Diseño de un Robot Bio-respuesta a partir del ADN Origami

Summary

Origami de ADN es un poderoso método para la fabricación de objetos nanométricos precisos programando el auto-ensamblaje de moléculas de ADN. Aquí, se describe cómo origami de ADN se puede utilizar para diseñar un robot robótico capaz de detectar señales biológicas y responder por el cambio de forma, posteriormente transmitida a un efecto deseado.

Abstract

Los ácidos nucleicos son sorprendentemente versátil. Además de su papel natural como medio de almacenamiento para la información biológica ^1, que pueden ser utilizadas en la computación paralela ^2,3, reconocen y se unen dianas moleculares o celulares ^{4,5, 6,7} catalizan reacciones químicas, y generan respuestas calculadas en un biológica sistema de ^8,9. Es importante destacar que, los ácidos nucleicos pueden ser programados para auto-ensamblarse en estructuras 2D y 3D ^10-12, lo que permite la integración de todas estas características notables en un solo robot enlazan a la detección de señales biológicas a una respuesta ajustado con el fin de ejercer un efecto deseado.

Creación de formas de ácidos nucleicos fue propuesta por primera vez por Seeman ^13, y varias variaciones sobre este tema, ya se han realizado utilizando varias técnicas ^11,12,14,15. Sin embargo, la más significativa es quizás la propuesta por Rothemund, denominado andamiaje origami de ADN16. En esta técnica, el plegado de un ADN de una sola hebra larga 'andamio' (> 7.000 bases) se dirige a una forma deseada por cientos de cadenas complementarias cortos denominados 'grapas'. Plegable se lleva a cabo por la rampa de temperatura de recocido. Esta técnica se demostró con éxito en la creación de una gran variedad de formas 2D con notable precisión y robustez. Origami de ADN se extendió más tarde a 3D y ^17,18.

El presente trabajo se centrará en el software caDNAno 2.0 ¹⁹ desarrollado por Douglas y sus colegas. caDNAno es una herramienta CAD robusta y fácil de usar que permite el diseño de 2D y 3D DNA formas de origami con características versátiles. El proceso de diseño se basa en un esquema de abstracción sistemática y precisa de estructuras de ADN, por lo que es relativamente sencillo y eficiente.

En este trabajo se demuestra el diseño de un origami de ADN nanorobot que ha sido descrito recientemente ^20. Este robot es "robótica" en el sentido que enlaza detección de actuación, con el fin de realizar una tarea. Explicamos cómo diversos sistemas de detección pueden ser integrados en la estructura, y cómo esto se puede transmitir a un efecto deseado. Finalmente usamos Cando ²¹ para simular las propiedades mecánicas de la forma diseñada. El concepto se discute se puede adaptar a múltiples tareas y configuraciones.

Protocol

El robot vamos a diseñar en este documento responde a una proteína P haciendo una carga C disponible para unirse a los receptores en la superficie de una célula diana elegido. El robot se muestra en la Figura 1 C puede ser un fármaco-receptor de bloqueo;. Un factor de crecimiento, etc, y una manera de ligar químicamente a un oligonucleótido de ADN debe estar disponible que no destruye su función. El robot tiene dos estados. Cuando se hibridan inactivos, puertas de ADN en los dos 'labios' externos, asegurándose de que el robot permanece cerrada de manera que cualquier carga embarcada en él es secuestrado segura. En la presencia de la proteína P, las puertas abiertas por cualquiera de uno de varios mecanismos (véase más adelante) lo que permite que el robot para abrir y exponer la carga. En el diseño de la estructura, considerar que el robot tiene que ser lo suficientemente flexible para cerrar sobre sí mismo en el estado cerrado, y el resorte al estado abierto cuando las puertas permiten que lo haga. Modelando el comportamiento de un ADN estructura de integración termodinámica y componentes mecánicos es difícil, y el objeto real pueden requerir una cierta mejora iterativa. Sin embargo, aquí nos centramos en el proceso de diseño mediante un modelo de trabajo en general, lo que se puede construir.

Nota

Para una comprensión más amplia del proceso de diseño origami de ADN y plegables, recomendamos leer el artículo original caDNAno por Douglas et al ^19, que explica la representación abstracta de ADN en el diseño de la interfaz y cómo se relaciona con la estructura molecular real de un 3D la forma de ADN. Este documento va acompañado de dos tutoriales en vídeo que describen la representación caDNAno y la interfaz de una manera muy clara. Además, se recomienda la lectura del más reciente artículo de Dietz y sus colegas describen muchos aspectos importantes y protocolos detallados del proceso de plegado, como la herramienta de análisis Cando ^21.

tle "> 1. Descargue e instale caDNAno 2.0 y Autodesk Maya 2012

Nota: El software de Autodesk es gratuita para los estudiantes y el uso académico. Las instrucciones incluyen la creación de una cuenta académico de Autodesk.

