de poort ssDNA strengen niet onmiddellijk hybridiseren na vertakking van hun helices. Het ontwerpen van de poort anders zou hybridisatie belemmeren tijdens het vouwen. Daarom dient iedere tak beginnen met een spacer string. We gebruiken meestal poly-T als spacer strings, als deze volgorde zorgt voor flexibiliteit.
   3. We nemen ook aan dat de lengte van de poort hybridisatiegebied is 20 basen, die de doelverbinding beperking site in het midden.
   4. Dus de poort kan er zo uitzien:
      [Helix 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTxxxxxxGCTAGAG-3 '
      [Helix 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAxxxxxxCGATCTC-5 '
      De "....." geven de stapelvezels gebied dat hybridiseert met de steiger streng daarom een ​​sequentie heeft en mag niet worden gewijzigd.
      De willekeurige duplex "GTGAGTT" en zijn complement zorgt restrictieplaats is gedeeltelijk open en biedt een aantal extra bases doeltreffende digestie verzekeren door het enzym.
      De "x" geeft de restrictieplaats.
      De willekeurige duplex "GCTAGAG" en zijn complement bieden wat extra basissen voor het enzym om efficiënt te werken, maar ook zorgt ervoor dat de poort streng is voldoende lang om een ​​goede robot afsluiting zorgen.
      Voor het kiezen van een restrictie site als een doelwit, zorg ervoor dat de hele robot structuur, worden laden sites en andere deel van de poort zelf niet verteerd door deenzym keuze. In dit onderzoek, de NEBCutter 0-cutter lijst (enzymen die niet de hele reeks niet gesneden) gemarkeerd EagI, geïsoleerd van de Enterobacter Pantoea agglomerans, als een potentiële enzym dat de aanwezigheid van een besmettelijke enterobacteriële kunnen wijzen.
   5. De poort ziet er nu als volgt uit (gele markeringen EagI restrictie site):
      [Helix 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTCGGCCGGCTAGAG-3 '
      [Helix 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAGCCGGCCGATCTC-5 '
      Merk op dat dit ontwerp ervan uit dat na digestie, de sequentie "GTGAGTTCGG" _(Tm = 32 ° C) is niet voldoende lang en thermodynamisch stabiel houden de robot niet meer gesloten. Deze veronderstelling zal waarschijnlijk moeten experimenteel worden geverifieerd.
   6. De tweede poort kan dezelfde zijn in welk geval de robot zou reageren alleen op een enzym, of kunnen worden ontworpen met een andere plaats, waardoor specificiteit robot. Meer restrictieplaatsen kunnen worden toegevoegd op dezelfde streng, in vouwen de complexiteit en specificiteit van de robot.
2. Laden locaties:
   1. De laadplaats kan een universele sequentie zijn. Alternatief kan loading meetpunten basis van unieke sequenties, die modulariteit afnemen maar controle lading oriëntatie en ratio (voor verschillende soorten lading) te verbeteren.
   2. Tenslotte dienen de laadplaats oligonucleotiden een chemische functionele groep zodat ze conjugeren met eventuele lading omvatten: eiwitten, nanodeeltjes enz. Controleer de chemische groep aan het juiste uiteinde (5 'of 3') aangebracht, overeenkomstig de kram richting .

11. Simuleren Resultaten in CANDO

1. Nadat de taak is opgeslagen als een. Json-bestand, kan deze worden geüpload naar CANDO voor analyse. CANDO is een eindige-elementen gebaseerde simulatie van de DNA-structuur die de stijfheid en stabiliteit kunnen inschatten in oplossing ^21.
2. Gaan naarami.org / "target =" _blank "> http://cando-dna-origami.org/
3. Klik op "Verzend een caDNAno bestand voor analyse" en vul alle benodigde informatie.
4. Analyse in CANDO duurt meestal tot 15-20 minuten. Op het einde, een e-mail bericht laat het ons weten de analyse is voltooid, het verstrekken van een link naar de resultaten van de simulatie (figuur 26) te downloaden.

