Designa en Bio-lyhörd robot från DNA Origami

Summary

DNA origami är en kraftfull metod för att tillverka exakta nanoskala objekt genom att programmera självorganisering av DNA-molekyler. Här beskriver vi hur DNA origami kan utnyttjas för att utforma en robot robot kan avkänna biologiska signaler och svara efter form skiftande, därefter vidarebefordras till en önskad effekt.

Abstract

Nukleinsyror är förvånansvärt mångsidig. Förutom deras naturliga roll som lagringsmedium för biologisk information ^1, kan de användas i parallella beräkningar ^2,3, känna igen och binda molekylära eller cellulära mål ^4,5, katalysera kemiska reaktioner ^6,7, och generera beräknade svar i ett biologiskt systemet ^8,9. Viktigt kan nukleinsyror programmeras att själv montera in 2D-och 3D-konstruktioner ^10-12, möjliggöra integrering av alla dessa fantastiska funktioner i en enda robot som förenar avkänning av biologiska ledtrådar till en förinställd svar i syfte att utöva en önskad effekt.

Skapa former från nukleinsyror först föreslogs av Seeman ^13, och flera variationer på detta tema har sedan realiserats med hjälp av olika tekniker ^11,12,14,15. Dock är det mest betydelsefulla kanske den som föreslås av Rothemund, benämnd bygga ställning DNA origami16. I denna teknik, är vikningen av en lång (> 7000 baser) enkelsträngat DNA "byggnadsställning" riktad till en önskad form av hundratals korta komplementära strängar benämnda "klammer". Folding utförs av temperatur glödgning ramp. Denna teknik demonstrerades framgångsrikt i skapandet av en mångfald av 2D-former med anmärkningsvärd precision och robusthet. DNA origami utvidgades senare till 3D samt ^17,18.

Den aktuella papper kommer att fokusera på caDNAno 2.0-programvara ¹⁹ utvecklats av Douglas och kollegor. caDNAno är en robust, användarvänlig CAD-verktyg som möjliggör konstruktion av 2D-och 3D-DNA origami-former med mångsidiga funktioner. Designprocessen bygger på en systematisk och noggrann abstraktion system för DNA-strukturer, vilket gör det relativt enkelt och effektivt.

I denna artikel visar utformningen av en DNA-origami nanorobot som nyligen har beskrivits ^20. Denna robot är "robot" i den meningen att den knyter avkänning till aktivering, för att utföra en uppgift. Vi förklarar hur olika sensing system kan integreras i strukturen, och hur detta kan förmedlas till en önskad effekt. Slutligen använder vi Cando ²¹ för att simulera de mekaniska egenskaperna hos den designade form. Konceptet diskuterar vi kan anpassas till flera uppgifter och inställningar.

Protocol

Roboten kommer vi att utforma i denna uppsats svarar på ett protein P genom att göra en last C tillgängligt för att binda till receptorer på ytan av ett valt mål cell. Roboten visas i figur 1 C kan vara en receptor-blockerande läkemedel,. En tillväxtfaktor etc, och ett sätt att kemiskt länka den till en DNA-oligonukleotid skall vara tillgänglig som inte förstör dess funktion. Roboten har två tillstånd. När inaktiv, DNA grindar på de två yttre läppar "hybridiseras, och se till att roboten förblir stängd så att varje last som lastas i den är ordentligt sekvestrerat. I närvaro av protein P, öppnas grindarna genom att antingen en av flera mekanismer (diskuteras nedan) tillåter roboten att öppna och exponera lasten. Vid utformningen av strukturen, anser att roboten måste vara tillräckligt flexibel för att stänga på sig själv i det stängda tillståndet, och fjäder till det öppna tillståndet när grindarna gör det möjligt att göra det. Modellera beteendet hos en DNA- struktur integrera termodynamiska och mekaniska komponenter är svårt, och det verkliga objektet kan kräva vissa iterativa förbättringar. Ändå, här fokuserar vi på designprocessen med hjälp av en generell arbetsmodell, som kan byggas på.

Anmärkning

För en mer fullständig förståelse av processen av DNA origami design och vikning, rekommenderar vi starkt att läsa den ursprungliga caDNAno papper genom Douglas och kollegor ¹⁹ vilket förklarar den abstrakt representation av DNA i design gränssnitt och hur det relaterar till den faktiska molekylstruktur av en 3D DNA form. Detta dokument åtföljs av två video tutorials som beskriver caDNAno representation och gränssnitt på ett mycket tydligt sätt. Dessutom rekommenderar vi att du läser nyare papper från Dietz och kollegor beskriver många viktiga aspekter och detaljerade protokoll från den fällbara processen, inklusive Cando analysverktyg ^21.

