Progettazione di un robot bio-sensibile da DNA Origami

Summary

Origami di DNA è un potente metodo per la realizzazione di oggetti in nanoscala precise programmando l'auto-assemblaggio di molecole di DNA. Qui, descriviamo come origami di DNA può essere utilizzato per progettare un robot in grado di rilevare segnali biologici e rispondenti, per il cambiamento di forma, successivamente trasmesso ad un effetto desiderato.

Abstract

Gli acidi nucleici sono sorprendentemente versatile. Oltre al loro ruolo naturale come supporto di memorizzazione per informazioni biologiche ^1, possono essere utilizzati in parallelo computazione ^2,3, riconoscono e si legano bersagli molecolari o cellulari ^{4,5, 6,7} catalizzano reazioni chimiche, e generano risposte calcolate in biologico Sistema di ^8,9. Soprattutto, gli acidi nucleici possono essere programmate per auto-assemblano in strutture 2D e 3D ^10-12, consentendo l'integrazione di tutte queste caratteristiche notevoli in un unico robot che collegano il rilevamento di segnali biologici per una risposta predeterminata per esercitare un effetto desiderato.

Creare forme di acidi nucleici è stata proposta da Seeman ^13, e diverse variazioni sul tema sono stati da allora realizzati con varie tecniche ^11,12,14,15. Tuttavia, il più significativo è forse quello proposto da Rothemund, definito scaffolded DNA origami16. In questa tecnica, la piegatura di una lunga (> 7000 basi) a singolo filamento di DNA 'scaffold' è diretta ad una forma desiderata da centinaia di corti filamenti complementari denominati 'graffette'. Piegatura viene effettuata da temperatura rampa ricottura. Questa tecnica è stata dimostrata con successo nella creazione di una gamma di forme 2D con notevole precisione e robustezza. Origami di DNA è stato successivamente esteso al 3D e ^17,18.

Il documento attuale si concentrerà sul software caDNAno 2.0 ¹⁹ sviluppato da Douglas e colleghi. caDNAno è un robusto, facile da usare strumento CAD che consente la progettazione di forme 2D e 3D origami di DNA con caratteristiche versatili. Il processo di configurazione si basa su uno schema di astrazione sistematica e accurata per strutture del DNA, che rende relativamente semplice ed efficiente.

In questo lavoro abbiamo dimostrato la progettazione di un origami di DNA ndnorobot che è stata recentemente descritta ^20. Questo robot è 'robotica', nel senso che ci è concesso di rilevamento di attuazione, al fine di eseguire un compito. Vi spieghiamo come vari sistemi di rilevamento possono essere integrati nella struttura, e come questo può essere inoltrato a un effetto desiderato. Infine usiamo Cando ²¹ per simulare le proprietà meccaniche della forma progettata. Il concetto discutiamo può essere adattato a molteplici compiti e le impostazioni.

Protocol

Il robot verrà costruito in questo documento risponde ad una proteina P facendo un carico C disponibili per legarsi ai recettori sulla superficie di una cellula bersaglio prescelto. Il robot è mostrato in Figura 1 C può essere un farmaco recettore-bloccaggio;. Un fattore di crescita, ecc, e un modo per collegare chimicamente ad un oligonucleotide DNA deve essere disponibile che non distrugge la sua funzione. Il robot dispone di due stati. Quando, cancelli DNA inattivo sul due "labbra" esterni sono ibridate, assicurandosi che il robot rimane chiuso in modo tale che qualsiasi carico caricata all'interno di esso è sequestrato in modo sicuro. In presenza di proteina P, i cancelli aperti da uno tra diversi meccanismi (discusso sotto) consentendo al robot di aprire ed esporre il carico. Nel progettare la struttura, si consideri che il robot deve essere abbastanza flessibile da chiudersi su se stessa nello stato chiuso, e la molla allo stato aperto quando il gate consentirgli di farlo. Modellazione del comportamento di un DNA struttura integrando termodinamico e componenti meccanici è difficile, e l'oggetto reale potrebbe richiedere qualche miglioramento iterativo. Tuttavia, qui ci concentriamo sul processo di progettazione utilizzando un modello di lavoro in generale, che può essere costruito su.

Nota

Per una più completa comprensione del processo di progettazione DNA origami e piegatura, consigliamo vivamente la lettura del documento originale caDNAno da Douglas e colleghi ^19, che spiega la rappresentazione astratta del DNA nel design dell'interfaccia e come si riferisce alla struttura molecolare effettivo di un forma del DNA 3D. Questo documento è accompagnato da due video tutorial che descrivono la rappresentazione caDNAno e l'interfaccia in modo molto chiaro. Inoltre, si consiglia la lettura del più recente lavoro di Dietz e colleghi descrivono molti aspetti importanti e protocolli dettagliati del processo di piegatura, tra cui lo strumento di analisi Cando ^21.

tle "> 1. Scaricare e Installare caDNAno 2.0 e Autodesk Maya 2012

Nota: il software Autodesk è gratuito per gli studenti e l'uso accademico. Le istruzioni riportate di seguito includono la creazione di un account accademica di Autodesk.

