Summary
אוריגמי DNA הוא שיטה רב עוצמה לבודת עצמים ננומטריים מדויקים על ידי תכנות ההרכבה העצמית של מולקולות DNA. כאן, אנו מתארים איך יכול להיות מנוצלים-DNA אוריגמי לעצב רובוט רובוטי מסוגלים לחוש סימנים ביולוגיים ולהגיב בצורת הסטה, לאחר מכן הועברה לאפקט רצוי.
Abstract
חומצות גרעין הן להדהים תכליתית. בנוסף לתפקידם הטבעי כאמצעי אחסון למידע ביולוגי 1, הם יכולים להיות מנוצלים במחשוב מקביל 2,3, להכיר ולאגד מטרות מולקולריות או תאי 4,5, לזרז תגובות כימיות 6,7, וליצור תגובות שחושבו בביולוגי מערכת 8,9. חשוב מכך, ניתן לתכנת חומצות גרעין עצמית להרכיב לתוך מבני 2D and 3D 10-12, המאפשרות שילוב של כל התכונות המרשימות האלה ברובוט אחד המקשרות את חישה של אותות ביולוגיים לתגובה מוגדרת מראש על מנת להפעיל את אפקט רצוי.
יצירת צורות מחומצות גרעין הוצעה לראשונה על ידי סימן 13, וכמה וריאציות על הנושא הזה מאז מומשו תוך שימוש בטכניקות שונות 11,12,14,15. עם זאת, משמעותי ביותר הוא אולי אחד המוצע על ידי רותמונד, כינה מלווה בתמיכת ה-DNA אוריגמי16. בטכניקה זו, הקיפול של גדילי דנ"א יחיד 'פיגום' ארוך (> 7,000 בסיסים) מופנה לצורה רצויה על ידי מאות גדילים המשלימים הקצרים כינה "סיכות". הקיפול מתבצע על ידי רמפת חישול בטמפרטורה. טכניקה זו באה לידי ביטוי בהצלחה ביצירת מערך מגוון של צורות 2D עם דיוק וחוסן ראויים לציון. ה-DNA אוריגמי הוארך מאוחר יותר ל 3D, כמו גם 17,18.
המאמר הנוכחי יתמקד בתוכנת caDNAno 2.0 19 שפותחה על ידי דאגלס ועמיתיו. caDNAno הוא חזק כלי CAD ידידותי למשתמש, המאפשר עיצוב של 2D וצורות 3D אוריגמי DNA עם תכונות מגוונות. תהליך העיצוב מסתמך על ערכת הפשטה שיטתית ומדויקת למבני DNA, מה שהופך אותו פשוט יחסית ויעילה.
במאמר זה ידגים לנו את העיצוב של ה-DNA אוריגמי נהnorobot שתואר לאחרונה 20. הרובוט הזה הוא "רובוטית" במובן זה שהיא קישורים לחישת actuation, על מנת לבצע את משימה. אנחנו נסביר כיצד ניתן לשלב ערכות חישה שונות לתוך המבנה, ואיך יכול להיות מועברים לזה אפקט רצוי. לבסוף אנו משתמשים Cando 21 כדי לדמות את התכונות מכאניות של הצורה מתוכננת. הרעיון שאנחנו דנים יכול להיות מותאם למשימות והגדרות רבות.
Protocol
הרובוט שנתכנן במאמר זה מגיב לP חלבון על ידי הפיכת C מטען זמין להיקשר לקולטנים על פני השטח של תא היעד שבחר. הרובוט מוצג באיור 1 C עשויה להיות תרופת קולט חסימה;. וכו גורם גדילה, ודרך לקשר אותו כימי לoligonucleotide-DNA חייב להיות זמינים שלא להרוס את תפקידיו. יש הרובוט שתי מדינות. כששערים פעילים, ה-DNA על שתי 'שפתים' החיצוניות הם הכלאה, כדי לוודא שהרובוט נותר סגור באופן שכל מטען טעון בתוכו הוא מוחרם באופן מאובטח. בנוכחותו של החלבון P, השערים הפתוחים או על ידי אחד מכמה מנגנונים (נדון בהמשך) המאפשר לרובוט כדי לפתוח ולחשוף את המטען. בעת תכנון המבנה, רואים כי רובוט צריך להיות גמיש מספיק כדי לסגור על עצמו במצב הסגור, ואביב למצב הפתוח כאשר השערים לאפשר לה לעשות זאת. דוגמנות ההתנהגות של ה-DNA מבנה התרמודינמית שילוב רכיבים מכאניים וקשים, והאובייקט בפועל עלול לדרוש קצת איטרטיבי שיפור. עם זאת, כאן אנו מתמקדים בתהליך העיצוב תוך שימוש במודל עבודה כללי, שניתן לבנות עליו.
פתק
להבנה מקיפה יותר של התהליך של עיצוב ה-DNA אוריגמי ומתקפל, אנו ממליצים מאוד לקרוא את עיתון caDNAno המקורי על ידי דאגלס ועמיתיו 19 מה שמסביר את הייצוג המופשט של ה-DNA בעיצוב הממשק ואיך זה קשור למבנה המולקולרי בפועל צורת ה-DNA 3D. מאמר זה מלווה בשני מדריכי וידאו המתארים את הייצוג וממשק caDNAno בצורה מאוד ברורה. בנוסף, אנו ממליצים לקרוא את המאמר האחרון יותר על ידי דיאץ ועמיתיו מתארים את היבטים חשובים רבים ובפרוטוקולים מפורטים של תהליך הקיפול, כולל כלי ניתוח Cando 21.
TLE "> 1. להוריד ולהתקין caDNAno 2.0 ו Autodesk מאיה 2012הערה: תוכנת Autodesk היא חינם לסטודנטים ושימוש אקדמי. ההוראות שלהלן כוללות הגדרת חשבון אקדמי ב Autodesk.
