Summary
ДНК-оригами является мощным методом для изготовления точных наноразмерных объектов путем программирования самосборки молекул ДНК. Здесь мы описываем как оригами ДНК могут быть использованы для разработки робота робота с возможностью восприятия биологические сигналы и реагировать на изменения формы, впоследствии передаются желаемого эффекта.
Abstract
Нуклеиновые кислоты являются удивительно универсальны. В дополнение к своей естественной роли в качестве носителя для биологической информации 1, они могут быть использованы в параллельных вычислений 2,3, распознавать и связывать молекулярных или клеточных мишеней 4,5, катализируют химические реакции 6,7 и генерировать рассчитывается реакций в биологических Система 8,9. Важно отметить, что нуклеиновые кислоты могут быть запрограммированы на самоорганизуются в 2D и 3D структур 10-12, что позволяет интегрировать все эти замечательные функции в одном робот связывающих зондирования биологических сигналов до заданного ответа с целью оказания желаемого эффекта.
Создание фигур из нуклеиновых кислот был впервые предложен Seeman 13, и несколько вариаций на эту тему с тех пор было реализовано с использованием различных методов 11,12,14,15. Однако самым значительным, пожалуй, один предложенный Ротемунд, называемые ДНК-оригами scaffolded16. В этом способе сворачивания длинных (> 7000 оснований) одноцепочечной ДНК "лесов" относится к желаемой форме на сотни коротких комплементарных нитей называют "скобы. Складные осуществляется отжига рампы. Этот метод был успешно продемонстрировали в создании разнообразных 2D формы с удивительной точностью и надежностью. ДНК-оригами позже была распространена на 3D, а 17,18.
В настоящем документе основное внимание будет уделено программным обеспечением caDNAno 2,0 19 разработана Дугласом и коллег. caDNAno это надежный, удобный инструмент, позволяющий CAD проектирования 2D и 3D форм ДНК-оригами с универсальными функциями. Процесс проектирования опирается на систематические и точные абстракции схема структуры ДНК, что делает его относительно простым и эффективным.
В данной работе мы демонстрируем конструкцию ДНК-оригами Н.А.norobot, который был недавно описан 20. Этот робот является "роботом" в том смысле, что она связывает зондирования на приведение, для того, чтобы выполнить задачу. Поясним, как различные схемы зондирования может быть интегрирован в структуру, и как это может быть передана желаемого эффекта. Наконец, использование Cando 21 для имитации механических свойств заданной формы. Концепция, которую мы обсудим может быть адаптирована к нескольким задачам и параметрам.
Protocol
Робот мы создадим в этой статье реагирует с белком P путем грузовой C доступны связываются с рецепторами на поверхности выбранной клетки-мишени. Робот показано на рисунке 1 C может быть рецептор блокировки наркотиков;. Т.д. фактор роста, и способ химически связать с ДНК олигонуклеотид должен быть доступен который не разрушает его функции. Робот имеет два состояния. В неактивном состоянии ДНК ворота на двух внешних "губы" гибридизованы, убедившись, что робот остается закрытым, что любой груз загружается в нем надежно поглощенным. В присутствии белка Р, ворота открыты либо один из нескольких механизмов (см. ниже), что позволяет роботу, чтобы открыть и подвергать груза. При проектировании структуры, считают, что робот должен быть достаточно гибким, чтобы закрыть на себя в закрытом состоянии, и весной в открытое состояние, когда ворота позволить ему сделать это. Моделирование поведения ДНК Структура интеграции термодинамические и механические компоненты трудно, а реальный объект может потребоваться некоторое улучшение итеративным. Тем не менее, здесь мы сосредоточимся на процессе проектирования использованием общей рабочей модели, которая может быть построен на.
Внимание
Для более полного понимания процесса ДНК-оригами дизайн и складывающиеся, мы настоятельно рекомендуем прочитать оригинальную бумагу caDNAno Дуглас и его коллеги 19, который объясняет абстрактное представление ДНК в дизайне интерфейса и как он относится к фактическому молекулярной структуры 3D формы ДНК. Эта статья в сопровождении двух видео-уроки описывающих представление caDNAno и интерфейс в очень ясный путь. Кроме того, мы рекомендуем прочитать более недавней работе Dietz и коллеги описания многих важных аспектов и подробные протоколы процесса складывания, в том числе Cando инструмент анализа 21.
TLE "> 1. Скачайте и установите caDNAno 2.0 и Autodesk Maya 2012Примечание: Autodesk программное обеспечение является бесплатным для студентов и академического использования. Приведенные ниже инструкции включают в себя создание академических счет в Autodesk.
- Создание учетной записи на академическую http://students.autodesk.com/ . После получения настройки учетных записей электронной почты, нажмите на ссылку активации и введите свой гамму.
- Скачать бесплатную версию Maya 2012 из центра загрузки.