1. Crear una cuenta académico en http://students.autodesk.com/ . Después de recibir la configuración de cuentas de correo electrónico, haga clic en el enlace de activación y rellenar tus preferencias si lo deseas.
2. Descargue la versión gratuita de Maya 2012 desde el Centro de descarga.
3. Instale Maya 2012 en el equipo.
4. Ejecutar Maya una vez antes de instalar caDNAno 2.0.
5. Descargue e instale la última versión de caDNAno 2.0 de http://cadnano.org/ .
6. Ejecutar Maya 2012. Un icono caDNAno debe aparecer en la esquina superior derecha de la interfaz gráfica de usuario. Haga clic en el icono para entrar en caDNAno.

2. OutLdiar la forma deseada y andamios Camino Strand

1. El diseño de la interfaz de caDNAno dentro Maya incluye 3 paneles (Figura 2):
   1. Panel superior: Vista del enrejado, donde la forma se describe inicialmente. Este panel permite acciones de doble hélice-nivel y ofrece una vista en sección de la forma.
   2. Panel inferior: el panel de edición, permitiendo a las acciones individuales a nivel de base.
   3. Panel derecho: un modelo en 3D en tiempo real Maya generados de la forma
2. Haga clic en el icono de "nido de abeja". Uso del zoom en y fuera de la red en el panel superior se puede hacer con el ratón desplazarse hacia arriba y hacia abajo, respectivamente.
   caDNAno permite dos posibles rejillas de diseño de nido de abeja, y de la plaza, en este trabajo se utilizará el diseño de nido de abeja, aunque la red cuadrada puede ser usado en general y ^22.
3. Comience por dibujar la parte de la forma deseada en el panel izquierdo.
   Cada círculo representa una doble hélice de ADN. Para chOose las hélices que construyen la forma, simplemente haga clic izquierdo en su centro (Figura 3). Continuar por la hélice hélice hasta que se describe la forma completa. Alternativamente, la forma se puede extraer pulsando el botón izquierdo del ratón y continuamente dibujando el contorno de la forma. Cualquier acción se puede deshacer pulsando menú Edición y "Deshacer", o por la combinación de teclas CTRL + Z (PC) o CMD + Z (Mac).
   En este punto, las hélices seleccionadas aparecerán de color amarillo. Al mismo tiempo, el panel inferior mostrará una vista lateral de la forma, el compuesto de estas hélices. La numeración en el panel inferior hélice es coherente con la numeración en la superior.
4. Observe el panel inferior. Cada hélice está representado por dos filas de cuadrados: las filas son las dos hebras de la doble hélice, con cada cuadrado representa una base (Figura 4).
   La barra vertical de color naranja determina que las acciones de edición tienen lugar a lo largo de una hélice. La posición de la base a lo largo de la cuadrícula aparece comoun número por encima de la barra naranja. Longitud predeterminada del marco de hélice es de 42 bases. La longitud se puede ampliar haciendo clic en uno de los iconos de las flechas de color gris en la esquina superior derecha del panel de edición y la elección de la longitud de la extensión (en múltiplos de 21, que corresponden a dos vueltas completas de la hélice del ADN, en la que una vez se extiende por 10,5 bases) (Figura 4). La rejilla se extenderá a la dirección de la flecha elegido.
5. Para trazar la ruta real filamento cadalso en todo el estado, pulse el botón del ratón, comenzar desde la primera hélice e ir continuamente en todas las hélices siguiendo el mismo orden en que fueron seleccionados inicialmente en la sección 2.3. Tenga en cuenta que:
   1. Las hélices seleccionadas en esta ocasión cambiará de color a naranja.
   2. En el panel inferior, fragmentos de cadena de andamios se pueden extraer de forma automática en las hélices seleccionados.
   3. El panel de la derecha muestra el modelo 3D de la forma que se construye en tiempo real. Al final de esteproceso, un proyecto de la ruta de cadena andamios se establecerá automáticamente en el panel inferior (Figura 5).
6. Dibuje un rectángulo alrededor de todos los bordes de la izquierda de la ruta andamio. Tenga en cuenta que los bordes que hayan sido seleccionadas aparecerán de color rojo (Figura 6).
7. Extender la ruta de andamio arrastrando los bordes seleccionados como un grupo hacia el lado izquierdo de la rejilla. Repita este proceso para los bordes derecho hasta que el camino esté bien extendida. Tenga en cuenta que la extensión de andamio también se extiende la forma 3D en el panel derecho (Figura 7).
8. Localice las piezas camino andamios que están aislados de los demás, y conectarlos. En nuestra forma, por ejemplo, hélices 0-9 formar una parte aislada. Helix 9 tiene que estar conectado a la hélice 12 (tenga en cuenta que las hélices 9 y 10 no son adyacentes en la forma [panel superior] para que no puedan ser conectados).
9. Zoom sobre los hilos que va a conectar, y el uso de la herramienta "Seleccionar" haga clic en cualquier punto de unade las hebras. Al hacer clic en cualquier punto a lo largo de un fragmento azul andamio, iconos "puente" aparecen entre las hélices, que indica la posición en que se permite crossovers. En estas posiciones, bases de hélices adyacentes se enfrentan directamente entre sí, permitiendo que las líneas de actuación a cruzar de hélice hélice sin deformación o torsión del ADN. El número que aparece junto al icono de cada puente indica el número de la hélice que se cruce a (Figura 8).
10. Para crear crossovers, a la izquierda haga clic en el icono del puente de la elección. Un cruce andamio será generado, es decir, el andamio cruza en este punto de hélice a hélice (Figura 9). Repita este proceso hasta que las atraviesa todas las hélices de andamios y crea un circuito cerrado que se extiende por toda la forma, sin dejar regiones aisladas del resto de la figura.
    Tenga en cuenta que, si bien aparecen cruces para abarcar una distancia en el software, en realidad no incluyen ninguna base de ADN. Físicamente, el crossover"Puente" contiene sólo una unidad de fosfato de la columna vertebral del ADN que une las dos bases de las hélices adyacentes juntos.
11. Antes de pasar al siguiente paso, asegúrese de que todo el andamiaje es continua, y ninguna parte de que está aislado de los demás.