TLE "> 1. Ladda ner och installera caDNAno 2.0 och Autodesk Maya 2012

Obs: Autodesk programvara är gratis för studenter och akademisk användning. Instruktionerna nedan är att skapa en akademisk konto hos Autodesk.

1. Skapa en akademisk konto på http://students.autodesk.com/ . Efter att ha fått göra kontoinställningarna e-post, klicka på aktiveringslänken och fyll i dina önskemål och returresa.
2. Ladda ner gratis versionen av Maya 2012 från Download Center.
3. Installera Maya 2012 på din dator.
4. Kör Maya gång innan du installerar caDNAno 2.0.
5. Ladda ner och installera den senaste versionen av caDNAno 2,0 från http://cadnano.org/ .
6. Kör Maya 2012. En caDNAno ikon ska visas i det övre högra hörnet av det grafiska användargränssnittet. Klicka på ikonen för att gå in i caDNAno.

2. OutlIne den önskade formen och Scaffold Strand Path

1. Utformningen gränssnitt caDNAno inom Maya innehåller 3 skivor (figur 2):
   1. Topplatta: gitter view, där formen är initialt skisseras. Denna panel möjliggör dubbel helix-insatserna och ger ett tvärsnitt av formen.
   2. Bottenplatta: redigering panel, som möjliggör enkel bas-insatserna.
   3. Höger panel: en Maya-genererade realtid 3D-modell av formen
2. Klicka på "Honeycomb"-ikonen. Zooma in på och ut från gallret i den övre panelen kan göras genom musen scrolla upp och ner, respektive.
   caDNAno möjliggör två möjliga utformning gitter, honungskaka och torg, i denna uppsats kommer vi att använda den vaxkaka layout, även om torget gitter kunde användas generellt samt ^22.
3. Börja med att rita den del av den önskade formen på den vänstra panelen.
   Varje cirkel representerar en dubbel DNA-spiralen. Till choose spiralerna som bygger formen, bara vänster-klicka på deras center (Figur 3). Fortsätt helix genom spiralen tills hela formen är markerad. Alternativt kan formen dras genom att trycka på vänster musknapp och kontinuerligt rita formens kontur. Alla åtgärder kan ångras genom att klicka på Redigera-menyn och "Ångra", eller med kortkommandot Ctrl + Z (PC) eller CMD + Z (Mac).
   Vid denna punkt, kommer de valda spiralerna visas gult. Samtidigt, kommer den nedre panelen visar en sidovy av formen, som består av dessa spiraler. Helixen numreringen i den nedre panelen är förenlig med numrering i den översta.
4. Beakta den nedre panelen. Varje helix representeras av två rader av rutor: raderna är de två delarna av den dubbelspiral, med varje ruta representerar en bas (Figur 4).
   Den orange lodrätt streck bestämmer var redigering åtgärder sker längs en spiral. Basen läge längs nätet visas somett nummer ovanför den orange baren. Spiralen ramverkets standard längd är 42 baser. Längden kan utvidgas genom att klicka på en av de grå pilarna i det övre högra hörnet av redigering panelen och välja förlängningen längd (i multiplar av 21, vilket motsvarar två hela varv i DNA-spiralen, där ett varv spänner 10,5 baser) (Figur 4). Gallret kommer att sträcka sig till riktningen av den valda pilen.
5. För att rita den faktiska ställningen Strand bana hela formen, tryck på musknappen, startar den första spiralen och går kontinuerligt över alla spiralerna följer samma ordning som de ursprungligen valt i avsnitt 2.3. Notera att:
   1. Spiralerna valde den här gången ändrar färg till orange.
   2. I den nedre panelen, kommer byggnadsställning tråd fragment automatiskt dras till de utvalda spiraler.
   3. Den högra panelen visar den 3D-modell av formen som byggs i realtid. Vid slutet av dennaprocess, ett utkast till schavotten strängen sökvägen automatiskt dras i bottenplattan (Figur 5).
6. Rita en rektangel runt alla de vänstra kanterna av byggnadsställning sökvägen. Observera att kanterna så väljs visas rött (Figur 6).
7. Förläng ställningen bana genom att dra de valda kanterna som en grupp till den vänstra sidan av rutnätet. Upprepa denna process för högra kanten tills banan är ordentligt utsträckt. Observera att byggnadsställning förlängning förlängs även 3D-form i den högra panelen (Figur 7).
8. Leta ställningens väg delar som är isolerade från resten, och anslut dem. I vår form, till exempel, spiraler 0-9 utgör en isolerad del. Helix 9 måste vara ansluten till Helix 12 (observera att spiralerna 9 och 10 inte är intill varandra i formen [övre panelen] så att de inte kan anslutas).
9. Zooma in på strängarna som ska anslutas, och använda "Select" verktyget klickar du på valfri punkt på enav strängarna. När du klickar någon punkt längs en blå byggnadsställning fragment, 'bro' ikoner visas mellan spiralerna, som betecknar de lägen där korsningarna är tillåtna. I dessa lägen, baser i angränsande spiraler möter varandra direkt, vilket gör att strängarna att gå över från helix till helix utan att deformera eller vrida DNA. Numret som visas bredvid varje brygga indikerar antalet helix det kommer crossover till (Figur 8).
10. För att skapa delningsfilter, vänster klicka bron ikonen för val. En byggnadsställning crossover kommer att genereras, vilket innebär att ställningen korsar denna punkt från helix till helix (Figur 9). Upprepa denna process tills ställningens korsar alla spiraler och skapar en sluten slinga som sträcker sig över hela formen, lämnar inga regioner som är isolerade från resten av formen.
    Observera att medan delning tycks spänna ett avstånd i programvaran, i verkligheten de inte innehåller något DNA bas. Fysiskt, crossover"Bro" innehåller endast en fosfat enhet av DNA ryggraden som förenar de båda baserna från de angränsande spiralerna tillsammans.
11. Innan vi går vidare till nästa steg, se till att hela ställningen är kontinuerlig, och ingen del av den är isolerad från de andra.