- Установить Maya 2012 на вашем компьютере.
- Выполнить Майе раз перед установкой caDNAno 2.0.
- Загрузите и установите последнюю версию caDNAno 2.0 http://cadnano.org/ .
- Запустите Maya 2012. CaDNAno должен появиться значок в правом верхнем углу графического пользовательского интерфейса. Нажмите на иконку, чтобы войти в caDNAno.
2. OutlИне нужную форму и лесов Strand Путь
- Дизайн интерфейса caDNAno в Maya включает 3 панели (рис. 2):
- Верхняя панель: вид решетки, где форма первоначально изложил. Эта панель обеспечивает двойную спираль действия на уровне и обеспечивает вид в разрезе форму.
- Нижняя панель: Панель редактирования, что позволяет одной базовой уровне действий.
- Справа: Майя генерируемые реальной модели 3D время форма
- Нажмите кнопку "Соты" икону. Увеличение изображения и из решетки на верхней панели может быть сделано путем прокрутки мыши вверх и вниз соответственно.
caDNAno позволяет двум возможным решетки дизайн, сотовая и квадратные, и в этом документе мы будем использовать виде пчелиных сот, хотя квадратной решетки могут быть как правило, используется, а 22. - Сначала чертеж части нужную форму с левой панели.
Каждый круг представляет собой двойную спираль ДНК. Чтобы CHOOSE спиралей, которые строят свою форму, просто щелкните левой кнопкой мыши на их центр (рис. 3). Продолжить спирали спирали, пока вся форма не описана. Кроме того, формы можно сделать, нажав на левую кнопку мыши и непрерывно контурный рисунок фигуры. Любое действие можно отменить, нажав кнопку Изменить меню и "Undo", или сочетание клавиш CTRL + Z (ПК) или Ctrl + Z (Mac).
На данный момент, выбранный спиралей появится желтый. В то же время нижняя панель отображает вид сбоку формы, состоящий из этих спиралей. Спирали нумерации в нижней панели соответствует нумерации в верхний. - Обратите внимание на нижнюю панель. Каждая спираль представлена двумя рядами квадратов: строки двух нитей двойной спирали, с каждого квадратного представляющий основание (рис. 4).
Оранжевая вертикальная черта определяет, где редактирования действия происходят по спирали. Основной позиции по сетке появляется какчисло выше на оранжевом поле. Длина по умолчанию спирали фреймворка составляет 42 баз. Длина может быть расширен, нажав одну из серые значки стрелку в правом верхнем углу панели редактирования и выбора удлинение (в упаковке 21, которым соответствуют два полных оборота спирали ДНК, в которых один оборот охватывает 10,5 основаниями) (рис. 4). сетка будет распространяться на направление выбранной стрелки. - Для построения фактической пряди эшафот путь всей форме, нажмите кнопку мыши, начинается с первой спиралью и идти непрерывно в течение всей спирали в том же порядке, как они были первоначально выбраны в разделе 2.3. Обратите внимание, что:
- Спиралей выбрана на этот раз будет менять цвет на оранжевый.
- В нижней панели, фрагменты леса нить будет автоматически обращается в выбранной спиралей.
- Правая панель показывает 3D модель формы строятся в реальном времени. В конце этогоПроцесс, проект путь прядь эшафот будет автоматически обращается в нижней панели (рис. 5).
- Нарисуйте прямоугольник вокруг всех левых ребер пути эшафот. Обратите внимание, что края так, выбранные появится красный (рис. 6).
- Расширение путь леса путем перетаскивания выбранных ребер как группа с левой стороны сетки. Повторите эту процедуру для правого края, пока маршрут не будет вытянута. Обратите внимание, что эшафот расширение также расширяет 3D форму в правой панели (рис. 7).
- Найти путь эшафот частей, которые изолированы от остальных, и соединить их. В нашем форму, например, спиралей 0-9 образуют изолированную часть. Helix 9 должен быть подключен к спирали 12 (обратите внимание, что спирали 9 и 10 не являются смежными в форме [верхнюю панель] поэтому они не могут быть подключены).
- Увеличить на нити быть на связи, и, используя "Выбор" инструментом нажмите на любую точку на одномнитей. После нажатия любой точке вдоль синей фрагмент леса, иконы «мостом» появляются между спиралями, обозначая позиции, где кроссоверы допускается. На этих постах баз в соседних спиралей сталкиваются друг с другом напрямую, позволяя нитей перебраться из спирали спирали без деформации или скручивания ДНК. Число появляющихся рядом друг с моста символе показывает количество спирали это будет кроссовер (рис. 8).
- Для создания кроссоверов, щелкните левой кнопкой мыши значок моста выбора. Кроссовер эшафот будет сгенерирован, то есть на эшафот пересекает в этот момент из спирали спирали (рис. 9). Повторите этот процесс до леса пересекает все спиралей и создает замкнутую петлю, которая охватывает всю форму, не оставляя областей, которые изолированы от остальной части формы.