3. Definir apertura Ejes Mecanismo

El robot descrito se abre en respuesta a una entrada biológica definida para exponer su carga útil. De apertura se lleva a cabo de una manera en forma de concha, con dos mitades (hélices 0-29 constituyen la mitad, hélices 30-61 constituyen el segundo medio) que gira en torno a dos ejes. Los ejes están formados por cruces entre hélices 29-30 y 61-0, que son los únicos cruces entre las dos mitades y se colocan sólo en o cerca de la orilla izquierda de la cuadrícula. El borde derecho contendrá las hebras de puerta (discutido a continuación).

1. Borrar el cruce existente entre hélices 29-30. Para borrar el crossover, haga clic en el punto de "codo" en cualquiera de las cadenas.Esto deja una muesca en ambas hebras donde el cruce solía ser. Para la costura de los nicks, pulse Mayús y haga clic en cada nick.
2. Crear un nuevo cruce entre hélices 29-30 lo más cerca posible del borde izquierdo de la rejilla (Figura 10).
3. Crear un nuevo cruce entre las hélices 61 y 0 lo más cerca posible del borde izquierdo de la cuadrícula.

4. Definir sitios de fijación de carga útil

Después de terminar de trazar la ruta de cadena andamio, tenemos que definir la fijación payload (carga) sitios. Cargando sitios están en hebras cortadas hecho que se extienden fuera de sus hélices como «ramas» de cadena sencilla. Por lo tanto, es importante definir muy precisamente donde a lo largo de la hélice se produce este ramificación, para asegurarse de que se extiende en la dirección deseada. Si definimos extensiones discontinuas arbitrariamente, lugares de carga pueden ocurrir en el lado externo del robot en lugar de la cara interna.

To Asegúrese de que un elemento básico se extiende a una dirección específica solamente, trazamos una hélice adicional, que sirve de guía para la derivación direccional de la grapa del cuerpo principal. Después de extender el sitio de carga deseada de la grapa, se retira la guía de hélice.

1. Definamos 4 lugares de carga que enfrenta hacia el lado interno del robot. Los puntos de carga se ramifican de hélices 3, 27, 34, y 58. Para cada sitio, en el panel superior haga clic en la hélice inmediatamente adyacente a estas hélices que se enfrenta el lado interno (Figura 11). Esto añadirá las hélices a la red en el panel inferior. No segunda pulsación estas hélices todavía.