Tre. Definiera öppningsmekanism Axes

Den beskrivna roboten öppnas som svar på en definierad biologisk ingång för att exponera dess nyttolast. Öppning sker i ett skal-liknande sätt, med två halvor (spiraler 0-29 utgör ena halvan, spiraler 30-61 utgör den andra halvan) kretsar kring två axlar. Axlarna bildas genom delning mellan spiralerna 29-30 och 61-0, vilka är de enda delning mellan dessa halvor och placeras endast i eller nära den vänstra kanten av nätet. Den högra kanten kommer att innehålla gate strängarna (diskuteras nedan).

1. Radera existerande crossover mellan spiralerna 29-30. För att radera crossover, klicka på "knä" i vardera strängen.Detta lämnar en nick i båda strängarna där crossover brukade vara. Till söm de nicks, trycka på SKIFT och klickar på varje nick.
2. Skapa en ny crossover mellan spiralerna 29-30 så nära som möjligt till den vänstra kanten av gallret (Figur 10).
3. Skapa en ny crossover mellan spiralerna 61 och 0 så nära som möjligt till den vänstra kanten av nätet.

4. Definiera Nyttolast Attachment webbplatser

När vi avslutar rita schavotten strängen vägen, måste vi definiera nyttolasten infästning (lastning) webbplatser. Laddar platser är i själva verket stapelvaror trådar som sträcker ut sina spiraler som enkelsträngade "grenar". Det är därför viktigt att definiera väldigt exakt var längs spiralen denna förgrening inträffar, se till att det sträcker sig i önskad riktning. Om vi ​​definierar stapelfibrer förlängningar godtyckligt kan lastplatser inträffa på den externa sidan av roboten istället för den interna sidan.

To se till att en stapelvara sträcker sig till en viss riktning, vi ritar en extra spiral, som fungerar som guider för den riktade förgrening av klammern från huvudenheten. Efter förlängning önskad laddningskammaren webbplats, är guiden helix bort.

1. Låt oss definiera 4 lastplatser vetter mot inre sidan av roboten. De lastplatser kommer grena ut spiralerna 3, 27, 34, och 58. För varje plats, i den övre panelen klickar på spiralen omedelbart intill dessa spiraler som står inför den inre sidan (Figur 11). Då läggs de spiralerna till nätet i den nedre panelen. Inte sekund på dessa spiraler ännu.