Следует отметить, что в то время как кроссоверы видимому, охватывают расстояние в программном обеспечении, в действительности они не содержат никаких оснований ДНК. Физически, кроссовер«Моста» содержит только один фосфат единицу остова ДНК, которая связывает две базы из соседних спиралей вместе. - Прежде чем перейти к следующему шагу, убедитесь, что все леса непрерывно, и ни одна часть его не изолирован от других.
3. Определить механизм открытия топоры
Описанные робот открывается в ответ на определенный биологический вход подвергать его полезной нагрузки. Открытие происходит в оболочке-образной манере, с двумя половинами (спирали 0-29 составляют половину, спиралей 30-61 составляют вторую половину) вращается вокруг двух осей. Оси образованы кроссовера между спиралей 29-30 и 61-0, которые являются только кроссоверы между этими половинами и расположены только в или близко к левому краю сетки. На правой боковой поверхности будет содержать ворота нити (см. ниже).
- Очистить имеющуюся кроссовер между спиралями 29-30. Чтобы стереть кроссовер, нажмите кнопку "колена" в любой точке цепи.Это оставляет Ник в обеих цепях, где кроссовер раньше. Чтобы шов ники, нажмите SHIFT и щелкните каждый ник.
- Создайте новый кроссовер между спиралями 29-30 как можно ближе к левому краю сетки (рис. 10).
- Создание нового кроссовера между спиралей 61 и 0 как можно ближе к левому краю сетки.
4. Определить Грузоподъемность Сайты Вложений
После того как мы закончили построение пути эшафот нить, мы должны определить полезную нагрузку привязанности (загрузки) сайтов. Погрузочных площадок, на самом деле основные ниточки, тянущиеся из своих спиралей как одноцепочечной «ветви». Поэтому важно определить очень точно, где по спирали это ветвление, чтобы убедиться, что она распространяется на нужном направлении. Если мы определим основной расширения произвольно, погрузка сайты могут возникать на внешней стороне робота, а с внутренней стороны.
TO убедиться, что основной распространяется на конкретном направлении, мы участок дополнительно спираль, которая служит в качестве направляющих для направленной разветвленности основной от основного корпуса. После расширения желаемый основной погрузочной площадке, направляющая спираль удаляется.
- Определим 4 загрузки сайтов, обращенной к внутренней стороне робота. Погрузочных площадок будет разветвляться спиралей из 3, 27, 34, и 58. Для каждого сайта, на верхней панели нажмите спирали в непосредственной близости от этих спиралей, которая обращена к внутренней стороне (рис. 11). Это позволит добавить спиралей к сетке в нижней панели. Не второй защелки этих спиралей еще.
5. Добавлять и редактировать Staples
- Нажмите кнопку "AutoStaple". Программное обеспечение будет автоматически добавлять основных последовательностей в различных цветах (рис. 12). Обратите внимание, что скобы, которые были добавлены в 3D-форму в правой панели. Скоба цвета соответствуют для нижней и правой панелей. В дополнительна, есть индикатор в левом нижнем углу интерфейса, что указывает на главный продукт.
Примечание: продукция не может быть слишком длинным, слишком короткая или круглая. Большая часть скобы генерируется здесь не отвечают этим критериям, и должны быть отредактированы. Первый шаг в возможности их изменения автоматической (см. следующий шаг). - Нажмите кнопку "автопрерыванием". Диалоговое окно откроется (рис. 13), прося пользовательских параметров для этого действия:
- Цель длине (АД): ожидаемая продолжительность основных возможности
- Минимальная длина (АД): минимальная допустимая длина основной
- Максимальная длина (BP): максимальная допустимая длина основной
- Минимальное расстояние до Xover (АД): минимальное число пар оснований основным может пройти между его краем и кроссовер или между двумя кроссоверами.
Используйте параметры по умолчанию, нажмите кнопку ОК. Программное обеспечение будет сломать скобы в соответствии с этими параметрами в меру своих возможностей (рис. 14).
- Удаление всех основных кроссоверов между спиралями 29-30 и 61-0 с тем чтобы эти спирали для разделения и включите робота открыть. Стирание основных кроссоверы потребует некоторого ручного редактирования для исправления скобы, которые становятся слишком короткими или иррациональное в результате этого действия. Чтобы сделать это правильно, следуйте инструкциям в следующих разделах.
Не забудьте оставить на эшафот кроссоверы созданы в разделах 3.2 и 3.3 нетронутыми. - Рассмотрим, например, первый основной кроссовера (голубого и черного скобы) из левого между спиралей 29 и 30 (фиг. 15). Стереть обоих мостах этого кроссовера, щелкнув каждую точку перегиба или моста, чтобы он отображался красный, затем нажать Delete (рисунок 16).