5. Agregar y editar el Staples

1. Haga clic en "AutoStaple". El programa añadirá automáticamente secuencias de primera necesidad en varios colores (Figura 12). Tenga en cuenta que las grapas se han añadido a la forma 3D en el panel derecho. Colores básicos son consistentes para los paneles inferiores y derecha. En additien adelante, no es un indicador en la esquina inferior izquierda de la interfaz, lo que indica un elemento básico.
   Nota: grapas no puede ser demasiado largo, demasiado corto o circular. La mayoría de los alimentos básicos generados aquí no cumple con estos criterios, y tienen que ser editados. El primer paso en la edición de ellos es automático (véase el paso siguiente).
2. Haga clic en "introducción automática". Un cuadro de diálogo se abrirá (Figura 13), consulta de parámetros definidos por el usuario para esta acción:
   1. La longitud del objetivo (punto de ebullición): duración prevista de primera necesidad, si es posible
   2. Longitud mínima (punto de ebullición): longitud mínima permitida para un elemento básico
   3. Longitud máxima (punto de ebullición): longitud máxima permitida para un elemento básico
   4. Min dist de crossover (punto de ebullición): el número mínimo de pares de bases en un elemento básico puede recorrer entre el borde y un cruce o entre dos cruces.
      Utilizar los parámetros por defecto, haga clic en Aceptar. El software va a romper las grapas de acuerdo con estos parámetros a la medida de sus posibilidades (Figura 14).
3. Borrar todos los cruces de primera necesidad entre hélices 29-30 y 61-0, para que estas hélices se separen y permiten al robot para abrir. Borrado de cruces básicos requerirá un poco de edición manual para grapas correctas que se hacen demasiado cortos o irracional, como resultado de esta acción. Para hacerlo correctamente, siga las instrucciones de las secciones siguientes.
   Asegúrese de dejar los crossovers andamiaje creado en las secciones 3.2 y 3.3 intactos.
4. Considere, por ejemplo, la primera de cruce de grapas (cian y negro grapas) desde la izquierda entre las hélices 29 y 30 (Figura 15). Borre los dos puentes de este crossover haciendo clic en cada punto o puente rodilla por lo que se ve rojo, y luego pulsando el botón Borrar (Figura 16).
5. Seam las dos grapas en espiral 29 pulsando Mayús y haciendo clic en el nick entre ellos. Del mismo modo, la costura de las tres grapas en línea de 30 a una grapa (Figura 17). Las grapas puedenser prorrogado o reducido de forma manual haciendo clic en un borde y arrastrándolo a su gusto. Tenga cuidado de no circulares a cualquier grapa. Figura 18 muestra la brecha entre hélices 29-30 después de la edición completa de cruces de primera necesidad. Repita este proceso para hélices 0 y 61, y editar manualmente todas las grapas en cada hélice.
6. Localice grapas que se dibujan con trazo grueso, lo que significa que requieren su posterior edición. Examine cada uno y corregir si es necesario. Por ejemplo, los alimentos básicos que son demasiado cortos pueden ser borrados (Figura 19) o ampliar si es posible.

6. Crea Cargando Sitios y puertas

1. En segundo lugar, haga clic en las hélices sitio de carga en el panel superior, y ampliar los fragmentos de cadena andamios resultantes en el panel inferior, haga clic en un borde y arrastrándolo como desee (Figura 20).
2. Agregar manualmente grapas para estos fragmentos andamio colocando la barra vertical de color naranja en la posición deseada a lo largo de tél andamio, repasando las hélices de guía en el panel izquierdo, manteniendo SHIFT y hacer clic. Esto añadirá un precursor de grapas en cada hélice (Figura 21).
3. Extienda los precursores básicos de larga duración, así haciendo clic y arrastrando.
4. Localizar los iconos puente rojo, que indica las posiciones permitidas de cruce entre la hebra guía (por ejemplo, la hélice 62) y el chasis (por ejemplo, hélice 3).
5. Elija la ubicación más conveniente de introducir un cruce y haga clic en el icono de puente (Figura 22). Una ubicación práctica requiere mínimo de edición de grapas existentes en el chasis.
6. En la guía de hélice (hélice 62), eliminar el elemento básico que no es una parte del sitio de carga, y acortar la parte participante a la longitud deseada. La longitud deseada debe proporcionar tanto la especificidad para cargar distintos tipos de carga, y la fuerza de unión. Normalmente, una cola de 18-mer debe estar bien. Asegúrese de que el alimento permanece drawn por una línea delgada, de lo contrario editarlo hasta que aparezca.
7. En el chasis, editar las grapas modificados según sea necesario.
8. Borrar la guía (helix 62), dejando sólo la extensión de grapas.
9. Repita los pasos 6.4 a 6.8 para todos los sitios de carga (Figura 23).

7. Diseñar Strands Gate

Las hebras de compuerta son los únicos hilos, a excepción de los ejes, que une las hélices 29-30 y 61-0. En contraste con los ejes, las hebras de puerta no son cruces. Más bien, se hibridan para formar un segmento de doble hebra que sirve como el sensor para la entrada biológica de elección. Una vez que los dúplex puerta se desplazan, todo el robot entrópicamente puede girar en torno a los ejes y abiertos.