Fem. Lägg till och redigera Staples

1. Klicka på "AutoStaple". Programvaran kommer automatiskt att lägga stapelvara sekvenser i olika färger (Figur 12). Notera att häftklamrar har lagts till i 3D-formen i den högra panelen. Staple färger är konsekvent i de nedre och högra panelerna. I additipå, det är en indikator på det nedre vänstra hörnet av gränssnittet, vilket indikerar en stapelvara.
   Obs: häftklamrar kan inte vara för lång, för kort eller cirkulär. De flesta av de häftklamrar som genereras här inte uppfyller dessa kriterier, och måste redigeras. Det första steget i att redigera dem sker automatiskt (se nästa steg).
2. Klicka på "automatisk inkörning". En dialogruta öppnas (Figur 13), ber om användardefinierade parametrar för denna åtgärd:
   1. Target längd (bp): förväntade längd häftklammer om möjligt
   2. Min längd (bp): minimal tillåtna längd för en häftklammer
   3. Max längd (bp): maximallängds tillåtet för en häftklammer
   4. Min dist till XOVER (bp): det minsta antalet baspar en stapelvara kan förflyttas mellan sin kant och en crossover eller mellan två korsningar.
      Använd de förinställda parametrar, klickar du på OK. Programvaran kommer att bryta häftklamrar enligt dessa parametrar efter bästa förmåga (Figur 14).
3. Radera alla krampa delning mellan spiralerna 29-30 och 61-0, för att dessa spiraler för att separera och göra det möjligt för roboten att öppna. Radera häfta delningsfilter kräver viss manuell redigering för att korrigera häftklamrar som blir för kort eller irrationellt som en följd av denna åtgärd. För att göra detta på rätt sätt, följ instruktionerna i följande avsnitt.
   Se till att lämna ställningens delningsfilter skapats i avsnitten 3.2 och 3.3 intakta.
4. Tänk till exempel, den första häftklammern crossover (cyan och svart häftklamrar) från vänster mellan spiralerna 29 och 30 (Figur 15). Radera båda broarna i denna crossover genom att klicka varje knäpunkten eller bro så att det ser rött, då slår DELETE (Figur 16).
5. Seam de två häftklamrar på helix 29 genom att trycka Shift och klicka på nick mellan dem. Likaså söm de tre häftklamrar på sträng 30 till en enda stapelvara (Figur 17). Häftklamrar kanmanuellt förlängas eller förkortas genom att klicka på en kant och dra den ut-och returresa. Se till att inte cirkularisera någon stapelvara. Figur 18 visar skillnaden mellan spiralerna 29-30 efter fullständig redigering av stapelfibrer övergångar. Upprepa denna process för spiralerna 0 och 61, och manuellt redigera alla häftklamrar i varje helix.
6. Leta häftklamrar som dras av en tjock linje, vilket innebär att de kräver ytterligare redigering. Undersök var och en och korrigera vid behov. Till exempel kan häftklamrar som är för kort att raderas (figur 19) eller förlängas om möjligt.

6. Skapa egna webbplatser och Gates

1. Second-klicka på lastningsplats spiralerna i den övre panelen, och utvidga de resulterande schavotten strängen fragment i den nedre panelen genom att klicka på en kant och dra den ut-och returresa (Figur 20).
2. Manuellt lägga häftklamrar till dessa byggnadsställning fragment genom att placera den orange vertikala stapeln vid den önskade positionen längs tHan byggnadsställning, gå över styr-spiralerna på den vänstra panelen, håller SHIFT och klicka. Detta kommer att lägga till en stapelvara föregångare vid varje helix (Figur 21).
3. Förläng de krampa prekursorer till full längd samt genom att klicka och dra.
4. Leta reda på Red Bridge ikoner, betecknar tillåtna crossover positioner mellan guiden strängen (t.ex. helix 62) och chassit (t.ex. helix 3).
5. Välj den mest bekväma platsen att introducera en crossover och klicka bron ikonen (Figur 22). Ett bra läge kräver minimal redigering av befintliga häftklamrar i chassit.
6. I guiden helix (spiral 62), ta bort den stapelvara del som inte är en del av lastning webbplats, och förkorta deltagande delen till önskad längd. Önskad längd bör ge både specificitet fyller på olika typer av last, och bindande styrka. Normalt bör en 18-mer svansen vara fina. Kontrollera att klammern förblir DRAwn av en tunn linje, annars redigera den tills den är.
7. I chassit, redigera ändrade häftklamrar som behövs.
8. Radera guide (helix 62) vilket innebär att endast den stapelvara förlängning.
9. Upprepa steg 6,4-6,8 för alla lastplatser (Figur 23).

7. Designa Gate Strands

Styrelektroderna strängarna är de enda strängarna, med undantag för axlarna, länka helixar 29-30 och 61-0. I motsats till axlarna, styrelektroderna strängarna inte är överkorsningar. Snarare hybridisera de att bilda ett dubbelsträngat segment som fungerar som sensor för den biologiska inmatning av val. När grinden duplex förskjuts, kan hela roboten kretsar entropiskt runt axlarna och öppna.