1. Crea un account accademica presso http://students.autodesk.com/ . Dopo aver ricevuto la configurazione dell'account di posta elettronica, fare clic sul link di attivazione e di riempire le vostre preferenze, se lo desideri.
2. Scarica la versione gratuita di Maya 2012 dal centro di download.
3. Installare Maya 2012 sul vostro computer.
4. Esegui Maya una volta prima di installare caDNAno 2.0.
5. Scaricare e installare l'ultima versione di caDNAno 2.0 da http://cadnano.org/ .
6. Esegui Maya 2012. Un'icona caDNAno dovrebbe apparire in alto a destra dell'interfaccia utente grafica. Fare clic sull'icona per andare in caDNAno.

2. Outline la forma desiderata e Scaffold Strand Path

1. L'interfaccia di progettazione di caDNAno all'interno di Maya è composto da 3 pannelli (Figura 2):
   1. Pannello superiore: vista reticolo, in cui la forma è inizialmente delineato. Questo pannello consente di agire con doppia elica livello e fornisce una vista in sezione della forma.
   2. Pannello inferiore: pannello di editing, consentendo azioni di livello base singoli.
   3. Pannello di destra: un vero e proprio modello 3D Maya tempo generato della forma
2. Fare clic sull'icona "Honeycomb". Zoom in e fuori del reticolo nel pannello superiore può essere fatto scorrere il mouse su e giù, rispettivamente.
   caDNAno consente due possibili reticoli di progettazione, a nido d'ape e la piazza, in questo lavoro useremo il layout a nido d'ape, anche se il reticolo quadrato potrebbe essere generalmente utilizzato come bene ^22.
3. Iniziate disegnando la sezione della forma desiderata sul pannello di sinistra.
   Ogni cerchio rappresenta una doppia elica del DNA. Per chOOSE le eliche che costruiscono la forma, semplicemente lasciato fare clic sul loro centro (Figura 3). Continua a elica da helix finché l'intera forma è delineato. In alternativa, la forma può essere disegnato con il tasto sinistro del mouse e disegnare continuamente contorno della forma. Ogni azione può essere annullata facendo clic su menu Modifica e "Annulla", oppure la scorciatoia da tastiera CTRL + Z (PC) o CMD + Z (Mac).
   A questo punto, le eliche selezionate appariranno giallo. Allo stesso tempo, il pannello inferiore visualizzerà una vista laterale della forma, compresa di queste eliche. L'elica numerazione nel pannello inferiore è coerente con numerazione in quella superiore.
4. Osservare il pannello inferiore. Ogni elica è rappresentata da due file di quadrati: le righe sono i due filamenti della doppia elica, con ogni quadrato che rappresenta una base (Figura 4).
   La barra verticale arancione determina dove le azioni di modifica si svolgono lungo un elica. La posizione di base lungo la griglia viene visualizzata comeun numero sopra la barra arancione. Lunghezza predefinita Il quadro di elica è di 42 basi. La lunghezza può essere estesa, fare clic su una delle icone freccia grigia in alto a destra del pannello di modifica e scegliendo la lunghezza di estensione (in multipli di 21, che corrispondono a due giri completi dell'elica del DNA, in cui una volta si estende su 10,5 basi) (Figura 4). La griglia si estenderà alla direzione della freccia prescelta.
5. Per tracciare il percorso effettivo filone patibolo in tutta la forma, premere il pulsante del mouse, avviare dalla prima elica e andare continuamente su tutte le eliche seguendo lo stesso ordine inizialmente sono stati selezionati nella sezione 2.3. Si noti che:
   1. Le eliche selezionate questa volta assumerà un colore arancione.
   2. Nel pannello inferiore, impalcatura frammenti strand saranno estratti automaticamente le eliche selezionate.
   3. Il pannello di destra mostra il modello 3D della forma in fase di costruzione in tempo reale. Alla fine di questaprocesso, una bozza del percorso filone ponteggio sarà disegnata automaticamente nel pannello in basso (Figura 5).
6. Disegnare un rettangolo intorno a tutti i bordi più a sinistra del sentiero patibolo. Si noti che i bordi in modo selezionate appariranno rosso (Figura 6).
7. Estendere il tracciato scaffold trascinando i bordi selezionati come gruppo al lato sinistro della griglia. Ripetere questa procedura per i bordi destro fino a quando la strada è stata estesa. Notare che l'estensione impalcatura estende anche la forma 3D nel pannello di destra (Figura 7).
8. Individuare le parti di percorso impalcatura che sono isolati dal resto, e collegarli. Nella nostra forma, per esempio, eliche 0-9 costituiscono parte isolata. Helix 9 deve essere collegato ad elica 12 (si noti che eliche 9 e 10 non sono adiacenti a forma [pannello superiore] in modo che non possono essere collegati).
9. Ingrandire i fili da collegare, e utilizzando la funzione "Select" cliccare su un punto qualsiasi su unadei fili. Cliccando su un punto qualsiasi di un frammento patibolo blu, le icone 'ponte' compaiono tra eliche, che denota le posizioni dove sono ammessi gli attraversamenti. In queste posizioni, le basi in eliche adiacenti affrontano direttamente tra loro, permettendo che i filamenti di attraversare da elica a spirale senza deformare o torcere il DNA. Il numero visualizzato accanto a ciascuna icona ponte indica il numero di elica lo farà crossover (Figura 8).
10. Per creare incroci, a sinistra fare clic sull'icona ponte di scelta. Un crossover scaffold sarà generato, cioè l'impalcatura attraversa a questo punto da helix a elica (Figura 9). Ripetere questo processo fino a quando le attraversa tutte le impalcature eliche e crea un circuito chiuso che attraversa l'intera forma, senza lasciare le regioni che sono isolati dal resto della forma.
    Si noti che mentre crossover sembrano coprono una distanza nel software, in realtà non includono alcuna base del DNA. Fisicamente, il crossover"Ponte" contiene una sola unità fosfato del backbone DNA che lega le due basi dalle eliche adiacenti insieme.
11. Prima di passare alla fase successiva, accertarsi che l'intera impalcatura è continua, e nessuna parte di esso è isolato dagli altri.