- Шов двумя скрепками на спирали 29, нажав SHIFT и нажав на ник между ними. Кроме того, три шва на нить скобы 30 к одной основной (рис. 17). Скобы могутвручную продлен или сокращен, нажав край и перетащить его по желанию. Будьте осторожны, не рассылать любые главный продукт. На рисунке 18 показано разрыв между спиралями 29-30 после полного редактирования основных кроссоверов. Повторите этот процесс для спиралей 0 и 61, и вручную редактировать все скобы в каждой спирали.
- Найдите скобы, которые взяты жирной линией, означает, что они требуют дальнейшего редактирования. Изучите каждый из них и исправьте, если необходимо. Например, скобы, которые слишком коротки могут быть удалены (рисунок 19) или увеличить, если это возможно.
6. Создать погрузочных площадок и Гейтс
- Второй щелкните загрузки сайта спиралей на верхней панели, а также продлить полученную прядь эшафот фрагментов в нижней панели, нажав край и перетащить его в требуемое положение (рис. 20).
- Вручную добавить скобы эти строительные леса фрагментов путем размещения оранжевый вертикальной панели в нужном положении вдоль тОн эшафот, переходя руководство спиралей на левой панели, держа SHIFT и нажав. Это добавит основным предшественником на каждой спирали (рис. 21).
- Расширение основных прекурсоров на всю длину, а, нажав и перетащив.
- Местонахождение красные значки моста, обозначая разрешено кроссовера позиции между направляющей нити (например, спирали 62) и шасси (например, спирали 3).
- Выберите наиболее удобное расположение ввести кроссовер и нажмите на значок моста (рис. 22). Удобное расположение требует минимального редактирования существующих скобы в шасси.
- В направляющую спираль (спирали 62), удаление основной части, которая не является частью сайта загрузки, а также сократить участвующих часть до нужной длины. Нужной длины должна обеспечивать как специфичность для погрузки различных грузов, а также прочность связывания. Как правило, 18-мерных хвоста должно быть прекрасно. Убедитесь, что основным остается ДРАWN тонкой линией, иным образом изменить его, пока не будет.
- В ходовой, редактировать измененные продукты, как необходимо.
- Сотрите направляющие (Helix 62) оставив только основные расширения.
- Повторите шаги 6.4-6.8 для всех погрузочных площадок (рис. 23).
7. Проектирование Ворота Пряди
Ворота нити являются единственной нити, за исключением оси, связывая спиралей 29-30 и 61-0. В отличие от оси, затвор нити не кроссоверов. Скорее они гибридизуются с образованием двухцепочечной сегмент, который служит в качестве датчика для биологической вход выбора. Когда затвор дуплексы смещены, весь робот может энтропийно вращаются вокруг оси и открытым.
- Найдите правильное положение для ворот прядей. Они будут скобы 29 спиралей, 30, 61 и 0.
- Например, изучить 29-30 воротами региона. Есть удобные основных нитей фланговые спиралей 29 и 30 направой стороне сетки, которые могут быть использованы в качестве ворот нитей. Обратите внимание, что перед противоположных направлениях.
- Нажмите на краю одного из потенциальных нити ворот расширить его за пределы формы. Если край лежит над кроссовером эшафот, его выбор может быть упрощен, убедившись, только "Stap" (LES) можно выбрать, нажав OFF "Scaf" (диван) в "Выбор" на панели инструментов в верхней правой части интерфейса .
- Расширение обе скобы для формирования ворота нитей. Редактировать скобы, если это расширение требует этого (рис. 24). Повторите эту процедуру для ворот нитей спиралей 0 и 61.
Обратите внимание, что на данный момент, фактическая длина не имеет значения, поскольку датчик ДНК (например аптамер) заменит последовательности ворот прядь на стадии завершения последовательности.
8. Выберите Леса Последовательность
- Нажмите кнопку "Seq" инструмент. Поместите курсор в любом месте на эшафот прядь и нажать кнопку. Откроется диалоговое окно просят насвыбрать источник эшафот ДНК (рис. 25).
- Выбор источника ДНК во многом зависит от робота размера. Например, M13mp18 оцДНК (p7249), а его расширенном производных (p7308 т.д.), которые обычно были выбор для больших форм оригами ДНК, пригодные когда нить леса составляет ~ 7 кб в длину. Если помост заданной формы значительно короче, чем выбранный источник, избыток нити каркас, который не гибридизуется с любой основной создаст петлю оцДНК выступающие из сложенной форме. Хотя это обычно не представляет большой проблемой для относительно коротких циклов, мульти-кб длинные петли может резко мешать складной и функции робота. Поэтому важно, чтобы соответствовать выбранным источником с длиной форма леса.