1. Leta rätt positioner för gate strängar. Dessa kommer att vara häftklamrar på spiralerna 29, 30, 61, och 0.
2. Exempelvis undersöka 29-30 styreområdet. Det finns bra stapelvara strängar flankerande spiralerna 29 och 30 omhögra sidan av nätet, som kan användas som gate strängar. Observera att de står inför motsatta riktningar.
3. Klicka på kanten av en av de potentiella gate strängarna för att utvidga det utanför formen. Om kanten ligger över en byggnadsställning crossover, kunde dess val förenklas genom att se endast "Stap" (les) kan väljas genom att klicka bort "SCAF" (fold) i "Valbar" Verktygsfältet ovanför högra sidan av gränssnittet .
4. Förläng båda häftklamrar för att bilda styrelektroderna strängarna. Redigera häftklamrar om denna förlängning kräver det (Figur 24). Upprepa detta för porten strängarna i spiraler 0 och 61.
   Observera att för nu, inte den faktiska längden ingen roll, eftersom sensorn DNA (t.ex. aptamer) kommer att ersätta sekvenserna gate strängen vid sekvensen slutförande steget.

8. Välj Scaffold Sequence

1. Klicka på "Seq" verktyg. Placera markören någonstans på schavotten strängen och klicka. En dialogruta öppnas ber oss attvälj ställningen DNA källa (Figur 25).
2. Att välja käll-DNA beror mycket på robotens storlek. Exempelvis M13mp18 ssDNA (p7249), och dess utökade derivat (p7308 etc.) som i allmänhet har varit valet för stora formar DNA origami, passa då ställningen strängen är ~ 7 kb lång. Om ställningen av den utformade formen är betydligt kortare än den valda källan, kommer den överstigande scaffold sträng som inte hybridiseras till någon stapelvara skapa en slinga av ssDNA som skjuter ut från den vikta formen. Medan detta oftast innebär lite problem för relativt korta slingor, kunde flera kb långa slingor stör drastiskt med vikning och funktion av roboten. Därför är det viktigt att passa den valda källan till formen byggnadsställning längd.

Till exempel behövs om ställningen strängen att vika en liten form är ~ 1600 baser lång, vilket är betydligt kortare än de förinställda källor i dialogrutan, en anpassad sekvens kananvändas som byggnadsställning. Flera källor kan övervägas. Till exempel kan den M13mp18 digereras med ett specifikt restriktionsenzym som producerar ett fragment av önskad längd. Designa en sådan källa kan göras på NebCutter ( http://tools.neb.com/NEBcutter2/ ) genom att klistra in M13mp18 sekvensen i NebCutter input fönstret, och kartläggning restriktionssäten. Ett annat alternativ är att använda pre-smält ssDNA, såsom PhiX174 virion ssDNA Haelll digest, tillgänglig från New England Biolabs.

3. I dialogrutan "M13mp18". Notera att den valda DNA-sekvensen har lagts till ställningen och häfta strängar i den nedre panelen.

9. Export Staple sekvens som ett kalkylblad

1. Klicka på "Exportera" på verktygsfältet och välj en destination filnamn för stapelvara listan. Klicka på "Spara".
2. Leta reda på destinationen. Csv-fil och öppna den.
3. Kalkylbladet visar klammem listan, som kan skickas som är till en DNA-syntes företag. De två första kolumnerna visar början och slut koordinater, med numret utanför parentes betecknar helix samt antal inuti parentes betecknar baspositionen.