- צור חשבון אקדמי בhttp://students.autodesk.com/. לאחר שקבל את הגדרת חשבון הדואר האלקטרוני, לחץ על קישור הפעלה ולמלא בהעדפות שלכם המועדפים.
- הורד את הגרסה החופשית של מאיה 2012 ממרכז ההורדות.
- התקן מאיה 2012 במחשב שלך.
- הפעל מאיית פעם אחת לפני התקנת caDNAno 2.0.
- להוריד ולהתקין את הגרסה האחרונה של caDNAno 2.0 מhttp://cadnano.org/.
- הפעל המאיה 2012. סמל caDNAno אמור להופיע בפינה הימנית העליונה של ממשק המשתמש הגרפי. לחץ על הסמל כדי להיכנס לcaDNAno.
2. Outline צורה הרצויה ונתיב סטרנד פיגום
- ממשק העיצוב של caDNAno בתוך המאיה כולל 3 פנלים (איור 2):
- פנל עליון: צפה בסריג, שבו הוא התווה את הצורה בתחילה. פנל זה מאפשר פעולות סליל ברמה כפולות ומספק תצוגת סעיף של הצורה.
- פנל תחתון: לוח עריכה, פעולות בסיס ברמה יחידה ומאפשר.
- פנל ימני: מודל 3D בזמן אמת מאיה שנוצר מהצורה
- לחץ על הסמל "הכוורת". התקרבות על ומחוץ לסריג בפנל העליון יכול להיעשות על ידי עכבר גלילה למעלה ולמטה, בהתאמה.
caDNAno מאפשר שני סריגי עיצוב אפשריים, חלת דבש וריבוע; במאמר זה אנו נשתמש בפריסת חלת הדבש, אף סריג המרובע יכול לשמש בדרך כלל, כמו גם 22. - התחל על ידי ציור הקטע של הצורה הרצויה בלוח השמאלי.
כל עיגול מייצג את סליל הדנ"א כפול. לפרקווז את הסלילים הבונים את הצורה, פשוט השאיר לחץ על המרכז שלהם (איור 3). המשך על ידי סליל סליל עד שכל הצורה מתוארת. לחלופין, ניתן להסיק את הצורה על ידי לחיצה על הכפתור השמאלי של העכבר ורציפות ציור קווי המתאר של הצורה. כל פעולה ניתנת לביטול על ידי לחיצה על תפריט עריכה ו" בטל ", או על ידי קיצור המקשים Ctrl + Z (PC) או CMD + Z (Mac).
בשלב זה, את הסלילים הנבחרים יופיעו צהובים. במקביל, הפנל התחתון יציג מבט מצד של הצורה, מורכבים מהסלילים הללו. סליל מספור בפנל התחתון עולה בקנה אחד עם המספור בראש אחד. - שים לב לפנל התחתון. כל סליל מיוצג על ידי שתי שורות של ריבועים: השורות הם שני הגדילים של הסליל הכפול, עם כל ריבוע מייצג את בסיס (איור 4).
הפס האנכי הכתום קובע היכן פעולות עריכה יתקיימו לאורך סליל. עמדת הבסיס לאורך הרשת מופיעה כמספר מעל השורה הכתומה. אורך ברירת המחדל של מסגרת הסליל הוא 42 בסיסים. האורך ניתן להרחיב על ידי לחיצה על אחד מסמלי החץ האפורים בפינה הימנית העליונה של לוח העריכה ובחירת אורך ההארכה (בכפולות של 21, אשר תואמות את שני סיבובים מלאים של סליל ה-DNA, שבתורו אחד משתרע על פני 10.5 בסיסים) (איור 4). הרשת תרחיב לכיוון החץ שנבחר. - כדי להתוות את נתיב גדיל הפיגום בפועל לאורך כל הצורה, לחץ על לחצן העכבר, להתחיל מהסליל הראשון וללכת ברציפות במשך כל הסלילים הבאים באותו סדר שהם נבחרו בתחילה בסעיף 2.3. שימו לב כי:
- את הסלילים נבחרו הפעם תהיה לשנות את הצבע לכתום.
- בפנל התחתון, שברי גדיל פיגום יהיו נמשכים באופן אוטומטי בסלילים שנבחרו.
- הפנל הימני יציג את מודל 3D של הצורה נבנית בזמן אמת. בסופו של זהתהליך, טיוטה של נתיב גדיל הפיגום יהיה נמשך באופן אוטומטי בפנל התחתון (איור 5).
- צייר מלבן סביב כל הקצוות השמאליים ביותר של נתיב הפיגום. שים לב שקצוות כך שנבחרו יופיעו אדומים (איור 6).
- להאריך את נתיב הפיגום על ידי גרירת הקצוות הנבחרים כקבוצה לצד השמאל של הרשת. חזור על תהליך זה עבור בשולים הימניים עד לנתיב הוארך כראוי. שימו לב שסיומת הפיגום גם מרחיבה את צורת 3D בלוח הימני (איור 7).
- לאתר את חלקי נתיב הפיגום שבודדו משאר, ולחבר אותם. במצב שלנו, למשל, סלילים 0-9 מהווה חלק מבודד. הצרכים 9 סליל להיות מחובר לסליל 12 (שים לב שהסלילים 9 ו -10 אינם סמוכים בצורה [הפנל עליון] ולכן הם לא יכולים להיות מחוברים).
- זום על הגדילים להיות מחוברים, ושימוש באפשרות "בחירה" לחץ על כל נקודה על אחדשל קווצות השיער. עם לחיצה על כל נקודה לאורך שבר פיגום כחול, סמלי 'הגשר' מופיעים בין סלילים, תוך ציון העמדות שבי crossovers מותר. בעמדות אלה בסיסים בסלילים סמוכים, זה מול זה באופן ישיר, מה שמאפשר את הגדילים לחצות מסליל לסליל בלי לעוות או פיתול ה-DNA. המספר שמופיע ליד כל סמל גשר מציין את מספר הסליל זה יהיה מוצלב ל( איור 8).