3. Definire apertura Assi Meccanismo

Il robot descritto apre in risposta ad un ingresso biologica definita per esporre il suo carico. L'apertura avviene in maniera conchiglia, con due metà (eliche 0-29 compongono una metà, eliche 30-61 costituiscono la seconda metà) che ruota attorno a due assi. Gli assi sono formate da incroci tra eliche 29-30 e 61-0, che sono gli unici incroci tra le due metà e sono posizionati solo in o vicino al bordo sinistro della griglia. Il bordo destro conterrà i trefoli di gate (discusso sotto).

1. Cancellare il crossover esistente tra eliche 29-30. Per cancellare il crossover, fare clic sul punto "ginocchio" in uno strand.Questo lascia un nick in entrambi i filamenti in cui il crossover di una volta. Per cucitura il nick, premere MAIUSC e fare clic su ogni nick.
2. Creare un nuovo crossover tra eliche 29-30 il più vicino possibile al bordo sinistro della griglia (Figura 10).
3. Creare un nuovo crossover tra eliche 61 e 0 il più vicino possibile al bordo sinistro della griglia.

4. Definisci siti Carico utile

Dopo che avremo finito di tracciare il percorso filone patibolo, abbiamo bisogno di definire l'attaccamento payload (carico) siti. Caricamento dei siti sono infatti filoni fiocco che si estendono fuori dalle loro eliche come singolo 'rami' recuperabili. È quindi molto importante definire con precisione dove lungo l'elica si verifica questa ramificazione, per assicurarsi che si estende nella direzione desiderata. Se definiamo estensioni fiocco arbitrariamente, siti caricamento potrebbe avvenire sul lato esterno del robot invece del lato interno.

To Assicurarsi un fiocco estende a una direzione specifica soltanto, riportiamo un'elica aggiuntiva, che funge da guida per il direzionale ramificazione della graffa dal corpo principale. Dopo aver esteso il desiderato caricamento sito fiocco, l'elica guida viene rimosso.

1. Cerchiamo di definire quattro siti caricamento rivolti verso il lato interno del robot. I siti di carico si diramano su eliche 3, 27, 34, e 58. Per ogni sito, nel pannello superiore click elica immediatamente adiacenti a queste eliche che si affaccia sul lato interno (Figura 11). Questo aggiungerà le eliche per la griglia nel pannello inferiore. Non secondo clic ancora queste eliche.