10. Tilldela Gate och laddas sekvenser

1. I stapelvara listan, kommer du att märka att vissa sekvenser börja eller sluta med en sträng av frågetecken "?????". Dessa frågetecken anger att eftersom ingen byggnadsställning sträng hybridiserar med dessa specifika häfta regioner, kan de inte tilldelas komplementära sekvenser. Dessa är i själva verket förlängningar vi designade för porten strängarna och lastplatser, och därför dessa måste tilldelas manuellt nu. Gate:
   1. Grindarna avgöra vilken typ av biologisk input på vilken roboten kommer att växla från inaktivt till aktivt tillstånd och exponera dess nyttolast. Varje enskild dsDNA grind kan koda svar på en biologisk ingång (eller mer), så en profil av insatsvaror som behövs för robot aktivering kan definieras.
      Låt oss anta att detta exempel att den biologiska cue utlösande robot aktivering är ett restriktionsenzym, vilket skulle kunna tyda på förekomsten av smittsamma bakterier.
   2. Först anser att grinden ssDNA strängarna inte hybridiserar omedelbart efter förgrenar sig av sina spiraler. Utforma porten annars kan hindra hybridisering under vikning. Därför bör varje gren börja med en spacer sträng. Vi använder vanligtvis poly-T som spacer strängar, eftersom denna sekvens ger flexibilitet.
   3. Vi antar också att längden på porten hybridisering regionen är 20 baser, innehållande sit mål begränsningene i dess mitt.
   4. Därför porten kan se ut så här:
      [Helix 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTxxxxxxGCTAGAG-3 '
      [Helix 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAxxxxxxCGATCTC-5 '
      Den "....." beteckna den stapelvara region som hybridiserar med ställningen strängen, därför den har en sekvens redan och bör inte ändras.
      Den slumpmässiga duplex "GTGAGTT" och dess komplement säkerställer restriktionsstället inte delvis öppen, och ger några extra baser för att säkerställa en effektiv nedbrytning av enzymet.
      "X" betecknar restriktionsstället.
      Den slumpmässiga duplex "GCTAGAG" och dess komplement ge några extra baser för enzymet att arbeta effektivt, men också ser till grinden strängen är tillräckligt lång för att säkerställa god robot stängning.
      Innan du väljer ett restriktionsställe som ett mål, se till att hela roboten struktur, fyller på webbplatser och andra delar av porten själv inte ned avenzym val. I denna undersökning, den NEBCutter 0-cutter lista (enzymer som inte skär hela sekvensen) belyst EagI, isolerad från Enterobacter Pantoea agglomerans, som en potentiell enzym som skulle kunna tyda på förekomsten av en enterobakteriell smittsam.
   5. Porten ser nu ut så här (gula markeringar Eagl restriktionsställe):
      [Helix 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTCGGCCGGCTAGAG-3 '
      [Helix 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAGCCGGCCGATCTC-5 '
      Notera att denna design förutsätter att efter digerering, sekvensen "GTGAGTTCGG" _(Tm = 32 ° C) inte är tillräckligt lång eller termodynamiskt stabila för att hålla roboten stängd längre. Detta antagande kommer sannolikt behöva verifieras experimentellt.
   6. Den andra porten kan vara samma i vilket fall roboten skulle endast svara på ett enzym, eller kan utformas med en annan plats, vilket ökar specificiteten hos roboten. Flera restriktionsställen kan läggas på samma sträng, i skrynklor komplexitet och specificitet av roboten.
2. Laddar platser:
   1. Belastningen webbplats kan vara en universell sekvens. Alternativt kan lastplatser vara baserade på unika sekvenser, vilket kommer att minska modularitet men förbättra kontrollen av gods orientering och nyckeltal (för olika typer av last).
   2. Slutligen bör de lastningsplats oligonukleotiderna inkluderar en kemisk funktionell grupp så att de kan konjugera med någon nyttolast: protein, nanopartikel, etc. Se till att den kemiska gruppen är monterad på rätt ände (5 'eller 3'), enligt den stapelvara riktning .

11. Simulera Resultat i Cando

1. Efter jobbet sparas som en. Json-fil, kan det laddas upp till Cando för analys. Cando är en ändlig-elementbaserad simulering av den DNA-struktur som kan uppskatta dess styvhet och stabilitet i lösning ^21.
2. Gå tillami.org / "target =" _blank "> http://cando-dna-origami.org/
3. Klicka på "Lägg till caDNAno fil för analys" och fylla all nödvändig information.
4. Analys i Cando tar oftast upp till 15-20 min. I slutet, låter ett e-postmeddelande oss veta analysen är klar, ger en länk för att ladda simuleringsresultaten (Figur 26).

12. Beställ DNA och Vik Robot

När designen är klar och Cando analys visar tillfredsställande förutsägelse av produkten, den stapelvara strängen listan genereras i avsnitten 9-10 kan beställas. Normalt krävs stapelvara strängarna inte särskilt rening, men det rekommenderas att speciella ändamål trådar såsom grindar eller webbplatser lastning renas genom HPLC.

I steg följande DNA ordning, nämligen vikning, rening och utvärdering av produkten, inklusive visualisering av veckad struktur med antingen Atomic Forcemikroskopi (AFM) eller transmissionselektronmikroskopi (TEM) är utanför ramen för denna uppsats, och kan hittas i tidigare rapporter ^17,18,20,21. En TEM bild av roboten utformade Här förs som ett exempel (Figur 27). Provberedning och färgning genomfördes exakt såsom beskrivs på annan plats ^21.

Representative Results

Figurerna är 1-25 skärmdumpar av caDNAno 2.0-gränssnittet visar designprocessen steg-för-steg. Tvärsnittet av formen var först beskrevs (Figur 3), följt av automatisk tillsats av byggnadsställning strand fragment och färdigställande av hela ställningen vägen (Figur 7). Staple strängar läggs automatiskt (Figur 12), fördelade enligt användardefinierade parametrar (Figur 14), och redigeras manuellt för att anpassa häftklamrar till önskad funktion hos anordningen (figurerna 15-18). Figurerna 23-24 beskriver hur lastning plats och strängar gate tillsätts och redigeras. Slutligen visar fig 27 en TEM bild av modellen utformats här.