1. Localice las posiciones adecuadas para hilos de la puerta. Estos serán grapas en hélices 29, 30, 61, y 0.
2. Por ejemplo, examine la zona de la puerta 29 a 30. Hay hebras convenientes discontinuas que flanquean hélices 29 y 30 en lalado derecho de la rejilla, que se puede utilizar en forma de hebras de compuerta. Tenga en cuenta que se enfrentan direcciones opuestas.
3. Haga clic en el borde de una de las posibles cadenas de la puerta para extender fuera de la forma. Si el borde se encuentra en un cruce de andamios, la selección podría simplificarse asegurándose de sólo "Stap" (les) se pueden seleccionar haciendo clic off "Scaf" (veces) en la barra de herramientas "seleccionable" en la parte superior derecha de la interfaz .
4. Extender las dos grapas para formar las hebras de la puerta. Edite las grapas si esta extensión lo requiere (Figura 24). Repita esto para los hilos de puerta de hélices 0 y 61.
   Tenga en cuenta que, por ahora, la longitud real no importa, ya que el ADN sensor (por ejemplo aptamer) reemplazará las secuencias de la cadena de puerta en el paso final de secuencia.

8. Elija andamio Secuencia

1. Haga clic en la función "Secuencia". Coloque el cursor en cualquier lugar de la cadena de andamio y haga clic en. Un cuadro de diálogo se abrirá pedirnos queelegir la fuente de ADN andamio (Figura 25).
2. La elección de la fuente de ADN depende en gran medida el tamaño del robot. Por ejemplo, M13mp18 ssDNA (p7249), y sus derivados extendidas (p7308 etc), que por lo general han sido la elección para las grandes formas de origami de ADN, en forma cuando la hebra andamio es ~ 7 kb de longitud. Si el andamio de la forma diseñada es significativamente más corta que la fuente elegida, la hebra andamio exceso que no se hibrida a ninguna de grapas va a crear un bucle de ADN monocatenario que sobresale de la forma plegada. Si bien esto por lo general presenta poco problema para los bucles relativamente cortos, largos bucles múltiples kb podrían interferir drásticamente con el plegado y la función del robot. Por lo tanto es importante para adaptarse a la fuente elegida a la longitud andamio forma.

Por ejemplo, si la cadena de andamio necesaria para doblar una pequeña forma es de ~ 1600 bases de longitud, que es significativamente más corta que las fuentes predeterminadas en el cuadro de diálogo, una secuencia de encargo puedeser utilizado como andamio. Varias fuentes pueden ser considerados. Por ejemplo, el M13mp18 puede digerirse con una enzima de restricción específica que produce un fragmento de la longitud deseada. El diseño de este tipo de fuente se puede hacer en NEBcutter ( http://tools.neb.com/NEBcutter2/ ) pegando la secuencia de M13mp18 en la ventana de entrada NEBcutter, y los sitios de restricción de asignación. Otra opción es el uso de pre-digerido DNA de cadena simple, tales como la phiX174 virión ssDNA HaeIII resumen, disponible de New England Biolabs.

3. En el cuadro de diálogo, haga clic en "M13mp18". Tenga en cuenta que la secuencia de ADN elegido ha sido añadido a la andamio y hebras cortadas en el panel inferior.

9. Export Secuencia Staple como una hoja de cálculo

1. Haga clic en "Exportar" en la barra de herramientas superior, y seleccione un nombre de archivo de destino de la lista básica. Haga clic en "Guardar".
2. Busque el archivo csv de destino. Y abrirlo.
3. La hoja de cálculo muestra la lista de grapas, que puede ser enviado como es una empresa síntesis de ADN. Las dos primeras columnas muestran las coordenadas de inicio y final, con un número fuera de los corchetes que indican el número de hélice y el número entre paréntesis que indican la posición de base.