12. Om DNA en vouw de Robot

Zodra het ontwerp-proces is voltooid en CANDO analyse blijkt bevredigend voorspelling van het product, het basisvoedsel streng lijst gegenereerd in secties 9-10 kunnen worden besteld. Typisch, hebben nietje strengen geen bijzondere zuivering nodig, maar deze wordt aanbevolen speciale doeleinden strengen zoals schuiven of loading site worden gezuiverd door HPLC.

De volgende stappen DNA volgorde, namelijk vouwen, zuivering en evaluatie product, met visualisatie van de gevouwen structuur door een atomic forcemicroscopie (AFM) of transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) zijn buiten het bestek van dit document, en kan worden gevonden in eerdere verslagen ^17,18,20,21. Een TEM beeld van de robot hier bedoeld wordt gebracht als een voorbeeld (figuur 27). Voorbereiding en kleuring monster werd uitgevoerd precies zoals elders ²¹ beschreven.

Representative Results

Figuren 1-25 zijn screenshots van de caDNAno 2.0 interface toont het ontwerpproces stap-voor-stap. De doorsnede van de vorm werd eerst beschreven (figuur 3), gevolgd door automatische toevoeging van scaffold streng fragmenten en de voltooiing van de volledige steiger weg (figuur 7). Nietje strengen worden automatisch toegevoegd (Figuur 12), verdeeld volgens door de gebruiker gedefinieerde parameters (figuur 14), en handmatig bewerkt om de nietjes te passen aan de gewenste functie van de inrichting (figuren 15-18). Figuren 23-24 beschrijven hoe loading locatie en poort strengen worden toegevoegd en bewerkt. Tenslotte Figuur 27 toont een TEM-beeld van het model hier ontworpen.

"/>
Figuur 1. Een 3D-model van het afgewerkte robot, ontworpen door caDNAno 2.0 en gegenereerd door Autodesk Maya 2012.

Figuur 2. Een weergave van de caDNAno 2.0/Autodesk Maya 2012 het ontwerp-interface. Bovenpaneel: rooster paneel voor een overzicht van de oorspronkelijke vorm. Bodempaneel: editing panel. Rechter paneel:. 3D-model-generator (zie paragraaf 2.1) Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3. Het tekenen van de doorsnede van de vorm op het bovenste panel (zie paragraaf 2.3).

Figuur 4. De onderste (editing) panel van caDNAno 2.0. De oranje verticale balk bepaalt waar langs de grid bewerkingsacties zal optreden. De grijze pijlen op de rechterbovenhoek worden gebruikt om het net uit te breiden naar beide kanten (zie paragraaf 2.4).

Figuur 5. Een ontwerp van de steiger streng na de eerste schetsen in het bovenpaneel (zie paragraaf 2.5). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .

ogether.within-page = "altijd">
Figuur 6. Selecteren van alle schavot streng pad randen en het pad uit te breiden tot de gewenste lengte (zie paragraaf 2.7).

Figuur 7. Een algemeen beeld van de bodem en de juiste panelen te laten zien hoe het 3D-model veranderingen in realtime samen met het bewerken van acties. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

8/50268fig8highres.jpg "/>
Figuur 8. De blauwe brug pictogrammen tussen helices duiden de posities waar schavot viaducten zijn toegestaan ​​(rood pictogrammen verwijzen naar nieten crossovers en worden nog niet getoond, zie paragraaf 2.9).

Figuur 9. Creëren nieuwe steiger overgangen door op de brug iconen van de keuze (zie paragraaf 2.10).

Figuur 10. Maken een as (a crossover zo dicht mogelijk naar de linkerkant van het rooster) helices tussen 29 en 30 (zie paragraaf 3.2).