"/>
Figur 1. En 3D-modell av den färdiga roboten, designad av caDNAno 2.0 och genereras av Autodesk Maya 2012.

Figur 2. En vy av caDNAno 2.0/Autodesk Maya 2012 design gränssnitt. Topplatta: gitter panel för beskriver ursprungliga form. Bottenplatta: redigering panel. Höger panel:. 3D-modell generator (se avsnitt 2.1) Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3. Ritning den del av formen på toppen panel (se avsnitt 2.3).

Figur 4. Botten (redigering) panel av caDNAno 2.0. Den orange lodrätt streck anger var längs nätet redigering åtgärderna kommer att inträffa. De grå pilarna i övre högra hörnet används för att utvidga nätet till endera sidan (se avsnitt 2.4).

Figur 5. Ett utkast till schavotten strängen efter den första kontur i den övre panelen (se avsnitt 2.5). Klicka här för att visa en större bild .

ogether.within-sida = "alltid">
Figur 6. Välja alla ställningens kanterna tråd bana och utöka sökvägen till önskad längd (se avsnitt 2.7).

Figur 7. En allmän uppfattning av de nedre och högra panelerna visar hur 3D-modellen förändringar i realtid tillsammans med redigering åtgärder. Klicka här för att visa en större bild .

8/50268fig8highres.jpg "/>
Figur 8. The Blue Bridge ikoner mellan spiraler betecknar positioner där schavotten övergångar tillåts (röda ikoner avser häfta delningsfilter och ännu inte visas, se avsnitt 2.9).

Figur 9. Skapa ny klätterställning Delningsfilter genom att klicka på bron ikoner av val (se avsnitt 2.10).

Figur 10. Skapa en axel (en crossover en nära som möjligt till den vänstra sidan av rutnätet) mellan spiralerna 29 och 30 (se avsnitt 3.2).

Figur 11. Lägga spiraler som styr förgreningen av lastplatser (se avsnitt 4.1).

Figur 12. The blueprint efter "AutoStaple" action. De stapelvara färger i den nedre panelen och den högra panelen överensstämmer (se avsnitt 5.1). Klicka här för att visa en större bild .

Figur 13. The "automatisk inkörning" dialog box där Användaren kan definiera automatisk inkörning parametrar (se avsnitt 5.2).

Figur 14. The blueprint efter "automatisk inkörning" action (se avsnitt 5.2). Klicka här för att visa en större bild .

Figur 15 Manuell redigering av häftklamrar I:. Lokalisera häftklamrar som korsar över från helix 29 och 30 och bör utgå.

5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50268/50268fig16highres.jpg "/>
Figur 16 Manuell redigering av häftklamrar II:. Bort broar mellan de placerade häftklamrar.

Figur 17 Manuell redigering av häftklamrar III:. Falsning de skärsår längs fragmenterade häftklamrar (se avsnitt 5.5).

Figur 18. Hela gapet mellan spiralerna 29-30 visar inga korsningar koppla två (se avsnitt 5.5). Klicka här för att visa en större bild .

= "Jove_content" fo: keep-together.within-sida = "alltid">
Figur 19. Manuell redigering av häftklamrar dras i tjock linje (som anger att de är antingen för kort, för lång eller cirkulär, se avsnitt 5.6).

Figur 20. Lägga guide spiraler för lastning webbplats förgrening (se avsnitt 6.1). Klicka här för att visa en större bild .

1highres.jpg "/>
Figur 21. Manuell tillsats av stapelfibrer strängar till guiden spiralerna, så förgrenar punkter kan placeras (se avsnitt 6.2). Klicka här för att visa en större bild .

Figur 22. Presentera en crossover lastning webbplats till roboten chassi byggnadsställning i ett bekvämt läge (en som kräver minimal redigering av chassi häftklamrar, se avsnitt 6.5).

Figur 23. Utsikt över lastningsplats häftklamrar som sett i the nedre panelen efter borttagning guiden spiralerna, som inte längre behövs (se avsnitt 6.9).

Figur 24. Utvidgning två klamrar, som kommer att användas som gate strängar, från helixar 29 och 30. Observera att de två strängarna inför motsatta riktningar, vilket är obligatoriskt för bildandet av grinden duplex (se avsnitt 7.4). Klicka här för att visa en större bild .

Figur 25. Ställningen sekvensen tillägg ("Seq" verktyg) dialogrutan, så att välja någon av fördefinierade byggnadsställningar, eller infoga en anpassad sekvens (se avsnitt 8.1).