- כדי ליצור crossovers, עזב לחץ על סמל הגשר של בחירה. מוצלב פיגום יופק, כלומר הפיגום חוצה בשלב זה מסליל לסליל (איור 9). חזור על תהליך זה עד שחוצה את כל פיגום הסלילים ויוצר לולאה סגורה החובקת את כל הצורה, לא משאירים אזורים שמבודדים משאר העור והגידים.
שימו לב שבזמן יופיע crossovers כדי להקיף את מרחק בתוכנה, במציאות הם אינם כוללים את כל בסיס ה-DNA. מבחינה פיזית, מוצלב"גשר" מכיל רק יחידה אחת של עמוד השדרה פוספט DNA המקשר את שני הבסיסים מהסלילים הסמוכים זה לזה. - לפני שעבר לשלב הבא, ודא שכל הפיגום הוא רציף, ולא חלק ממנה הוא מבודד מהאחרים.
3. הגדר צירים מנגנון פתיחה
הרובוט פותח תאר בתגובה לקלט ביולוגי מוגדר לחשוף המטען שלה. הפתיחה מתקיימת באופן דמוי מעטפת, עם שני חצאים (סלילים 0-29 מרכיבים מחצית אחת, סלילי 30-61 מרכיבים את המחצית השנייה) המסתובב סביב שני צירים. הצירים נוצרים על ידי crossovers בין סלילים ו61-0 29-30, שהם crossovers רק בין מחציות ואלה מוצבים רק באו קרובים לקצה השמאלי של הרשת. הקצה הימני יכיל את קווצות השער (ראה להלן).
- למחוק את מוצלב הקיים בין סלילי 29-30. כדי למחוק מוצלב, לחץ על הנקודה "ברך" באחת הגדיל.זה משאיר את ניק בשני הגדילים שבו היו אמורים להיות מוצלב. לתפר ניקס, הקש SHIFT ולחץ על כל ניק.
- צור מוצלב חדש בין סלילי 29-30 קרובים ככל האפשר לקצה השמאלי של הרשת (איור 10).
- צור מוצלב חדש בין סלילי 61 ו 0 קרובים ככל האפשר לקצה השמאלי של הרשת.
4. להגדיר אתרים מצורפים מטען
אחרי שנסיים התוויית דרך גדיל הפיגום, אנחנו צריכים להגדיר את הקובץ המצורף מטען (טעינה) אתרים. אתרים טוענים הם בגדילים מהדקים עובדה שמרחיבים מתוך הסלילים שלהם, כמו "סניפים" תקועים בודדות. לכן, חשוב מאוד להגדיר במדויק היכן לאורך סליל הסתעפות זו מתרחשת, כדי לוודא שהוא משתרע לכיוון הרצוי. אם אנחנו מגדירים את הרחבות מצרך באופן שרירותי, אתרי טעינה עלולים להתרחש בצד החיצוני של הרובוט במקום בצד הפנימי.
To לוודא מצרך משתרע לכיוון מסוים בלבד, נשרטט סליל נוסף, המשמש כמדריכים עבור הסתעפות כיוונית של מצרך מהגוף העיקרי. לאחר הארכת מצרך טעינת האתר הרצויה, סליל המדריך מוסר.
- בואו נגדיר 4 אתרי טעינה מול לכיוון הצד הפנימי של הרובוט. אתרי הטעינה יהיה להסתעף של 3 סלילים, 27, 34, ו -58. עבור כל אתר, בלוח העליון לחץ על הסליל מייד בסמוך לסלילים אלה שפונה לצד הפנימי (איור 11). הפעולה זו תוסיף את הסלילים לרשת בפנל התחתון. אל לחץ שני הסלילים הללו עדיין.
5. הוספה ועריכה של סטייפלס
- לחץ על "AutoStaple". התוכנה באופן אוטומטי להוסיף רצפי מצרך בצבעים שונים (איור 12). שים לב שכבר הוסיפו סיכות לצורת 3D בפנל הימני. צבעי סיכות הנן עקביים לפנלים התחתונים ועל השמאל. בadditiב, יש חיווי בפינה השמאלית התחתונה של הממשק, אשר מציין מצרך.
הערה: סיכות לא יכולות להיות ארוכות מדי, קצרות מדי או עגולה. רוב הסיכות שנוצרו כאן אינו עומדים בקריטריונים אלה, וצריכים להיות ערוכים. הצעד הראשון בעריכתם הוא אוטומטית (ראה השלב הבא). - לחץ על "AutoBreak". תיבת דיאלוג תפתח (איור 13), וביקש לפרמטרים המוגדרים על ידי משתמש לפעולה זו:
- אורך יעד (נ"ב): אורכו הצפוי של מצרך אם אפשר
- אורך מינימאלי (נ"ב): אורך מינימאלי מוותר למצרך
- אורך מקסימאלי (נ"ב): אורך מקסימאלי מוותר למצרך
- דקות dist לxover (נ"ב): המספר מינימאלי של זוגות בסיסי מצרך יכול לעבור בין הקצה שלה ומוצלב או בין שני crossovers.
השתמש בפרמטרים של ברירת המחדל, לחץ על אישור. התוכנה תשבור את הסיכות על פי פרמטרים אלו, כמיטב יכולתו (איור 14).
- למחוק את כל crossovers קציץ בין סלילים ו61-0 29-30, כדי לאפשר לסלילים אלה כדי להפריד ולאפשר לרובוט כדי לפתוח. מחיקת crossovers קציץ תדרוש קצת עריכה ידנית לסיכות נכונות שהופכות לקצרות מדי או לא הגיוני כתוצאה מפעולה זו. כדי לעשות זאת כראוי, בצע את ההוראות שבסעיפים הבאים.