Например, если нити эшафот необходимо сложить небольшой форма ~ 1600 баз длиной, который значительно короче, чем в предустановленных в диалоговом окне пользовательского последовательность можетиспользоваться в качестве лесов. Некоторые источники могут быть рассмотрены. Например, M13mp18 могут быть переварены с определенным ферментом рестрикции, который производит фрагмент нужной длины. Проектирование такого источника может быть сделано в NebCutter ( http://tools.neb.com/NEBcutter2/ ) путем вставки последовательности M13mp18 В окне NebCutter ввода и отображения сайтов рестрикции. Другой вариант заключается в использовании предварительно переваривается одноцепочечной ДНК, такие как phiX174 одноцепочечной ДНК вириона HaeIII дайджеста, доступный от New England Biolabs.
- В диалоговом окне нажмите кнопку "M13mp18". Обратите внимание, что выбранные последовательности ДНК были добавлены к лесам и основных нитей в нижней панели.
9. ЭкспоRT сшивания последовательности как таблицу
- Нажмите кнопку "Экспорт" на верхней панели, а также выбрать имя файла назначения для основной список. Нажмите кнопку "Сохранить".
- Найдите пункт назначения. CSV файл и открыть его.
- Таблица показывает основные продукты список, который можно отправить как является компания синтеза ДНК. Первые две колонки показывают начальные и конечные координаты, при этом число за скобки обозначающие спирали и номер внутри скобки, означающие базового положения.
10. Назначение ворот и загрузка Последовательности
- В основной список, вы заметите, что некоторые последовательности начинаться или заканчиваться строка вопросительных знаков "???". Эти знаки вопроса означают, что поскольку ни прядь леса не гибридизуется с этим конкретным основных областей, то они не могут быть назначены дополнительные последовательности. Это на самом деле расширения мы разработали для ворот пряди и погрузочных площадок, и, следовательно, их необходимо назначать вручную сейчас. Выход:
- Ворота определить природу биологической вход, на котором робот будет переключаться из неактивного состояния в активное состояние и подвергать его полезной нагрузки. Каждый отдельный ворота двухцепочечной ДНК может кодировать ответ на один биологический вход (или более), так что профиль ресурсов, необходимых для активации робота могут быть определены.
Предположим в этом примере, что биологический сигнал запуска робота активации фермента рестрикции, которые могут указывать на наличие инфекционных бактерий. - Первые считают, что ворота нитей одноцепочечной ДНК гибридизации не сразу после разветвления из их спиралей. Проектирование ворота в противном случае могли бы помешать гибридизации во время складывания. Таким образом, каждая ветвь должна начинаться с разделителя. Обычно мы используем поли-T в качестве прокладки строк, как эта последовательность обеспечивает гибкость.
- Мы также предполагаем, что длина области гибридизации ворота 20 баз, содержащих целевой сидеть ограниченияЕ в его середине.
- Поэтому, что ворота могут выглядеть следующим образом:
[Спираль 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTxxxxxxGCTAGAG-3 '
[Спираль 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAxxxxxxCGATCTC-5 '
"....." обозначить основные области, который гибридизуется с эшафота нити, поэтому имеет последовательность уже и не должны быть изменены.
Случайные дуплекс "GTGAGTT" и его дополнения обеспечивает ограничение сайт не частично открыта, и дает некоторые дополнительные основания для обеспечения эффективного переваривания ферментом.
«Х» обозначает сайт рестрикции.
Случайные дуплекс "GCTAGAG" и его дополнения обеспечить некоторые дополнительные основания для фермента, чтобы эффективно работать, но и гарантирует, ворота лента достаточно долго, чтобы обеспечить хорошее закрытие робота.
Прежде, чем выбрать сайт рестрикции в качестве мишени, убедитесь, что вся конструкция робота, погрузочных площадок и другие части ворот сама не перевариваетсяФермент выбора. В этой экспертизы, NEBCutter 0 резака списка (ферменты, которые не режут всей последовательности) подчеркнула EagI, изолированная от Enterobacter Pantoea agglomerans, как потенциальный ферментов, которые могли бы указывать на наличие инфекционных энтеробактерий. - Ворота теперь выглядит следующим образом (желтая знаки EagI сайтов рестрикции):
[Спираль 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTCGGCCGGCTAGAG-3 '
[Спираль 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAGCCGGCCGATCTC-5 '
Обратите внимание, что эта конструкция предполагает, что после переваривания, последовательность "GTGAGTTCGG" (T м = 32 ° C) не является достаточно длинным или термодинамически стабильна провести робота закрыта больше. Это предположение, скорее всего, должны быть проверены экспериментально. - Второй затвор может быть таким же, в этом случае робот будет реагировать только на один фермент, или могут быть разработаны с другом сайте, повышение специфичности робота. Более сайты рестрикции могут быть добавлены на той же цепи, в увеличении сложности и специфичности робота.