Figur 26. Resultat av Cando analys av konstruktionen beskrivs här. Simuleringen genererar en. Zip-arkiv som innehåller de olika filer som tillhandahåller den begärda informationen. Här RMSF (root mean square fluktuation) filer (. Png) skildras, visar en modell av designen från 3 syn vinklar, färgad enligt den fördelningsnyckel som beskrivs i den bifogade filen som heter "HeatMap4RMSF.txt". I det här fallet är minimal RMSF (blåaste) 1,03 nm, och 95% RMSF (redest) är 3,19 nm. Den gradient färg över modellen härrör från polariteten av roboten (grindarna i "fronten", axel i "back") och det faktum att det inte finns några anslutande häftklamrar längs spiralerna 29-30 och 61-0, vilket gör att "front 'sida att fluktuera mer än "spela"sida.

Figur 27. TEM bild av roboten utformad i den här artikeln. Provberedning och färgning genomfördes exakt såsom beskrivs på annan plats ^21.

Discussion

DNA origami gör att vi kan tillverka exakt definierade objekt med godtyckliga funktioner i nanoskala. Ett viktigt nästa steg skulle vara att integrera funktionen i dessa konstruktioner. Medan många tillämpningar och utmaningar kan hanteras med denna teknik, det finns ett särskilt intresse av att tillverka terapeutiska och vetenskapliga robotar från DNA origami, eftersom dessa utgör en naturlig miljö av DNA. DNA gränssnitt redan med molekylära maskineriet i cellerna som en genetisk information lagringsmedium. Intressant, kan den vikta DNA i en nanorobot eller annan maskin fungerar fortfarande som genetisk information förutom att vara ett konstruktionsmaterial som kan vidarebefordras till uttryck av ett önskat protein efter nanorobot sönderfaller, som delar av en sekvens av utgångar.

I det exempel som diskuteras i detta dokument använder vi ett restriktionsenzym för att driva roboten. Men ytterligare mekanismer genom vilka DNA-robotar kan ansvarigtd till ingångarna inkluderar följande.

Molekylär igenkänning: vi nyligen visat aptamer-baserade portar för DNA-robotar som känner igen proteinmolekyler på ytan på målceller ^20. Aptamerer kan väljas in vitro med användning av metoder såsom SELEX ^23, utlokaliserade från företag, eller användas från aptamer databasen ( http://aptamer.icmb.utexas.edu/ ). När aptamerer används, är det viktigt att beakta att strängen komplementär till aptameren, som tillsammans bildar porten, kan utformas för att inkludera obalanser, vilket kommer att underlätta bindningen av aptameren s ligand och förskjutning av den komplementära strängen. Medan mekanism som möjliggör detta är okänd, kan känsligheten och specificiteten av en aptamer-baserad grind finjusteras genom att öka eller minska% av obalans mellan de två strängarna, för att antingen få en mycket stringent men ineffektiva grind, eller en snabbmen läckande ett.

Enzymatisk klyvning: för detta, bör grindarna utformas så att de innehåller substrat för det enzymet. Till exempel kan en liten peptid substrat av ett proteas vara uppbundna från båda sidor till porten, som kommer att hålla roboten stängd i frånvaro av enzymet.

Fjärrkontroll: en potentiell metod som inte har tillämpats på DNA-maskiner använder ett guld nanokristall antenn i ett högfrekvent elektromagnetiskt fält för att inducera dsDNA smälter ^24. Detta kan ge en användare drivna omkopplaren förutom bio-responsiva sådana. Även om DNA-origami robotar är relativt enkelt att designa och göra, utgör de flera tekniska utmaningar som en terapeutisk plattform. DNA är inte ett idealiskt material för läkemedelsavgivning eftersom det är mycket sårbara för klyvning av nukleaser. Man kan dessutom framkalla ett immunsvar. En grundlig undersökning av beteendet hos DNA origami objekt i en organism är needed att definiera sitt öde och se till att de inte samlade i vävnader eller integreras i värdgenomet.

Sammanfattningsvis, presenterade vi användning av caDNAno, en enkel, robust CAD verktyg för att utforma DNA origami-former. Vi hoppas att börja se program-driven forskning på DNA origami, inom områden som terapi, energi, metamaterial, och utbildning. På alla dessa ställen är caDNAno förväntas ha en betydande inverkan på att förverkliga lösningarna. I framtiden kan det bli en industriell och design standard, som kan bytas ut (eller delar av dem kan) av alla användare, eftersom de alla är kompatibla.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autodesk Maya 2012	Autodesk		A student/academic account needs to be created first (see platform-specific instructions in http://cadnano.org)
caDNAno 2.0 (software)	(Open source)		Software for the design of DNA origami structures http://cadnano.org
Cando (webpage)	(Open source)		Webpage running a simulator of DNA origami shapes http://cando-dna-origami.org