10. Asignar Gate y carga Secuencias

1. En la lista de primera necesidad, te darás cuenta de que algunas secuencias empiezan o terminan con una serie de signos de interrogación "?????". Estos signos de interrogación indican que, dado que no se hibrida con la hebra de andamio estas regiones específicas discontinuas, no pueden ser asignados secuencias complementarias. Estos son, de hecho, las extensiones que hemos diseñado para los hilos de la puerta y los lugares de carga, por lo que estos deben ser asignados manualmente ahora. Puerta:
   1. Las puertas determinan la naturaleza de la entrada biológica sobre la cual el robot cambia de inactivo a estado activo y exponer su carga útil. Cada una sola puerta de ADN de doble cadena puede codificar respuesta a una entrada biológica (o más), por lo que un perfil de datos de entrada requeridos para la activación del robot puede ser definida.
      Asumamos para este ejemplo que la señal biológica desencadenar la activación del robot es una enzima de restricción, lo que podría indicar la presencia de bacterias infecciosas.
   2. En primer lugar consideran que las ssDNA filamentos puerta no se hibridan inmediatamente después de la ramificación de sus hélices. El diseño de la puerta de lo contrario podría impedir la hibridación durante el plegado. Por lo tanto, cada rama debe comenzar con una cadena espaciadora. Utilizamos típicamente poli-T como cadenas separadoras, como esta secuencia proporciona flexibilidad.
   3. También asumimos que la longitud de la región de hibridación de puerta es 20 bases, que contiene el sentarse restricción objetivoe en su parte media.
   4. Por lo tanto, la puerta podría tener este aspecto:
      [Helix 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTxxxxxxGCTAGAG-3 '
      [Helix 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAxxxxxxCGATCTC-5 '
      El "....." denotan la región de grapas que se hibrida con la hebra de andamio, por lo tanto, tiene una secuencia y ya no debe ser cambiado.
      El dúplex al azar "GTGAGTT" y su complemento asegura el sitio de restricción no es, en parte abierto, y proporciona algunas bases adicionales para asegurar la digestión por la enzima eficaz.
      La "x" indica el sitio de restricción.
      El duplex aleatorio "GCTAGAG" y su complemento proporciona algunas bases adicionales para la enzima para trabajar de manera eficiente, pero también se asegura la cadena puerta es lo suficientemente largo para asegurar un buen cierre de robot.
      Antes de elegir un sitio de restricción como un objetivo, asegurarse de que toda la estructura del robot, los lugares de carga y otra parte de la puerta en sí no son digeridos por laenzima de elección. En este examen, la lista 0-cortador NEBcutter (enzimas que no cortan de la secuencia completa) destacó EagI, aislado a partir de la Pantoea de Enterobacter agglomerans, como una enzima potencial que podría indicar la presencia de una enfermedad infecciosa enterobacterias.
   5. La puerta ahora se ve así (amarillo marcas de restricción EagI):
      [Helix 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTCGGCCGGCTAGAG-3 '
      [Helix 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAGCCGGCCGATCTC-5 '
      Observe que este diseño se supone que después de la digestión, la secuencia "GTGAGTTCGG" _(Tm = 32 º C) no es lo suficientemente largo o termodinámicamente estable para sostener el robot cerrado ya. Este supuesto lo más probable es que tenga que ser verificado experimentalmente.
   6. La segunda puerta puede ser la misma en cuyo caso, el robot sólo podría responder a una enzima, o puede ser diseñado con un sitio diferente, el aumento de especificidad de robot. Más sitios de restricción se pueden añadir a la misma cadena, en arrugar la complejidad y especificidad del robot.
2. Cargando sitios:
   1. El sitio de carga puede ser una secuencia universal. Alternativamente, los sitios de carga se pueden basar en secuencias únicas, que disminuirán la modularidad pero mejorar el control sobre la orientación de carga y ratios (para diferentes tipos de carga).
   2. Por último, los oligonucleótidos sitio de carga deben incluir un grupo químico funcional que les permite conjugar con cualquier carga útil: proteínas, nanopartículas, etc Asegúrese de que el grupo químico está montado en el extremo correcto (5 'o 3'), de acuerdo con la dirección de grapas .

11. Simular resultados en CANDO

1. Después de que el trabajo se guarda como un archivo json., Puede ser subido a CANDO para su análisis. CANDO es una simulación basada en elementos finitos de la estructura del ADN que pueden estimar su rigidez y la estabilidad en solución ^21.
2. Ir aami.org / "target =" _blank "> http://cando-dna-origami.org/
3. Haga clic en "Enviar un archivo caDNAno para el análisis" y llenar toda la información necesaria.
4. Análisis en CANDO generalmente toma hasta 15-20 min. Al final, un mensaje de correo electrónico nos permite conocer el análisis está completo, que proporciona un enlace para descargar los resultados de la simulación (Figura 26).

12. DNA Orden y plegar el Robot

Una vez que el proceso de diseño se ha completado y el análisis CANDO muestra predicción satisfactoria del producto, la lista hebra básico generado en las secciones 9-10 se puede pedir. Típicamente, las hebras cortadas no requieren purificación particular, sin embargo, se recomienda que las hebras para fines especiales tales como puertas o de los sitios de carga se purificaron por HPLC.

La pasos siguiente orden ADN, es decir, plegado, la purificación y la evaluación de producto, incluyendo la visualización de la estructura plegada por cualquiera de fuerza atómicamicroscopía (AFM) o microscopía electrónica de transmisión (TEM) están fuera del alcance de este documento, y se pueden encontrar en los informes anteriores ^17,18,20,21. Una imagen de TEM del robot diseñado aquí es llevado como un ejemplo (Figura 27). Preparación de la muestra y la tinción se llevó a cabo exactamente como se describe en otro lugar ^21.