5. Aggiungi e modifica Staples

1. Fare clic su "AutoStaple". Il software aggiungerà automaticamente sequenze discontinue in vari colori (Figura 12). Si noti che i punti metallici sono stati aggiunti alla forma 3D nel pannello di destra. Colori Staple sono coerenti per i pannelli di fondo e di destra. In additisu, c'è un indicatore nell'angolo in basso a sinistra dell'interfaccia, che indica un fiocco.
   Nota: graffette non può essere troppo lungo, troppo corto o circolare. La maggior parte dei punti metallici generata qui non rispondono a questi criteri, e devono essere modificati. Il primo passo nella loro modifica è automatica (vedi punto successivo).
2. Fare clic su "Riconoscimento automatico". Una finestra di dialogo si aprirà (Figura 13), che chiede per i parametri definiti dall'utente per questa azione:
   1. Lunghezza di destinazione (bp): lunghezza prevista di fiocco, se possibile,
   2. Lunghezza min (bp): lunghezza minima consentita per un fiocco
   3. Lunghezza massima (bp): lunghezza massima consentita per un fiocco
   4. Min dist a xover (bp): il numero minimo di coppie di basi un fiocco può attraversare tra il bordo e un crossover o tra due incroci.
      Utilizzare i parametri di default, fare clic su OK. Il software si romperà le graffette in base a questi parametri per il meglio delle sue capacità (Figura 14).
3. Cancellare tutti i crossover discontinue tra eliche 29-30 e 61-0, per consentire a questi eliche per separare e consentono al robot di aprire. Cancellazione di crossover discontinue richiederà qualche modifica manuale per punti metallici corrette che diventano troppo corti o irrazionale, come risultato di questa azione. Per farlo correttamente, seguire le istruzioni nelle sezioni successive.
   Assicuratevi di lasciare i crossover patibolo creati nelle sezioni 3.2 e 3.3 intatti.
4. Si consideri, ad esempio, il primo crossover pinzatura (ciano e nero graffette) da sinistra tra eliche 29 e 30 (Figura 15). Cancellare entrambi i ponti di questo crossover facendo clic su ogni punto di curvatura o ponte così appare rosso, poi cliccare su cancella (Figura 16).
5. Seam i due punti metallici sul elica 29 premendo MAIUSC e facendo clic sul nick tra di loro. Allo stesso modo, cucitura i tre punti metallici sul filo 30 ad un unico punto fermo (Figura 17). Staples puòessere esteso manualmente o accorciata di clic su un bordo e trascinandolo come desiderato. Fare attenzione a non circolare la qualsiasi punto fermo. Figura 18 mostra il divario tra eliche 29-30 dopo l'editing completo di crossover discontinue. Ripetere questa procedura per eliche 0 e 61, e modificare manualmente tutte le graffette in ogni elica.
6. Individuare punti metallici che sono disegnate da una linea spessa, nel senso che richiedono ulteriori modifiche. Esaminare ciascuno e correggere se necessario. Ad esempio, graffette che sono troppo brevi possono essere cancellati (Figura 19) o di estensione, se possibile.

6. Creare luoghi di carico e portoni

1. Secondo clic il carico eliche sito nel pannello in alto, e di estendere le risultanti patibolo frammenti di filo nel pannello in basso facendo clic su un bordo e trascinandolo a piacere (figura 20).
2. Aggiungere manualmente le graffette a questi frammenti patibolo ponendo la barra verticale arancione nella posizione desiderata lungo tegli patibolo, andando oltre le eliche guida sul pannello di sinistra, premuto SHIFT e cliccando. Questo aggiungerà un precursore fiocco in ogni elica (Figura 21).
3. Estendere i precursori discontinue di lunghezza e facendo clic e trascinando.
4. Individuare le icone ponte rosso, denotando accettati posizioni crossover tra il filamento guida (per esempio, elica 62) e il telaio (per esempio, elica 3).
5. Scegliere la posizione più comoda per introdurre un crossover e fare clic sull'icona ponte (Figura 22). Una posizione comoda richiede una minima modifica dei punti metallici esistenti nel telaio.
6. Nella guida elica (helix 62), eliminare la parte di base che non è una parte del sito di carico, e accorciare la parte partecipante alla lunghezza desiderata. La lunghezza desiderata dovrebbe fornire sia la specificità di caricamento dei diversi tipi di carico, e di forza vincolante. In genere, una coda di 18-mer dovrebbe andare bene. Assicurarsi che il punto fermo rimane drawn da una linea sottile, altrimenti modificarlo fino a quando non è.
7. Nel telaio, modificare i punti modificati se necessario.
8. Cancellare la guida (elica 62) lasciando solo l'estensione fiocco.
9. Ripetere i passaggi 6,4-6,8 per tutti i siti di carico (Figura 23).

7. Progettare Strands Cancello

I filamenti di gate sono i soli fili, tranne che per gli assi, collegando eliche 29-30 e 61-0. In contrasto con gli assi, i trefoli di gate non sono crossover. Piuttosto, si ibridano per formare un doppio filamento segmento che funge da sensore per l'ingresso biologica di scelta. Una volta che i due piani cancello sono sfollati, l'intero robot può entropicamente ruotare intorno agli assi e aperti.