הקפד להשאיר את crossovers הפיגום שנוצר בסעיפי 3.2 ו 3.3 ללא פגע. - קח, למשל, מוצלב מצרך הראשון (ציאן וסיכות שחורות) משמאל בין סלילי 29 ו -30 (איור 15). למחוק את שני גשרים של מוצלב זו על ידי לחיצה על כל נקודת הברך או גשר אז זה נראה אדום, ולאחר מכן להכות DELETE (איור 16).
- תפר שתי סיכות על סליל 29 על ידי לחיצה על מקש SHIFT לחוץ ולחיצה על ניק ביניהם. באופן דומה, תפר שלוש הסיכות בגדיל 30 למצרך יחיד (איור 17). סטייפלס יכולניתן להאריך או לקצר באופן ידני על ידי לחיצה על קצו וגרירתו המועדפים. יש להיזהר שלא circularize כל מצרך. איור 18 מציג את הפער בין סלילי 29-30 לאחר עריכה של crossovers קציץ מלא. חזור על תהליך זה עבור סלילים 0 ו -61, ולערוך באופן ידני את כל סיכות בכל סליל.
- אתר סיכות שנכרתו על ידי קו עבה, כלומר, הם דורשים עריכה נוספת. לבחון כל אחד ולתקן במידת צורך. לדוגמה, ניתן למחוק בסיכות, כי הם קצרים מדי (איור 19) או הוארכה במידת האפשר.
6. יצירת אתרי העמסה וגייטס
- השני לחץ על סלילי טעינת האתר בפנל העליון, ולהאריך את שברי גדיל פיגום וכתוצאה מהפנל התחתון על ידי לחיצה על קצו וגרירתו המועדפים (איור 20).
- הוספה ידנית של סיכות לברי הפיגום הללו על ידי הצבת אנכית הכתומה במיקום הרצוי לאורך tהוא הפיגום, הולך על סלילי המדריך על הלוח השמאלי, מחזיק את מקש SHIFT לחוץ ולחיצה. זה יוסיף מבשר מצרך בכל סליל (איור 21).
- להאריך את מבשרי מצרך לכל אורכו, כמו גם על ידי לחיצה וגרירה.
- לאתר את סמלי הגשר האדומים, המציין עמדות מוצלבים מותרת בין גדיל המדריך (לדוגמה, סליל 62) והמארז (לדוגמה, סליל 3).
- בחר את המיקום הנוח ביותר להציג את מוצלב ולחץ על סמל הגשר (איור 22). מיקום נוח דורש עריכה מינימאלית של סיכות קיימות במארז.
- במדריך הסליל (סליל 62), מחק את מצרך החלק שאינו חלק מאתר ההעמסה, ולקצר את חלק ההשתתפות באורך הרצוי. האורך הרצוי צריך לספק גם סגוליות לטעינת סוגים שונים של מטענים, וכוח מחייב. בדרך כלל, זנב 18-mer אמור להיות בסדר. ודא מצרך נשאר DRAwn על ידי קו דק, אחרת לערוך אותו עד שהוא.
- במארז, לערוך את הסיכות שהשתנו בהתאם לצורך.
- למחוק את המדריך (סליל 62) ומשאיר רק את סיומת מצרך.
- חזור על שלבי 6.4-6.8 עבור כל אתרי הטעינה (איור 23).
7. עיצוב שער גידים
את קווצות השער הן גדילים בלבד, פרט לצירים, המקשרות סלילים 29-30 ו61-0. בניגוד לצירים, קווצות השער אינן crossovers. במקום זאת, הם להכליא כדי ליצור קטע גדילים כפול שמשמש כחיישן לקלט הביולוגי של בחירה. ברגע ששער דופלקסים הם עקורים, כל הרובוט יכול לסוקי רוג'מונט סובב סביב הצירים והפתוחים.
- לאתר את המיקום הנכון לקווצות שער. אלה יהיו סיכות ב -29 בסלילים, 30, 61, ו 0.
- כך, למשל, לבחון את אזור השער 29-30. ישנם גדילים מהדקים נוחים איגוף סלילים 29 ו -30 עלצד ימני של הרשת, אשר יכול לשמש כקווצות שער. שימו לב שהם עומדים בפני כיוונים מנוגדים.
- לחץ על קצו של אחד מגדילי שער הפוטנציאל להרחיב אותו מחוץ לצורה. אם הקצה נמצא מעל פיגום מוצלב, הבחירה שלו הייתה יכולה להיות פשוט על ידי ביצוע בטוח שרק "Stap" (LES) לבחירתם, על ידי לחיצה על את "Scaf" (קיפול) בסרגל הכלים "לבחירה" בצד הימני העליון של הממשק .
- להאריך את שתי הסיכות כדי ליצור את חוטי השער. ערוך את הסיכות אם הרחבה זו מחייבת אותו (איור 24). חזור על פעולה זו לקווצות השער של סלילים 0 ו -61.
שימו לב כי לעת עתה, בפועל האורך לא משנה, שכן ה-DNA החיישן (למשל aptamer) תחליף את רצפי גדיל השער בשלב השלמת הרצף.
8. בחר רצף פיגום
- לחץ על הכלי "Seq". הצב את הסמן בכל מקום על גדיל הפיגום ולחץ. תיבת הדו שיח תפתח מבקשת מאתנולבחור את מקור ה-DNA הפיגום (איור 25).