Representative Results

Figuras 1-25 son capturas de pantalla de la interfaz caDNAno 2.0 muestra el proceso de diseño paso a paso. La sección transversal de la forma se esbozó primero (Figura 3), seguido de la adición automática de los fragmentos de cadena de andamio y la terminación de todo el trayecto del andamio (Figura 7). Se agregan hebras cortadas de forma automática (Figura 12), rompen según los parámetros definidos por el usuario (Figura 14), y editado manualmente para adaptar los productos básicos en la función deseada del dispositivo (Figuras 15-18). Figuras 23-24 describen cómo cargar se añaden sitio y hebras puerta y editados. Finalmente, la Figura 27 muestra una imagen TEM del modelo diseñado aquí.

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Figura 1. Un modelo 3D del robot terminado, diseñado por caDNAno 2.0 y generada por Autodesk Maya 2012.

Figura 2. A la vista de la interfaz de diseño 2.0/Autodesk Maya 2012 caDNAno. Panel superior: Panel enrejado para delinear la forma inicial. Panel inferior: el panel de edición. Panel derecho:. Generador de modelos 3D (ver sección 2.1) Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 3. Dibujo de la sección de la forma en la parte superior panel (ver sección 2.3).

Figura 4. La (edición) del panel inferior de caDNAno 2.0. La barra vertical de color naranja determina dónde se producirán a lo largo de las acciones de edición de cuadrícula. Las flechas de color gris en la esquina superior derecha se utilizan para extender la red a cada lado (ver sección 2.4).

Figura 5. Un proyecto de la cadena andamio después del primer esbozo en el panel superior (ver sección 2.5). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

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Figura 6. Selección de todos los bordes de cada tira trayectoria del andamio y se extiende el camino a la longitud deseada (ver sección 2.7).

Figura 7. Una visión general de los paneles inferiores y derecha que demuestran cómo los cambios en el modelo 3D en tiempo real, junto con acciones de edición. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

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Figura 8. Los iconos azules puente entre hélices indican las posiciones en las que se permiten cruces andamio (iconos rojos se refieren a cruces de primera necesidad y sin embargo, no se muestran, ver sección 2.9).

Figura 9. Crear nuevo andamiaje crossovers haciendo clic en los iconos de puente de elección (véase el apartado 2.10).

Figura 10. Creación de un eje (un cruce un más cerca posible de la parte izquierda de la red) entre hélices 29 y 30 (véase la sección 3.2).

Figura 11. Adición de hélices que orientan la ramificación de los lugares de carga (ver sección 4.1).

Figura 12. El plan después de la acción "AutoStaple". Los colores básicos en el panel inferior y el panel de la derecha son consistentes (ver sección 5.1). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 13. La ventana de diálogo "introducción automática" en la que el usuario puede definir los parámetros de introducción automática (ver sección 5.2).

Figura 14. El plan después de la acción "introducción automática" (ver sección 5.2). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 15 edición de Manual de grapas I:. Localizar grapas que se cruzan de hélice 29 y 30 y se debe eliminar.

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Figura 16 edición de Manual de grapas II:. Eliminar los puentes entre las grapas situadas.

Figura 17 edición de Manual de grapas III. Engatillado los nicks junto grapas fragmentados (ver sección 5.5).

Figura 18. La diferencia total entre 29 a 30 hélices que no muestran cruces vincular los dos (ver sección 5.5). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

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Figura 19. Edición Manual de grapas dibujada en trazo grueso (denotando que son demasiado cortos, demasiado largos o circular, ver sección 5.6).

Figura 20. Adición de guía hélices para cargar ramificación sitio (ver sección 6.1). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

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Figura 21. Además Manual de hebras cortadas a las hélices de guía, por lo que los puntos de ramificación se pueden localizar (ver sección 6.2). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 22. Presentación de un sitio de carga cruzado al robot chasis andamio en una ubicación conveniente (que requiere mínimo de edición de chasis grapas, ver sección 6.5).

Figura 23. Vista de las grapas sitio de carga como se ve en thpanel inferior e después de quitar las hélices de guía, que ya no son necesarias (ver sección 6.9).

Figura 24. Extensión de dos grapas, que se van a utilizar como hebras de compuerta, de hélices 29 y 30. Tenga en cuenta que las dos cadenas se enfrentan direcciones opuestas, lo que es obligatorio para la formación del dúplex puerta (ver sección 7.4). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 25. La secuencia de adición andamio (función "SEC") el diálogocaja, lo que permite elegir entre uno de los andamios predefinidos, o para insertar una secuencia personalizada (sección 8.1).