1. Individuare le posizioni corrette per filoni cancello. Questi saranno graffette su eliche 29, 30, 61, e 0.
2. Per esempio, esaminare la regione 29-30 cancello. Ci sono convenienti filoni fiocco di accompagnamento eliche 29 e 30 dellato destro della griglia, che può essere utilizzato come filamenti di gate. Si noti che si trovano ad affrontare direzioni opposte.
3. Fare clic sul bordo di uno dei possibili filoni cancello di estenderlo al di fuori della forma. Se il bordo si trova sopra un crossover patibolo, la selezione potrebbe essere semplificata facendo in modo solo "Stap" (les) sono selezionabili, cliccando off "Scaf" (popolare) nella barra degli strumenti "selezionabili" in alto a destra dell'interfaccia .
4. Estendere due punti metallici per formare i filamenti del cancello. Modificare i punti metallici, se questa estensione richiede (Figura 24). Ripetere questa operazione per i fili del cancello di eliche 0 e 61.
   Si noti che, per ora, la durata effettiva non ha importanza, dal momento che il DNA del sensore (ad es aptamero) sostituirà le sequenze filo cancello in fase di completamento della sequenza.

8. Scegli Scaffold Sequence

1. Fare clic sullo strumento "Seq". Posizionare il cursore in qualsiasi punto il filo patibolo e fare clic su. Una finestra di dialogo si aprirà chiedendo discegliere l'origine del DNA ponteggio (Figura 25).
2. La scelta del DNA fonte molto dipende dalle dimensioni del robot. Ad esempio, M13mp18 ssDNA (p7249), e suoi derivati ​​estesi (p7308, ecc), che sono stati generalmente la scelta di forme di origami di DNA di grandi dimensioni, in forma quando il filamento patibolo è lunga ~ 7 kb. Se l'impalcatura della forma progettata è notevolmente più corta della sorgente scelta, l'eccesso impalcatura filamento che non è ibridato a qualsiasi fiocco creerà un loop di ssDNA sporgente dalla forma piegata. Anche se questo di solito comporta piccolo problema per cicli relativamente brevi, lunghi cicli multi-kb potrebbero drasticamente interferire con la piegatura e la funzione del robot. Quindi è importante per adattare la sorgente scelta per la forma lunghezza ponteggio.

Ad esempio, se il filo impalcatura necessaria per piegare una piccola forma è lunga ~ 1.600 basi, che è significativamente più breve rispetto alle fonti preimpostate nella finestra di dialogo, una sequenza personalizzata puòessere utilizzato come impalcatura. Più sorgenti possono essere considerati. Per esempio, il M13mp18 può essere digerito con un enzima di restrizione specifica che produce un frammento della lunghezza desiderata. Progettazione di una tale fonte può essere fatto a NebCutter ( http://tools.neb.com/NEBcutter2/ ) incollando la sequenza M13mp18 nella finestra di immissione NebCutter, e siti di restrizione di mappatura. Un'altra opzione è quella di utilizzare pre-digerito ssDNA, come ad esempio il phiX174 virione ssDNA HaeIII digest, disponibile dal New England Biolabs.

3. Nella finestra di dialogo, fare clic su "M13mp18". Si noti che la sequenza di DNA scelto è stato aggiunto al ponteggio e trefoli discontinue nel pannello inferiore.

9. ExpoRT Sequenza Staple come un foglio di calcolo

1. Fare clic su "Esporta" nella barra degli strumenti in alto, e scegliere un nome file di destinazione per l'elenco fiocco. Fare clic su "Salva".
2. Individuare il file di destinazione. Csv e aprirlo.
3. Il foglio elettronico mostra l'elenco fiocco, che può essere inviato come è ad una società di sintesi di DNA. Le prime due colonne mostrano le coordinate di inizio e fine, con il numero di fuori delle parentesi denotano numero elica e il numero tra parentesi che indicano la posizione di base.