- Ворота определить природу биологической вход, на котором робот будет переключаться из неактивного состояния в активное состояние и подвергать его полезной нагрузки. Каждый отдельный ворота двухцепочечной ДНК может кодировать ответ на один биологический вход (или более), так что профиль ресурсов, необходимых для активации робота могут быть определены.
- Загрузка сайтов:
- Загрузкой сайта может быть универсальной последовательности. Кроме того, нагрузка сайтов может быть основано на уникальных последовательностей, которые уменьшат модульность но и улучшить контроль за ориентацию груза и отношения (для различных видов грузов).
- Наконец, загрузка олигонуклеотидов сайт должен включать химическую функциональную группу, давая им возможность сопряженный с любой полезной нагрузки: белок, наночастицы и т.д. Убедитесь, что химическая группа установлена на правильный конца (5 'или 3'), в соответствии с основным направлением .
11. Имитация Результаты в CANDO
- После того, как задание печати сохраняется. Файла JSON, он может быть загружен на CANDO для анализа. CANDO является конечно-элементного моделирования на основе структуры ДНК, которые могут оценить его жесткость и стабильность в растворе 21.
- Кami.org / "целевых =" _blank "> http://cando-dna-origami.org/
- Нажмите кнопку "Отправить caDNAno файл для анализа" и заполнить всю необходимую информацию.
- Анализ в CANDO обычно занимает до 15-20 мин. В конце концов, сообщение электронной почты дает нам знать завершения анализа, обеспечивая связь для загрузки результатов моделирования (рис. 26).
12. ДНК заказа и сложите робот
Как только проект завершения процесса и CANDO анализ показывает удовлетворительные предсказания продукт, основной список прядь генерируется в разделах 9-10 можно заказать. Как правило, основной нити не требуют частности очистки, однако, рекомендуется, чтобы нити специальных целей, таких как ворота или загрузки сайтов быть очищен с помощью ВЭЖХ.
Шаги следующем порядке ДНК, а именно складной, очистки и оценки продукта, включая визуализацию складчатой структуры либо атомно-силовоймикроскопии (АСМ) и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) выходят за рамки этого документа, и могут быть найдены в предыдущих докладах 17,18,20,21. ТЭМ изображении робот предназначенный здесь приводится в качестве примера (рисунок 27). Подготовка образцов и окрашивание проводили точно так же, как описано в другом месте 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Цифры 1-25 скриншоты интерфейса caDNAno 2.0 показывает процесс проектирования шаг за шагом. Поперечное сечение формы была впервые изложенные (фиг. 3), с последующим автоматическим добавлением леса прядь фрагментов и завершения всего пути подмости (рис. 7). Сшивание нитей автоматически добавляются (рис. 12), разбитые по пользовательским параметрам (рис. 14), так и вручную отредактированы, чтобы адаптировать скобы на нужную функцию устройства (рис. 15-18). Цифры 23-24 описывают, как загрузка Сайт и ворота нити добавляются и редактируются. Наконец, фиг.27 показывает ПЭМ изображение модели, предназначенный здесь.
"/>
Рисунок 1. 3D модель готовой робот, разработанный caDNAno 2.0 и порожденные Autodesk Maya 2012.
Рисунок 2. Вид на caDNAno 2.0/Autodesk дизайн интерфейса Maya 2012. Верхняя панель: панель для решетки с изложением первоначальную форму. Нижняя панель: Панель редактирования. Справа:. 3D модель генератора (см. раздел 2.1) Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 3. Рисунок части формы на верхней раNel (см. раздел 2.3).
Рисунок 4. Нижней (редактирование) панели caDNAno 2.0. Оранжевая вертикальная черта определяет, где вдоль сетки действия редактирования произойдет. Серые стрелки в верхнем правом углу используются для расширения сетки по обе стороны (см. раздел 2.4).
Рисунок 5. Проект прядь эшафот после первоначального плана на верхней панели (см. раздел 2.5). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
ogether.within-страница = "всегда"> 
Рисунок 6. Выбор всех лесов края нити пути и расширения путь до нужной длины (см. раздел 2.7).
Рисунок 7. Общий вид нижней и правой панелях демонстрации того, как изменения 3D модели в реальном времени, а также действий редактирования. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
8/50268fig8highres.jpg "/>
Рисунок 8. Синими значками мостом между спиралями обозначают положения эшафот, где кроссоверы с домашними животными (красные значки на основных кроссоверов и еще не показано, см. раздел 2.9).
Рисунок 9. Создание новых лесов кроссоверы, нажав на мосту иконки выбора (см. раздел 2.10).
Рисунок 10. Создание оси (кроссовер как можно ближе к левой стороне сетки) между спиралей 29 и 30 (см. раздел 3.2).
Рисунок 11. Добавление спиралей, которые руководство ветвления погрузочных площадок (см. раздел 4.1).