Figura 26. Resultados del análisis CANDO del diseño descritos aquí. La simulación genera un archivo. Zip que contiene los diversos archivos que proporcionan la información solicitada. Aquí los archivos de la FMR (root mean square fluctuación) (. Png) se representan, que muestra un modelo del diseño de 3 ángulos de vista, de color de acuerdo a la tecla se detalla en el archivo adjunto llamado "HeatMap4RMSF.txt". En este caso, el mínimo FMR (más azul) es de 1,03 nm y 95% FMR (redest) es de 3,19 nm. El gradiente de color en el modelo deriva de la polaridad del robot (puertas de "frente", el eje de atrás ") y el hecho de que no hay grapas de conexión a lo largo de las hélices 29-30 y 61-0, haciendo que el" frente "lado a fluctuar más que el 'nuevo'lado.

Figura 27. Imagen de MET de la robot diseñado en este artículo. Preparación de la muestra y la tinción se llevó a cabo exactamente como se describe en otro lugar ^21.

Discussion

Origami de ADN nos permite fabricar objetos definidos con precisión con funciones arbitrarias en la nanoescala. Un importante paso siguiente sería la integración de la función en estos diseños. Aunque hay muchas aplicaciones y desafíos pueden abordarse con esta tecnología, hay un interés particular en la fabricación de robots terapéuticos y científicos de origami de ADN, ya que representan un medio natural de ADN. ADN ya se interconecta con maquinaria molecular en las células como un medio de almacenamiento de la información genética. Curiosamente, el ADN doblado en un nanorrobot u otra máquina aún puede servir como información genética además de ser un material de construcción, que puede ser transmitida a la expresión de una proteína deseada después de la nanorrobot se desintegra, como partes de una secuencia de salidas.

En el ejemplo analizado en este trabajo se utiliza una enzima de restricción para operar el robot. Sin embargo, otros mecanismos mediante los cuales los robots de ADN pueden respond de entradas son los siguientes.

Reconocimiento molecular: recientemente hemos demostrado puertas aptámero basados ​​para los robots de ADN que reconocen moléculas de proteína en la superficie de las células diana ^20. Los aptámeros se pueden seleccionar in vitro usando métodos tales como SELEX ^23, externalizadas de las empresas, o utilizada de la base de datos aptámero ( http://aptamer.icmb.utexas.edu/ ). Cuando se emplean aptámeros, es importante tener en cuenta que la cadena complementaria a la aptámero, que en conjunto forma la puerta, puede ser diseñado para incluir desajustes, lo que facilitará la unión del ligando y el desplazamiento de la hebra complementaria del aptámero. Si bien el mecanismo que permite esto es desconocida, la sensibilidad y la especificidad de una puerta de aptámero basado pueden ajustarse aumentando o disminuyendo el% de falta de coincidencia entre las dos cadenas, para obtener ya sea una puerta muy estrictas, pero ineficaz, o un rápidopero uno con fugas.

La escisión enzimática: para esto, las puertas deben ser diseñadas de tal manera que contienen el sustrato de esa enzima. Por ejemplo, un pequeño péptido sustrato de una proteasa puede ser atado de ambos lados de la puerta, que mantendrá el robot cerrada en ausencia de la enzima.

Mando a distancia: un enfoque potencial que no se ha aplicado a máquinas de ADN es utilizar una antena nanocristal de oro en un campo electromagnético de alta frecuencia para inducir la fusión de ADN de doble cadena ^24. Esto puede proporcionar un interruptor operado por el usuario, además de los bio-respuesta. Aunque ADN origami robots son relativamente fáciles de diseñar y hacer, se plantean varios retos técnicos como una plataforma terapéutica. ADN no es un material ideal para la administración de fármacos, ya que es muy vulnerable a la escisión por nucleasas. Por otra parte, podría precipitar una respuesta inmunitaria. Un estudio a fondo del comportamiento de los objetos origami de ADN en un organismo es necesarios para definir su destino y asegurarse de que no se agregan en los tejidos o se integran en el genoma del huésped.

En resumen, presentamos el uso de caDNAno, una herramienta sencilla, robusta CAD para el diseño de formas de origami de ADN. Esperamos poder comenzar a ver la investigación impulsado por las aplicaciones de origami de ADN, en áreas como la terapéutica, la energía, los metamateriales, y la educación. En todos estos lugares, se espera caDNAno a tener un impacto significativo en la realización de las soluciones. En el futuro, podría convertirse en un estándar industrial y de diseño, que puede ser sustituido (o partes de las cuales puede) por cualquier usuario, ya que son todos compatibles.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autodesk Maya 2012	Autodesk		A student/academic account needs to be created first (see platform-specific instructions in http://cadnano.org)
caDNAno 2.0 (software)	(Open source)		Software for the design of DNA origami structures http://cadnano.org
Cando (webpage)	(Open source)		Webpage running a simulator of DNA origami shapes http://cando-dna-origami.org