Figuur 11. Helices dat begeleiden de vertakking van lading plaatsen (zie paragraaf 4.1) toevoegen.

Figuur 12. De blauwdruk na de "AutoStaple" actie. Het nietje kleuren in het onderste paneel en het rechterpaneel consistent zijn (zie rubriek 5.1). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 13. De "autobreak" dialoog box, waarin de gebruiker kan autobreak parameters te definiëren (zie rubriek 5.2).

Figuur 14. De blauwdruk na de "autobreak" actie (zie rubriek 5.2). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 15 Handmatig bewerken van nietjes I:. Lokaliseren nietjes die over te steken uit helix 29 en 30 en moet worden geschrapt.

5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50268/50268fig16highres.jpg "/>
Figuur 16 Handmatig bewerken van nietjes II:. Verwijderen van de bruggen tussen de gelegen nietjes.

Figuur 17 Handmatig bewerken van nietjes III:. Seaming de nicks langs gefragmenteerde nietjes (zie paragraaf 5.5).

Figuur 18. De hele kloof tussen helices 29-30 toont geen viaducten verbinden de twee (zie paragraaf 5.5). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .

= "Jove_content" fo: keep-together.within-page = "altijd">
Figuur 19. Handmatig bewerken van nietjes getekend in dikke lijn (aanduiding ze zijn ofwel te kort, te lang of cirkelvormig, zie paragraaf 5.6).

Figuur 20. Toevoegen gids helices voor het laden van website vertakking (zie rubriek 6.1). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .

1highres.jpg "/>
Figuur 21. Manuele toevoeging van nietje strengen aan de gids helices, zodat vertakking punten kunnen worden gevestigd (zie paragraaf 6.2). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 22. Introductie van een laadplaats crossover naar de robot chassis steiger op een gunstige locatie (een die minimale bewerking van het chassis nietjes vereist, zie paragraaf 6.5).

Figuur 23. Bekijk de laadplaats nietjes zoals gezien in the onderste paneel na het verwijderen van de gids helices, die niet langer nodig zijn (zie rubriek 6.9).

Figuur 24. Uitbreiding twee nietjes, die zullen worden gebruikt als gate strengen helices van 29 en 30. Merk op dat de twee strengen gezicht tegengestelde richtingen, wat verplicht is voor de vorming van het hek duplex (zie paragraaf 7.4). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 25. De steiger volgorde toevoeging (functie "Seq") dialoogdoos, waardoor de keuze uit een van voorgedefinieerde steigers, of een aangepaste volgorde te voegen (zie paragraaf 8.1).

Figuur 26. Resultaten van CANDO analyse van het ontwerp hier beschreven. De simulatie genereert een. Zip-archief met de verschillende bestanden die de gevraagde informatie te verstrekken. Hier de RMSF (kwadratisch gemiddelde fluctuatie) bestanden (. Png) zijn afgebeeld, toont een model van het ontwerp uit 3 hoeken, gekleurd volgens de sleutel beschreven in het bijgevoegde bestand met de naam "HeatMap4RMSF.txt". In dit geval, minimale RMSF (blauwste) is 1.03 nm, en 95% RMSF (redest) is 3.19 nm. De gradiënt van kleur over het model afgeleid van de polariteit van de robot (poorten 'voorkant', as 'back') en het feit dat er geen verbinding nietjes langs helices 29-30 en 61-0, waardoor de 'front back '' kant om meer dan het schommelen 'kant.

Figuur 27. TEM beeld van de robot ontworpen in dit artikel. Voorbereiding en kleuring monster werd uitgevoerd precies zoals elders ²¹ beschreven.