- בחירת ה-DNA המקור מאוד תלויה בגודל הרובוט. לדוגמה, M13mp18 ssDNA (p7249), ונגזרים המורחבים שלה (p7308 וכו ') שהיו בדרך כלל הבחירה לצורות אוריגמי DNA גדולות, שיתאימו כאשר גדיל הפיגום הוא ארוך ~ 7 קילו. אם הפיגום של הצורה מתוכננת הוא קצר יותר באופן משמעותי מהמקור שנבחר, גדיל הפיגום העודף שאינו הכלאה לכל מצרך יהיה ליצור לולאה של ssDNA הבולטת מהצורה המקופלת. אמנם זה בדרך כלל מהווה בעיה קטנה ללולאות קצרות יחסית, לולאות ארוכות רב-kB יכולים באופן דרסטי להפריע לקיפול ותפקוד של הרובוט. לכן, חשוב להתאים את המקור שנבחר לאורך פיגום הצורה.
לדוגמה, אם גדיל פיגום הצורך לקפל צורה קטנה היא ארוך ~ 1,600 בסיסים, שהוא קצר יותר באופן משמעותי מהמקורות המוגדרים מראש בתיבת הדו שיח, רצף מותאם אישית יכוללשמש כפיגום. יכולים להיחשב כמה מקורות. לדוגמה, ניתן לעכל M13mp18 עם אנזים הגבלה ספציפי שמייצר בר באורך הרצוי. עיצוב מקור כזה יכול להיעשות בNebCutter (http://tools.neb.com/NEBcutter2/) על ידי הדבקת רצף M13mp18 בחלון קלט NebCutter, ומיפוי אתרי הגבלה. אפשרות נוספת היא להשתמש ssDNA מראש מתעכל, כגון phiX174 virion ssDNA HaeIII לעכל, זמין מניו אינגלנד Biolabs.
- בתיבת הדו שיח, לחץ על "M13mp18". שימו לב שרצף ה-DNA שנבחר כבר הוסיף לפיגום וגדילי מצרך בפנל התחתון.
9. אקספורצף סיכות RT כגיליון אלקטרוני
- לחץ על "יצוא" בסרגל הכלים העליון, ולבחור שם קובץ יעד לרשימת מצרך. לחץ על "שמור".
- אתר את קובץ יעד. CSV ולפתוח אותו.
- הגיליון מציג את רשימת מצרך, שניתן לשלוח לחברה היא סינתזה של DNA. שתי העמודות הראשונות להציג את קואורדינטות ההתחלה וסיום, עם המספר מחוץ לסוגריים המציינים את מספר סליל והמספר בתוך סוגריים המציינים את עמדת בסיס.
10. הקצאת רצפי שער וטוען
- ברשימת מצרך, תוכל להבחין כי כמה רצפים להתחיל או להסתיים עם שורה של סימני שאלה "?????". סימני שאלה אלה לציין שמאז לא גדיל פיגום hybridizes עם אזורי מצרך הספציפיים האלה, הם לא יכולים להיות מוקצים רצפים משלימים. אלה הם למעשה השלוחות אנו מיועדים לקווצות השער ואתרי טעינה, ולכן אלה צריכים להיות מוקצים באופן ידני עכשיו. שער:
- את השערים לקבוע את האופי של הקלט הביולוגי שעליו יהיה לעבור מהרובוט פעיל למצב פעיל ולחשוף את המטען שלה. כל שער dsDNA אחד יכול לקודד תגובה לקלט ביולוגי אחד (או יותר), ולכן יכול להיות מוגדר בפרופיל של תשומות הנדרשות להפעלת רובוט.
נניח לדוגמה שזה הרמז הביולוגי מפעילה הפעלת רובוט הוא אנזים הגבלה, שיכול להעיד על הנוכחות של חיידק מזהם. - הראשון בחשבון כי את קווצות שער ssDNA לא להכליא מייד לאחר ההסתעפות של הסלילים שלהם. עיצוב השער אחר עלולה לעכב הכלאה במהלך קיפול. לכן, כל ענף צריך להתחיל עם מחרוזת spacer. אנחנו בדרך כלל להשתמש בפולי-T כמחרוזות spacer, כרצף זה מספק גמישות.
- כמו כן, אנו מניחים כי אורכו של אזור ההכלאה השער הוא 20 בסיסים, המכיל לשבת הגבלת היעדדואר באמצע שלה.
- לכן השער עשוי להיראות כך:
[Helix 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTxxxxxxGCTAGAG-3 "
[Helix 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAxxxxxxCGATCTC-5 '
"....." נסמן את אזור מצרך שhybridizes עם גדיל הפיגום, ולכן יש לו כבר רצף ולא צריך להיות שונה.
דופלקס האקראי "GTGAGTT" והמשלים שלו מבטיח את אתר ההגבלה הוא לא בחלקו פתוח, ומספק כמה בסיסים נוספים על מנת להבטיח עיכול יעיל על ידי האנזים.
"X" מציין את אתר ההגבלה.
דופלקס האקראי "GCTAGAG" המשלים שלו ולספק כמה בסיסים נוספים לאנזים לעבוד ביעילות, אך גם מוודא גדיל השער הוא מספיק ארוך כדי להבטיח סגירת רובוט טובה.
לפני בחירת אתר הגבלה כמטרה, לוודא את מבנה הרובוט כולו, אתרי טעינה וחלקו השני של השער עצמו אינם מתעכלים על ידיאנזים של בחירה. בבדיקה זו, רשימת 0 החותכת NEBCutter (אנזימים שלא לחתוך את כל הרצף) הדגיש EagI, מבודד מagglomerans Pantoea Enterobacter, כאנזים פוטנציאל שיכול להעיד על הנוכחות של זיהומית enterobacterial. - השער נראה עכשיו כמו זה (אתר הגבלה צהוב סימני EagI):
[Helix 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTCGGCCGGCTAGAG-3 "
[Helix 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAGCCGGCCGATCTC-5 '
שים לב שעיצוב זה מבוסס על ההנחה שלאחר עיכול, הרצף "GTGAGTTCGG" (T מ = 32 מעלות צלזיוס) הוא לא מספיק ארוך או יציב thermodynamically להחזיק את הרובוט סגור יותר. הנחה זו סבירה להניח שתהיה צורך אומת בניסוי. - השער השני יכול להיות זהה במקרה שהרובוט יגיב רק לאנזים אחד, או יכול להיות מתוכנן עם אתר אחר, סגוליות והולך של רובוט. ניתן להוסיף לאותו גדיל אתרי הגבלה נוסף, ב קמטים מורכבות וספציפיות של הרובוט.