10. Assegnare Cancello ed Loading Sequenze

1. Nell'elenco fiocco, si noterà che alcune sequenze di iniziare o finire con una serie di punti interrogativi "?????". Questi punti interrogativi indicano che dal momento che nessun filone impalcatura si ibrida con queste specifiche regioni discontinue, non possono essere assegnati sequenze complementari. Queste sono infatti le estensioni che abbiamo disegnato per i fili del cancello e siti di caricamento, e quindi questi devono essere assegnati manualmente ora. Uscita:
   1. I cancelli determinano la natura dell'ingresso biologico su cui il robot passa da inattivo ad attivo ed esporre stato suo payload. Ogni paratoia singola dsDNA può codificare risposta ad un ingresso biologica (o più), quindi un profilo di input richiesti per l'attivazione robot può essere definito.
      Supponiamo per questo esempio che la stecca biologico innesco dell'attivazione robot è un enzima di restrizione, che potrebbe indicare la presenza di batteri infettivi.
   2. In primo luogo ritengono che il cancello ssDNA filoni non ibridano subito dopo la ramificazione delle loro eliche. Progettare il cancello altrimenti potrebbe impedire l'ibridazione durante la piegatura. Pertanto, ogni ramo dovrebbe iniziare con una stringa di distanziatore. Usiamo tipicamente poli-T come stringhe distanziatori, come questa sequenza fornisce flessibilità.
   3. Si assume anche che la lunghezza della regione di ibridazione cancello è 20 basi, contenente la restrizione sedere bersaglioe nel suo mezzo.
   4. Pertanto il cancello potrebbe essere simile a questo:
      [Helix 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTxxxxxxGCTAGAG-3 '
      [Helix 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAxxxxxxCGATCTC-5 '
      Il "....." denota la regione di base che si ibrida con il filamento impalcatura, quindi ha una sequenza già e non deve essere cambiato.
      Il duplex random "GTGAGTT" e il suo complemento assicura il sito di restrizione non è parzialmente aperto, e offre alcune basi supplementari per accertarsi digestione efficace dall'enzima.
      La "x" indica il sito di restrizione.
      Il duplex random "GCTAGAG" e il suo complemento fornire alcune basi extra per l'enzima di lavorare in modo efficiente, ma assicura anche il filamento cancello sia sufficientemente lungo da garantire una buona chiusura robot.
      Prima di scegliere un sito di restrizione come destinazione, assicurarsi che l'intera struttura del robot, luoghi di carico e di altra parte del cancello stesso non sono digeriti dalenzima scelto. In questo esame, il NEBCutter elenco 0-cutter (enzimi che non tagliano l'intera sequenza) evidenziato EagI, isolato dal Enterobacter Pantoea agglomerans, come un potenziale enzima che potrebbe indicare la presenza di un contagioso enterobatteri.
   5. Il cancello ora si presenta così (giallo sito di restrizione marchi EagI):
      [Helix 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTCGGCCGGCTAGAG-3 '
      [Helix 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAGCCGGCCGATCTC-5 '
      Si noti che questo motivo presuppone che dopo la digestione, la sequenza "GTGAGTTCGG" (T _m = 32 ° C) non è sufficientemente lungo o termodinamicamente stabile da tenere chiuso il robot più. Questa ipotesi sarà probabilmente bisogno di essere verificata sperimentalmente.
   6. Il secondo cancello può essere lo stesso, nel qual caso il robot rispondere soltanto ad un enzima, o può essere progettato con un sito diverso, aumentando specificità del robot. Altri siti di restrizione possono essere aggiunti sullo stesso filone, in cordonatura la complessità e la specificità del robot.
2. Caricamento dei siti:
   1. Il sito di caricamento può essere una sequenza universale. In alternativa, i siti di caricamento possono essere basati su sequenze uniche, che diminuirà la modularità, ma migliorare il controllo dell'orientamento del carico e dei coefficienti (per i diversi tipi di carico).
   2. Infine, il carico oligonucleotidi sito devono includere un gruppo chimico funzionale permettendo loro di coniugare con qualsiasi payload: proteine, nanoparticelle, ecc Assicurarsi che il gruppo chimico è montato sull'estremità corretta (5 'o 3'), secondo la direzione fiocco .

11. Simulare Risultati in CANDO

1. Dopo che il lavoro viene salvato come un file. Json, può essere caricato CANDO per l'analisi. CANDO è una simulazione basata su elementi finiti della struttura del DNA che può stimare la sua rigidità e stabilità in soluzione ^21.
2. Vaiami.org / "target =" _blank "> http://cando-dna-origami.org/
3. Fare clic su "Invia un file caDNAno per l'analisi" e di riempire tutte le informazioni necessarie.
4. Analisi in CANDO richiede solitamente fino a 15-20 min. Alla fine, un messaggio di posta elettronica ci fa sapere l'analisi è completa, che fornisce un link per scaricare i risultati della simulazione (Figura 26).

12. Ordine del DNA e Fold the Robot

Una volta che il processo di progettazione è completa e l'analisi CANDO mostra previsione soddisfacente del prodotto, l'elenco filo fiocco generata in sezioni 9-10 può essere ordinato. Tipicamente, trefoli fiocco non richiedono particolare purificazione, tuttavia, si raccomanda che impieghi speciali filamenti quali cancellate o siti carico, essere purificati mediante HPLC.

La procedura seguente ordine DNA, cioè piegatura, la purificazione e la valutazione dei prodotti, compresa visualizzazione della struttura ripiegata da una forza atomicamicroscopia (AFM) o microscopia elettronica a trasmissione (TEM) sono al di fuori del campo di applicazione del presente documento, e può essere trovato nelle precedenti relazioni ^17,18,20,21. Una immagine TEM del robot progettato qui viene portato come esempio (Figura 27). Preparazione e colorazione del campione è stata eseguita esattamente come descritto altrove ^21.