Рисунок 12. План после "AutoStaple" действия. Основные цвета в нижней панели и правой панели соответствуют (см. раздел 5.1). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 13. "Автопрерыванием" диалоговое окно, в котором Пользователь может определить автопрерыванием параметров (см. раздел 5.2).
Рисунок 14. План после "автопрерыванием" действие (см. раздел 5.2). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 15 Ручное редактирование скобы I:. Размещение скоб, которые пересекают более от спирали 29 и 30 и должно быть исключено.
5 дюймов "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50268/50268fig16highres.jpg "/>
Рисунок 16 Ручное редактирование скобы II:. Удаления мосты между расположены скобы.
Рисунок 17 Ручное редактирование скобы III:. Закатки ники вместе фрагментированные скобы (см. раздел 5.5).
Рисунок 18. Весь промежуток между спиралями 29-30 не проявляя никаких кроссоверов связать две (см. раздел 5.5). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
= "Jove_content" FO: держать-together.within-страницы = "всегда"> 
Рисунок 19. Ручное редактирование скобы обращается в толстую линию (обозначающие они либо слишком короткая, слишком длинная или круглая, см. раздел 5.6).
Рисунок 20. Добавление руководство спиралей для загрузки сайта ветвления (см. раздел 6.1). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
1highres.jpg "/>
Рисунок 21. Ручное добавление основных нитей к направляющей спирали, так что точки ветвления могут быть расположены (см. раздел 6.2). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 22. Представляем кроссовер загрузки сайта на шасси робота эшафоте в удобном месте (один, который требует минимального редактирования шасси скобы, см. раздел 6.5).
Рисунок 23. Вид загрузки скрепок сайту, как показано в гоэлектронной нижней панели после удаления направляющих спиралей, которые больше не являются необходимыми (см. раздел 6.9).
Рисунок 24. Продление двумя скрепками, которые будут использоваться в качестве ворот нитей, из спиралей 29 и 30. Следует отметить, что две нити лицом противоположных направлениях, который является обязательным для формирования дуплекса затвор (см. раздел 7.4). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 25. Того эшафот последовательности («Seq" инструмент) диалогарамки, позволяющее выбрать одну из предопределенных леса, или вставить пользовательский последовательности (см. раздел 8.1).
Рисунок 26. Результаты CANDO анализ конструкция, описанные здесь. Моделирование генерирует. ZIP-архива, содержащего различные файлы, которые предоставляют необходимую информацию. Здесь RMSF (среднеквадратичной флуктуации) файлы (. PNG) изображены, иллюстрирующий то, как дизайн от 3 углами зрения, окрашено в соответствии с ключевыми подробно описаны в прилагаемом файле с именем "HeatMap4RMSF.txt". В этом случае минимальный RMSF (синие) составляет 1,03 нм, и 95% RMSF (redest) составляет 3,19 нм. Градиент цвета в модели происходит от полярности робота (в ворота «крыша», оси в "назад") и то, что там нет соединительных скоб вдоль спиралей 29-30 и 61-0, в результате чего «крыша 'стороне колебаться больше, чем "назад"стороны.
Рисунок 27. ПЭМ-изображение робот разработан в этой статье. Подготовка образцов и окрашивание проводили точно так же, как описано в другом месте 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ДНК-оригами позволяет изготовить точно определены объекты с произвольными функциями на наноуровне. Следующим важным шагом будет интеграция функций в эти проекты. Хотя многие приложения и задачи можно решить с помощью этой технологии, есть особый интерес к изготовлению терапевтические и научные роботы из ДНК-оригами, так как они представляют собой естественную среду ДНК. ДНК уже взаимодействует с молекулярные механизмы в клетках в качестве генетического носителе информации. Интересно, что в сложенном ДНК нанороботов или другой машине все еще может служить генетической информации в дополнение к тому, строительные материалы, которые могут быть переданы в экспрессии нужного белка после нанороботов распадается, как части последовательности выхода.
В примере, рассмотренном в этой статье, мы используем рестриктазы для управления роботом. Тем не менее, дополнительные механизмы, посредством которых ДНК роботы могут ответственд до входа включают следующее.
Молекулярное распознавание: мы недавно продемонстрировали аптамер основе ДНК ворота для роботов, которые признают белковых молекул на поверхности клеток-мишеней 20. Аптамеры может быть выбрана в пробирке с использованием таких методов, как SELEX 23, внешний от компаний, или использоваться в базе данных аптамеров ( http://aptamer.icmb.utexas.edu/ ). Когда аптамеры используются, важно учитывать, что цепи, комплементарной аптамеров, которые в совокупности образуют ворота, могут быть предназначены для включать несоответствия, что будет способствовать связывание лиганда аптамеров и смещение комплементарной нити. В то время как механизм, позволяющий этого неизвестна, чувствительность и специфичность аптамер основе ворота могут быть настроены путем увеличения или уменьшения% от несоответствия между двух нитей, чтобы получить либо очень строгие, но неэффективно ворота, или быстрыйно вытекающей один.