- את השערים לקבוע את האופי של הקלט הביולוגי שעליו יהיה לעבור מהרובוט פעיל למצב פעיל ולחשוף את המטען שלה. כל שער dsDNA אחד יכול לקודד תגובה לקלט ביולוגי אחד (או יותר), ולכן יכול להיות מוגדר בפרופיל של תשומות הנדרשות להפעלת רובוט.
- טעינת אתרים:
- האתר טוען יכול להיות רצף אוניברסלי. לחלופין, יכולים להיות מבוססים על טעינת אתרי רצפים ייחודיים, אשר יקטינו מודולריות אלא לשפר את השליטה על כיוון מטען ויחסים (לסוגים שונים של מטענים).
- לבסוף, טוען oligonucleotides האתר צריך לכלול קבוצה כימית פונקציונלית המאפשרת להם להטות עם כל מטען: חלבון, nanoparticle, וכו 'ודא קבוצה הכימית היא רכוב על הסוף הנכון (5' או 3 '), בהתאם לכיוון מצרך .
11. לדמות תוצאות בCando
- לאחר העבודה נשמרה כקובץ. JSON, ניתן להעלות אותו לCando לניתוח. Cando הוא סימולציה מבוססת סופי, אלמנט של מבנה ה-DNA שיכול להעריך הקשיחות והיציבות שלה בפתרון 21.
- עבור לami.org / "target =" _blank "> http://cando-dna-origami.org/
- לחץ על "שלח קובץ caDNAno לניתוח" ולמלא את כל המידע הדרוש.
- ניתוח בCando בדרך כלל לוקח עד 15-20 דקות. בסופו של הדבר, הודעת דואר אלקטרוני מאפשרת לנו לדעת את הניתוח הושלם, מתן קישור להורדה את תוצאות הסימולציה (איור 26).
12. ה-DNA סדר ומקפל את הרובוט
ברגע שתהליך התכנון הושלם וניתוח Cando מציג תחזית מספקת של המוצר, רשימת גדיל מצרך שנוצרה בסעיפים ניתן להזמין 9-10. בדרך כלל, גדילים מהדקים אינם דורשים טיהור מסוימת, עם זאת, מומלץ שגדילים ייעודי כגון שערים או אתרי טעינה להיות מטוהרים על ידי HPLC.
מנת ה-DNA ביצוע השלבים, כלומר מתקפלת, טיהור והערכה של מוצר, כולל הדמיה של המבנה המקופל או על ידי כוח אטומימיקרוסקופיה (AFM) או מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) הן מחוץ להיקף של מאמר זה, וניתן למצוא בדוחות קודמים 17,18,20,21. תמונת TEM של הרובוט נועד לכאן הוא הביא כדוגמה (איור 27). הכנת מדגם וצביעה בוצעה בדיוק כפי שתואר במקומות אחרים 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דמויות הן 1-25 צילומי מסך של ממשק caDNAno 2.0 המציג את תהליך עיצוב צעד אחר צעד. החתך של הצורה היה ראשון שתואר (איור 3), ואחריו תוספת אוטומטית של שברי גדיל פיגום והשלים את נתיב הפיגום כולו (איור 7). גדילים מהדקים מתווספים באופן אוטומטי (איור 12), נשברו על פי פרמטרים המוגדרים על ידי משתמש (איור 14), ונערכו באופן ידני כדי להתאים את הסיכות לפונקציה הרצויה של המכשיר (איורים 15-18). איורים 23-24 מתארים כיצד טעינה אתר וקווצות שער מתווספים וערכו. לבסוף, איור 27 מציג תמונת TEM של המודל תוכנן כאן.
"/>
איור 1. מודל 3D של הרובוט המוגמר, שתוכנן על ידי caDNAno 2.0 ונוצר על ידי Autodesk המאיה 2012.
איור 2. תצוגה של ממשק עיצוב 2.0/Autodesk מאיה 2012 caDNAno. פנל עליון: פנל סריג להתוויית הצורה הראשונית. פנל תחתון: לוח עריכה. פנל ימני:. גנרטור מודל 3D (ראה סעיף 2.1) לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. ציור הקטע של הצורה על הרשות העליונה Nel (סעיף 2.3 ראה מסגרת).
איור 4. תחתית הפנל (עריכה) של caDNAno 2.0. הפס האנכי הכתום קובע היכן לאורך פעולות עריכת הרשת תתרחש. בחצים האפורים בפינה הימנית העליונה נמצאים בשימוש כדי להאריך את הרשת לשני הצדדים (סעיף 2.4 ראה מסגרת).
איור 5. טיוטה של גדיל הפיגום אחרי קווי המתאר הראשוני בפנל העליון (סעיף 2.5 ראה מסגרת). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
ogether.within עמודים = "תמיד"> 
איור 6. בחירה כל קצות שביל גדיל הפיגום והארכת הנתיב לאורך הרצוי (סעיף 2.7 ראה מסגרת).
איור 7. מראה כללי של לוחות התחתונים וימניים המדגימים כיצד שינויי מודל 3D בזמן אמת יחד עם פעולות עריכה. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
8/50268fig8highres.jpg "/>
איור 8. סמלי הגשר הכחולים בין סלילים נסמן את העמדות שבי crossovers הפיגום מותר (סמלים אדומים מתייחסים לcrossovers קציץ והם עדיין לא מופיעים בסעיף 2.9 ראה מסגרת).