Representative Results

Figure 1-25 sono schermate dell'interfaccia caDNAno 2.0 che mostra il processo di progettazione passo-passo. La sezione trasversale della forma è stato illustrato (figura 3), seguito da aggiunta automatica di scaffold frammenti filamento e completamento dell'intero percorso ponteggio (Figura 7). Filoni Staple vengono aggiunti automaticamente (Figura 12), suddivisi in base a parametri definiti dall'utente (Figura 14), e modificato manualmente per adattarsi alle graffette per la funzione desiderata del dispositivo (figure 15-18). Figure 23-24 descrivono come carico sito e fili del cancello vengono aggiunti e modificati. Infine, la Figura 27 mostra una immagine TEM del modello progettato qui.

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Figura 1. Un modello 3D del robot finito, progettato da caDNAno 2.0 e generata da Autodesk Maya 2012.

Figura 2. Vista la 2.0/Autodesk Maya interfaccia di disegno 2012 caDNAno. Pannello superiore: Pannello grata per delineare la forma iniziale. Pannello inferiore: pannello di editing. Pannello di destra:. Generatore modello 3D (vedi sezione 2.1) Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 3. Disegnare la sezione della forma sulla parte superiore paNel (vedi sezione 2.3).

Figura 4. Il pannello di caDNAno 2,0 inferiore (editing). La barra verticale arancione determina dove insieme si verificheranno le azioni di modifica della griglia. Le frecce grigie nella parte in alto a destra sono utilizzati per estendere la rete ai lati (vedere paragrafo 2.4).

Figura 5. Una bozza del filone patibolo dopo la prima bozza nel pannello superiore (vedere il paragrafo 2.5). Clicca qui per ingrandire la figura .

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Figura 6. Selezione di tutte le impalcature filo bordi del percorso e l'estensione del percorso fino alla lunghezza desiderata (vedi paragrafo 2.7).

Figura 7. Una visione generale dei pannelli di fondo e di destra che dimostrano come cambia il modello 3D in tempo reale insieme ad azioni di modifica. Clicca qui per ingrandire la figura .

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Figura 8. Le icone blu ponte tra eliche indicano le posizioni in cui sono consentite impalcatura crossover (icone rosse si riferiscono a crossover discontinue e non vengono ancora visualizzati, vedere la sezione 2.9).

Figura 9. Creare nuova impalcatura crossover facendo clic sulle icone a ponte di scelta (vedi paragrafo 2.10).

Figura 10. Creazione di un asse (un crossover una vicina possibile al lato sinistro della griglia) tra eliche 29 e 30 (vedere paragrafo 3.2).

Figura 11. Aggiunta di eliche che guidano la ramificazione dei siti di caricamento (vedere paragrafo 4.1).

Figura 12. Il progetto, dopo l'azione "AutoStaple". I colori di base nella parte inferiore del pannello e il pannello di destra sono in linea (vedere paragrafo 5.1). Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 13. Il dialogo "Riconoscimento automatico" in cui il utente può definire i parametri di Riconoscimento automatico (vedere paragrafo 5.2).

Figura 14. L'progetto dopo l'azione "Riconoscimento automatico" (vedere paragrafo 5.2). Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 15 modifica manuale dei punti metallici I:. Localizzare punti metallici che attraversano da elica 29 e 30 e devono essere eliminati.

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Figura 16 modifica manuale dei punti metallici II:. Eliminando i ponti tra i punti metallici situati.

Figura 17 modifica manuale dei punti metallici III:. Aggraffatura i nick lungo graffette frammentati (vedi sezione 5.5).

Figura 18. L'intero spazio tra eliche 29-30 che non mostrano crossover collegare i due (vedi sezione 5.5). Clicca qui per ingrandire la figura .

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Figura 19. Editing manuale delle graffette disegnato in linea spessa (che denota che sono o troppo corto, troppo lungo o circolare, vedere la sezione 5.6).

Figura 20. Aggiunta di eliche guida per il caricamento del sito ramificazione (vedere paragrafo 6.1). Clicca qui per ingrandire la figura .

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Figura 21. Aggiunta manuale dei filoni fiocco alle eliche di guida, così i punti di ramificazione possono essere localizzati (vedere paragrafo 6.2). Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 22. L'introduzione di un luogo carico di crossover al robot telaio patibolo in una posizione comoda (quella che richiede una minima modifica del telaio punti metallici, vedere paragrafo 6.5).

Figura 23. Vista del caricamento graffette sito come visto in thpannello di fondo e dopo aver tolto le eliche di guida, che non sono più necessario (vedere paragrafo 6.9).

Figura 24. Estendere due punti metallici, che stanno per essere utilizzati come fili del cancello, da eliche 29 e 30. Si noti che i due filamenti fronte direzioni opposte, che è obbligatorio per la formazione del duplex cancello (vedi sezione 7.4). Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 25. La sequenza impalcatura aggiunta (funzione "Seq") il dialogodialogo che consente di scegliere uno di ponteggi predefiniti, oppure di inserire una sequenza personalizzata (vedere paragrafo 8.1).