Ферментативное расщепление: для этого, ворота должны быть сконструированы таким образом, что они содержат субстрата этого фермента. Например, небольшое пептидного субстрата протеазы могут быть привязаны с обеих сторон ворот, который будет держать робота закрыта в отсутствие фермента.
Дистанционное управление: возможный подход, который не был применен к ДНК машинах используют золото нанокристаллов антенны в высокочастотное электромагнитное поле, чтобы вызвать плавление дцДНК 24. Это может предоставить пользователю выключателем в дополнение к биологической реагировать них. Хотя ДНК-оригами роботы относительно просто спроектировать и изготовить, они представляют несколько технических проблем, в качестве терапевтической платформы. ДНК не является идеальным материалом для доставки лекарств, как это весьма уязвимыми к расщеплению нуклеаз. Кроме того, он может выпадать в осадок иммунный ответ. Тщательное изучение поведения ДНК оригами объекты в организме Needed определить их судьбу и убедиться, что они не собираются в тканях или встроить в геном хозяина.
Таким образом, мы представили использование caDNAno, простым, надежным инструментом САПР для проектирования форм ДНК-оригами. Мы надеемся, чтобы начать видеть применение исследования, ориентированные в ДНК-оригами, в таких областях, как терапия, энергетики, метаматериалы, и образование. Во всех этих местах, caDNAno как ожидается, окажет существенное влияние на реализацию решений. В будущем, оно может стать промышленных и дизайн стандарт, который может быть заменена (или части которого можно) любым пользователем, потому что все они совместимы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность С. Дуглас чрезвычайно ценным для обсуждения и советы, и все члены Бачелет лаборатории за полезные обсуждения и работы. Работа выполнена при поддержке грантов от факультета естественных наук и Института нанотехнологий и современных материалов при Университете Бар-Илан.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autodesk Maya 2012 | Autodesk | A student/academic account needs to be created first (see platform-specific instructions in http://cadnano.org) | |
| caDNAno 2.0 (software) | (Open source) | Software for the design of DNA origami structures http://cadnano.org | |
| Cando (webpage) | (Open source) | Webpage running a simulator of DNA origami shapes http://cando-dna-origami.org |
References
- Watson, J. D., Crick, F. H. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature. 171, 964-967 (1953).
- Adleman, L. M. Molecular computation of solutions to combinatorial problems. Science. 266, 1021-1024 (1994).
- Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. Neural network computation with DNA strand displacement cascades. Nature. 475, 368-372 (2011).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
- Tang, Z., Parekh, P., Turner, P., Moyer, R. W., Tan, W. Generating aptamers for recognition of virus-infected cells. Clin. Chem. 55, 813-822 (2009).
- Baskerville, S., Bartel, D. P. A ribozyme that ligates RNA to protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 9154-9159 (2002).
- Bartel, D. P., Szostak, J. W. Isolation of new ribozymes from a large pool of random sequences [see comment]. Science. 261, 1411-1418 (1993).
- Benenson, Y., Gil, B., Ben-Dor, U., Adar, R., Shapiro, E. An autonomous molecular computer for logical control of gene expression. Nature. 429, 423-429 (2004).
- Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333, 1307-1311 (2011).
- Rothemund, P. W., Papadakis, N., Winfree, E. Algorithmic self-assembly of DNA Sierpinski triangles. PLoS Biol. 2, e424 (2004).
- Chen, J. H., Seeman, N. C. Synthesis from DNA of a molecule with the connectivity of a cube. Nature. 350, 631-633 (1991).
- He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452, 198-201 (2008).
- Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. J. Theor. Biol. 99, 237-247 (1982).
- Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485, 623-626 (2012).
- Yin, P., et al.
- Rothemund, P. W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325, 725-730 (2009).
- Douglas, S. M., et al. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459, 414-418 (2009).
- Douglas, S. M., et al. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Res. 37, 5001-5006 (2009).
- Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335, 831-834 (2012).
- Castro, C. E., et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Methods. 8, 221-229 (1038).
- Ke, Y., et al. Multilayer DNA origami packed on a square lattice. Journal of the American Chemical Society. 131, 15903-15908 (2009).
- Mallikaratchy, P. Using aptamers evolved from cell-SELEX to engineer a molecular delivery platform. Chem. Commun. (Camb). , 3056-3058 (2009).
- Hamad-Schifferli, K., Schwartz, J. J., Santos, A. T., Zhang, S., Jacobson, J. M. Remote electronic control of DNA hybridization through inductive coupling to an attached metal nanocrystal antenna. Nature. 415, 152-155 (2002).