איור 9. יצירה חדש פיגום crossovers על ידי לחיצה על אייקוני הגשר של בחירה (סעיף 2.10 ראה מסגרת).
איור 10. יצירת ציר (מוצלב קרוב ככל האפשר לצד השמאל של הרשת) בין סלילי 29 ו -30 (סעיף 3.2 ראה מסגרת).
N-page = "תמיד"> 
איור 11. הוספת סלילים המנחים את ההסתעפות של אתרי טעינה (סעיף 4.1 ראה מסגרת).
איור 12. התכנית לאחר הפעולה "AutoStaple". את הצבעים הבסיסיים בפנל התחתון והפנל הימני עולים בקנה אחד (ראה סעיף 5.1). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 13. התיבה דו השיח "AutoBreak" שבו משתמש יכול להגדיר פרמטרים AutoBreak (סעיף 5.2 ראה מסגרת).
איור 14. התכנית לאחר פעולת "AutoBreak" (סעיף 5.2 ראה מסגרת). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 15 עריכה ידנית של סיכות אני:. איתור סיכות שלחצות מסליל 29 ו -30 ויש למחוק.
5IN "עבור: src =" / files/ftp_upload/50268/50268fig16highres.jpg "/>
איור 16 עריכה ידנית של סיכות השנייה:. למחוק את הגשרים בין הסיכות הממוקמות.
איור 17 עריכה ידנית של סיכות III:. Seaming את ניקס יחד סיכות מקוטעות (סעיף 5.5 ראה מסגרת).
איור 18. הפער בין כל סלילי 29-30 מראים שום crossovers לקשר שניים (סעיף 5.5 ראה מסגרת). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
= עבור "jove_content": לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 19. עריכה ידנית של סיכות מצוירות בקו עבה (המציין הם גם קצרים מדי, ארוכים מדי או עגולים, סעיף 5.6 ראה מסגרת).
איור 20. הוספת סלילי מדריך לטעינת אתר הסתעפות (סעיף 6.1 ראה מסגרת). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
1highres.jpg "/>
איור 21. בנוסף ידני של גדילים מהדקים לסלילי המדריך, ולכן יכולים להיות ממוקמות בנקודתי הסתעפות (סעיף 6.2 ראה מסגרת). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 22. היכרות מוצלב אתר טוען לרובוט מארז הפיגום במיקום נוח (אחד שדורש עריכה מינימאלית של מארז סיכות, סעיף 6.5 ראה מסגרת).
איור 23. צפייה בסיכות אתר הטעינה כפי שניתן לראות בפנל תחתון דואר לאחר הסרת סלילי המדריך, שהם כבר לא נחוצים (סעיף 6.9 ראה מסגרת).
איור 24. הרחבת שתי סיכות, אשר הולכים לשמש כקווצות שער, מסלילי 29 ו -30. שימו לב ששני הגדילים להתמודד כיוונים מנוגדים, שהיא חובה ליצירת דופלקס השער (סעיף 7.4 ראה מסגרת). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 25. בנוסף רצף הפיגום (כלי "Seq") הדיאלוגתיבה, המאפשרת לבחור את אחד מהפיגומים שהוגדרו מראש, או להכניס רצף מותאם אישית (סעיף 8.1 ראה מסגרת).
איור 26. תוצאות של ניתוח Cando של העיצוב שתוארו כאן. הסימולציה יוצרת ארכיון. Zip המכיל את הקבצים השונים המספקים את המידע המבוקש. כאן RMSF (שורש ממוצע תנודות כיכר) קבצים (. PNG) מתוארים, מראים מודל של העיצוב מ3 זוויות צפייה, בצבע לפי המפתח המפורט בקובץ המצורף בשם "HeatMap4RMSF.txt". במקרה זה, מינימום RMSF (הכחול ביותר) הוא 1.03 ננומטר, ו -95% RMSF (redest) הוא 3.19 ננומטר. השיפוע של צבע על פני המודל נובע מהקוטביות של הרובוט (שערים ב'מול ', בציר ה' חזרה ') והעובדה שאין סיכות חיבור לאורך סלילי 29-30 ו61-0, גרימת' החזית "צד לתנודות של יותר מה 'חזרה'צד.
איור 27. תמונת TEM של הרובוט תוכנן במאמר זה. הכנת מדגם וצביעה בוצעה בדיוק כפי שתואר במקומות אחרים 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ה-DNA אוריגמי מאפשר לנו לייצר אובייקטים שהוגדרו במדויק עם תכונות שרירותיות בקנה המידה ננומטרי. השלב הבא חשוב יהיה האינטגרציה של פונקציה לתוך עיצובים אלה. בעוד יישומים רבים ואתגרים ניתן להתמודד עם טכנולוגיה זו, יש עניין מיוחד בבודת רובוטים טיפוליים ומדעיים מאוריגמי DNA, כמו אלה מייצגים סביבה טבעית של ה-DNA. ה-DNA כבר ממשקים עם מכונות מולקולריות בתאים כאמצעי אחסון מידע גנטי. מעניין, את ה-DNA המקופל בnanorobot או מכונה אחרת עדיין יכול לשמש כמידע גנטי בנוסף להיותו חומר בנייה, אשר יכולה להיות מועבר לביטוי של חלבון רצוי לאחר מתפרק nanorobot, כחלקים של רצף של פלטים.
בדוגמא שנדונה במאמר זה, אנו משתמשים באנזים הגבלה להפעלת הרובוט. עם זאת, מנגנונים נוספים שבו רובוטים DNA יכולים responד לתשומות כולל את הבאים.