Figura 26. Risultati dell'analisi CANDO del disegno qui descritti. La simulazione genera un archivio. Zip contenente i vari file che forniscono le informazioni richieste. Ecco le (root mean square fluttuazione) file rmsf (. Png) sono raffigurati, mostrando un modello di progettazione da 3 angoli di vista, colorato secondo la chiave dettagliato nel file allegato denominato "HeatMap4RMSF.txt". In questo caso, almeno RMSF (più blu) è 1,03 nm, e il 95% RMSF (redest) è 3.19 nm. Il gradiente di colore attraverso il modello deriva dalla polarità del robot (gates di 'fronte', asse in 'indietro') e il fatto che i punti sono connessione lungo eliche 29-30 e 61-0, provocando il 'front 'lato a fluttuare più che il' back 'lato.

Figura 27. Immagine TEM del robot progettato in questo articolo. Preparazione e colorazione del campione è stata eseguita esattamente come descritto altrove ^21.

Discussion

Origami di DNA ci permette di fabbricare oggetti accuratamente definiti funzioni arbitrarie su scala nanometrica. Un importante passo successivo sarà l'integrazione della funzione in questi disegni. Mentre molte applicazioni e le sfide possono essere affrontate con questa tecnologia, vi è un particolare interesse per la fabbricazione di robot terapeutici e scientifici da origami di DNA, in quanto questi rappresentano un ambiente naturale di DNA. DNA si interfaccia già con macchine molecolari in cellule come una informazione genetica supporto di memorizzazione. Interessante, il DNA ripiegato in un nanorobot o un'altra macchina può ancora servire come informazione genetica oltre ad essere un materiale di costruzione, che può essere trasmessa alla espressione di una proteina desiderata dopo la nanorobot disintegra, come parti di una sequenza di uscite.

Nell'esempio descritto in questo documento, si usa un enzima di restrizione per azionare il robot. Tuttavia, ulteriori meccanismi con cui i robot di DNA possono respond per ingressi sono i seguenti.

Riconoscimento molecolare: noi recentemente dimostrato cancelli aptamer-based per robot DNA che riconoscono molecole di proteina sulla superficie di cellule bersaglio ^20. Aptamers possono essere selezionate in vitro con metodi quali SELEX ^23, in outsourcing da società, o utilizzate dal database aptamero ( http://aptamer.icmb.utexas.edu/ ). Quando sono impiegati aptameri, è importante considerare che il filamento complementare al aptamer, che forma insieme il cancello, può essere progettato per includere disallineamenti, che faciliteranno legame del ligando del aptamer e spostamento del filamento complementare. Mentre il meccanismo che consente ciò è sconosciuta, la sensibilità e la specificità di un cancello aptamer-based possono essere sintonizzati aumentando o diminuendo la% di disallineamento tra i due filamenti, di ottenere sia una molto severi ma inefficiente cancello, o un digiunoma uno che perde.

Clivaggio enzimatico: per questo, le porte devono essere progettati in modo tale che essi contengono il substrato di questo enzima. Ad esempio, un piccolo peptide substrato di una proteasi può essere legato da entrambi i lati al cancello, che manterrà il robot chiuso in assenza dell'enzima.

Telecomando: un approccio potenziale che non è stata applicata alle macchine del DNA sta usando una antenna nanocristalli d'oro in un campo elettromagnetico ad alta frequenza per indurre dsDNA di fusione ^24. Ciò può fornire un interruttore azionato dall'utente in aggiunta a quelli bio-responsive. Sebbene DNA origami robot sono relativamente semplici da progettare e realizzare, pongono diversi problemi tecnici come piattaforma terapeutica. DNA non è un materiale ideale per la consegna della droga in quanto è altamente vulnerabile alla scissione da nucleasi. Inoltre, potrebbe precipitare una risposta immunitaria. Uno studio approfondito del comportamento degli oggetti origami di DNA in un organismo è needed per definire il loro destino e fare in modo che non fanno aggregato nei tessuti o integrano nel genoma dell'ospite.

In sintesi, abbiamo presentato l'uso di caDNAno, un semplice, robusto strumento CAD per la progettazione di DNA origami. Speriamo di iniziare a vedere la ricerca application-driven in origami di DNA, in settori come la terapeutica, l'energia, metamateriali, e l'istruzione. In tutti questi luoghi, caDNAno dovrebbe avere un impatto significativo sulla realizzazione delle soluzioni. In futuro, potrebbe diventare uno standard industriale e di design, che può essere sostituita (o parti del quale possono) da qualsiasi utente perché sono tutti compatibili.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autodesk Maya 2012	Autodesk		A student/academic account needs to be created first (see platform-specific instructions in http://cadnano.org)
caDNAno 2.0 (software)	(Open source)		Software for the design of DNA origami structures http://cadnano.org
Cando (webpage)	(Open source)		Webpage running a simulator of DNA origami shapes http://cando-dna-origami.org