Discussion

DNA-origami stelt ons in staat om nauwkeurig gedefinieerde objecten fabriceren met willekeurige eigenschappen op nanoschaal. Een belangrijke volgende stap zou de integratie van de functie worden in deze ontwerpen. Terwijl vele toepassingen en problemen kunnen worden aangepakt met deze technologie, is een bijzonder belang in het fabriceren therapeutische en wetenschappelijke robots DNA origami, gelijk staan ​​natuurlijk milieu van DNA. DNA heeft interfaces met moleculaire machinerie in cellen als een genetische informatie opslagmedium. Interessant is dat de gevouwen DNA in een nanorobot of een andere machine nog steeds dienen als genetische informatie in aanvulling op een bouwmateriaal, dat kan worden doorgegeven aan de expressie van een gewenst eiwit na nanorobot desintegreert, als deel van een reeks uitgangen.

In het voorbeeld in dit groenboek besproken, maken we gebruik van een restrictie-enzym om de robot te bedienen. Echter, aanvullende mechanismen die DNA robots kunnen verantd om input omvat de volgende.

Moleculaire herkenning: we onlangs aangetoond aptamer-gebaseerde poorten voor DNA robots die eiwitmoleculen te herkennen aan de oppervlakte op doelcellen ^20. Aptameren kunnen in-vitro worden geselecteerd met behulp van methoden zoals SELEX ^23, uitbesteed uit bedrijven, of gebruikt van de aptameer databank ( http://aptamer.icmb.utexas.edu/ ). Wanneer aptameren worden gebruikt, is het belangrijk om te overwegen dat de streng complementair aan de aptameer, die samen vormen de poort kan worden ontworpen om mismatches die binding van ligand en de verplaatsing van de complementaire streng van de aptameer zal vergemakkelijken. Hoewel het mechanisme waardoor dit onbekend is, kan de gevoeligheid en specificiteit van een aptamer gebaseerde gate worden afgestemd door verhoging of verlaging van het% van de mismatch tussen de twee strengen, om ofwel een zeer strenge, maar inefficiënt poort, of een snel te krijgenmaar lekkende een.

Enzymatische splitsing: hiervoor moeten de poorten zodanig dat zij het substraat van dat enzym bevatten ontworpen. Bijvoorbeeld kan een klein peptide substraat van een protease worden vastgemaakt aan beide zijden van de poort, die blijft de robot in de afwezigheid van het enzym gesloten.

Afstandsbediening: een dergelijke aanpak die niet is begrepen in DNA machines gebruikt een gouden nanokristal antenne een hoogfrequent elektromagnetisch veld dsDNA smelt ²⁴ induceren. Dit kan een gebruiker bediende schakelaar naast bio-responsieve overlegde. Hoewel DNA-origami robots zijn relatief eenvoudig te ontwerpen en te maken, zij vormen een aantal technische uitdagingen als therapeutisch platform. DNA is een ideaal materiaal voor geneesmiddelafgifte aangezien het hoogst gevoelig voor splitsing door nucleasen. Voorts valt een immuunrespons precipiteren. Een grondige studie van het gedrag van DNA origami objecten in een organisme needed aan hun lot bepalen en ervoor zorgen dat ze niet aggregaat in weefsels of integreren in het gastheer genoom.

Samengevat, presenteerden we het gebruik van caDNAno, een eenvoudige, robuuste CAD-tool te ontwerpen DNA origami vormen. We hopen om te beginnen met het zien van toepassingsgericht onderzoek op DNA-origami, op gebieden als therapeutica, energie, metamaterialen, en onderwijs. In al deze plaatsen wordt caDNAno geacht een ernstig effect op het realiseren van de oplossingen. In de toekomst kan het industriële ontwerp en standaard die kan worden vervangen (of delen daarvan kunnen) door een gebruiker omdat ze verenigbaar zijn geworden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autodesk Maya 2012	Autodesk		A student/academic account needs to be created first (see platform-specific instructions in http://cadnano.org)
caDNAno 2.0 (software)	(Open source)		Software for the design of DNA origami structures http://cadnano.org
Cando (webpage)	(Open source)		Webpage running a simulator of DNA origami shapes http://cando-dna-origami.org