הכרה מולקולרית: לאחרונה הפגנו שערים מבוססי aptamer לרובוטים DNA המזהים מולקולות חלבון על פני השטח על תאי היעד 20. ניתן לבחור aptamers חוץ גופייה תוך שימוש בשיטות כגון Selex 23, מיקור חוץ מחברות, או בשימוש מבסיס הנתונים (aptamer http://aptamer.icmb.utexas.edu/). כאשר aptamers מועסקים, חשוב להביא בחשבון שיכול להיות מתוכנן גדיל משלים לaptamer, אשר יחד מהווה את השער, כדי לכלול אי התאמות, אשר תקלנה על כריכה של ליגנד והתזוזה של הגדיל המשלים של aptamer. בעוד המנגנון המאפשר את זה הוא לא ידוע, את הרגישות והסגוליות של שער מבוסס aptamer יכול להיות מכוונת על ידי גדלה או קטן של% אי התאמה בין שני הגדילים, כדי לקבל או שער מחמיר מאוד אבל לא יעיל, או מהיראבל דולף אחד.
מחשוף האנזימטית: לזה, את השערים צריכים להיות מתוכננים כך שהם מכילים את המצע של אנזים זה. לדוגמה, במצע פפטיד קטן של פרוטאז יכול להיות קשור משני הצדדים אל השער, אשר ישמור את הרובוט נסגר בהיעדר האנזים.
שלט רחוק: גישת פוטנציאל שלא הוחל על מכונות DNA משתמשת בזהב ננו אנטנה בשדה האלקטרומגנטי בתדירות גבוהה כדי לגרום dsDNA היתוך 24. זה עשוי לספק מתג המופעל למשתמש, בנוסף לאלה המגיבים ביו. למרות שרובוטי אוריגמי DNA הם יחסית פשוטים לתכנן ולבצע, הם מציבים כמה אתגרים טכניים כפלטפורמה טיפולית. ה-DNA הוא לא חומר אידיאלי עבור משלוח סמים כפי שהוא פגיע מאוד למחשוף ידי nucleases. יתר על כן, זה יכול לזרז תגובה חיסונית. לימוד מעמיק של ההתנהגות של אובייקטי אוריגמי DNA של אורגניזם הוא needed להגדיר את גורלם ולוודא שהם לא מצטברים ברקמות או להשתלב בגנום המארח.
לסיכום, הצגנו את השימוש בcaDNAno, כלי CAD פשוט, חזק לצורות עיצוב אוריגמי DNA. אנו מקווים להתחיל לראות מחקר יישום מונחה בדנ"א אוריגמי, בתחומים כמו תרופות, אנרגיה, metamaterials, וחינוך. בכל המקומות האלה, caDNAno צפוי להשפיע באופן משמעותי על מימוש פתרונות. בעתיד, זה יכול להפוך לסטנדרט תעשייתי ועיצוב, אשר יכולה להיות מוחלף (או חלקים שיכולים) על ידי כל משתמש, כי הם כולם תואמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לס דאגלס לדיונים מאוד יקרי ערך וייעוץ, ואת כל החברים במעבדה בצלת לדיונים ועבודה מועילים. עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מהפקולטה למדעי חיים והמכון לננוטכנולוגיה וחומרים מתקדמים באוניברסיטת בר אילן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autodesk Maya 2012 | Autodesk | A student/academic account needs to be created first (see platform-specific instructions in http://cadnano.org) | |
| caDNAno 2.0 (software) | (Open source) | Software for the design of DNA origami structures http://cadnano.org | |
| Cando (webpage) | (Open source) | Webpage running a simulator of DNA origami shapes http://cando-dna-origami.org |
References
- Watson, J. D., Crick, F. H. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature. 171, 964-967 (1953).
- Adleman, L. M. Molecular computation of solutions to combinatorial problems. Science. 266, 1021-1024 (1994).
- Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. Neural network computation with DNA strand displacement cascades. Nature. 475, 368-372 (2011).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
- Tang, Z., Parekh, P., Turner, P., Moyer, R. W., Tan, W. Generating aptamers for recognition of virus-infected cells. Clin. Chem. 55, 813-822 (2009).
- Baskerville, S., Bartel, D. P. A ribozyme that ligates RNA to protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 9154-9159 (2002).
- Bartel, D. P., Szostak, J. W. Isolation of new ribozymes from a large pool of random sequences [see comment]. Science. 261, 1411-1418 (1993).
- Benenson, Y., Gil, B., Ben-Dor, U., Adar, R., Shapiro, E. An autonomous molecular computer for logical control of gene expression. Nature. 429, 423-429 (2004).
- Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333, 1307-1311 (2011).
- Rothemund, P. W., Papadakis, N., Winfree, E. Algorithmic self-assembly of DNA Sierpinski triangles. PLoS Biol. 2, e424 (2004).
- Chen, J. H., Seeman, N. C. Synthesis from DNA of a molecule with the connectivity of a cube. Nature. 350, 631-633 (1991).
- He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452, 198-201 (2008).
- Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. J. Theor. Biol. 99, 237-247 (1982).
- Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485, 623-626 (2012).
- Yin, P., et al.
- Rothemund, P. W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325, 725-730 (2009).
- Douglas, S. M., et al. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459, 414-418 (2009).
- Douglas, S. M., et al. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Res. 37, 5001-5006 (2009).
- Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335, 831-834 (2012).
- Castro, C. E., et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Methods. 8, 221-229 (1038).
- Ke, Y., et al. Multilayer DNA origami packed on a square lattice. Journal of the American Chemical Society. 131, 15903-15908 (2009).
- Mallikaratchy, P. Using aptamers evolved from cell-SELEX to engineer a molecular delivery platform. Chem. Commun. (Camb). , 3056-3058 (2009).
- Hamad-Schifferli, K., Schwartz, J. J., Santos, A. T., Zhang, S., Jacobson, J. M. Remote electronic control of DNA hybridization through inductive coupling to an attached metal nanocrystal antenna. Nature. 415, 152-155 (2002).
