Summary
DNA-Origami ist eine leistungsfähige Methode zur Herstellung nanoskaliger Objekte präzise durch die Programmierung der Selbstorganisation von DNA-Molekülen. Hier beschreiben wir, wie DNA-Origami genutzt werden, um einen Roboter Roboter erfassen kann biologische Signale und reagiert durch Shape Shifting, anschließend auf eine gewünschte Wirkung weitergeleitet zu entwerfen.
Abstract
Nukleinsäuren sind erstaunlich vielseitig. Neben ihrer natürlichen Funktion als Speichermedium für biologische Informationen 1, sie in parallele Datenverarbeitung 2,3 verwendet werden können, erkennen und binden molekularen oder zellulären Targets 4,5, chemische Reaktionen katalysieren 6,7 und erzeugen berechnet Antworten in einer biologischen System 8,9. Wichtig ist, dass Nukleinsäuren in 2D-und 3D-Strukturen 10-12 Selbstorganisation programmiert werden, so dass die Integration aller dieser bemerkenswerten Merkmale in einem einzigen Roboter verbindet die Erfassung der biologischen Signale auf einen vorgegebenen Antwort, um eine gewünschte Wirkung auszuüben.
Erstellen von Formen von Nukleinsäuren wurde zuerst von Seeman 13 vorgeschlagen, und einige Variationen zu diesem Thema wurden seitdem realisiert unter Verwendung verschiedener Techniken 11,12,14,15. Allerdings ist die wichtigste vielleicht die einzige von Rothemund vorgeschlagen, genannt eingerüstet DNA-Origami16. In dieser Technik wird das Falten eines langen (> 7.000 Basen) einzelsträngige DNA "Gerüst" zu einer gewünschten Form von Hunderten von kurzen komplementären Stränge als 'Klammern' gerichtet. Folding erfolgt durch Tempern Rampe durchgeführt. Diese Technik wurde erfolgreich in der Schaffung einer Vielfalt von 2D-Formen mit bemerkenswerter Präzision und Robustheit unter Beweis gestellt. DNA-Origami wurde später in 3D sowie 17,18 verlängert.
Das aktuelle Papier wird auf dem caDNAno 2.0 Software 19 von Douglas und Kollegen entwickelt konzentrieren. caDNAno ist eine robuste, benutzerfreundliche CAD-Tool ermöglicht das Design von 2D-und 3D-DNA-Origami-Formen mit vielseitigen Funktionen. Der Design-Prozess beruht auf einem systematischen und genauen Abstraktion Regelung für DNA-Strukturen, so dass es relativ einfach und effizient.
In diesem Beitrag zeigen wir den Aufbau eines DNA-Origami-nanorobot, das kürzlich 20 beschrieben. Dieser Roboter ist 'Roboter' in dem Sinne, dass es Links zu Erfassen Betätigung, um eine Aufgabe zu erfüllen. Wir erläutern verschiedene Erfassungsschemata in die Struktur integriert werden können, und wie diese um einen gewünschten Effekt weitergeleitet werden. Schließlich verwenden wir Cando 21 um die mechanischen Eigenschaften der entworfenen Form simulieren. Das Konzept, das wir diskutieren können, um mehrere Aufgaben und Einstellungen angepasst werden.
Protocol
Der Roboter wir in diesem Papier Design wird reagiert auf ein Protein P, indem sie eine Ladung C erhältlich an Rezeptoren auf der Oberfläche eines ausgewählten Zielzelle zu binden. Der Roboter wird in 1 gezeigt kann ein C-Rezeptor-blockierenden Droge;. Ein Wachstumsfaktor usw., und eine Möglichkeit, chemisch verbinden es mit einem DNA-Oligonukleotid vorhanden sein muss, nicht zerstört seine Funktion. Der Roboter hat zwei Zustände. Wenn inaktiv, DNA Tore auf den beiden äußeren 'lips' hybridisiert sind, so dass der Roboter bleibt geschlossen, so dass keine Ladung in ihr sicher abgesondert wird geladen. In Anwesenheit des Proteins P, die Tore öffnen durch eines von mehreren Mechanismen (unten diskutiert) so dass der Roboter zum Öffnen und Setzen der Fracht. Bei der Gestaltung der Struktur berücksichtigen, dass der Roboter flexibel genug sein, um auf sich selbst in den geschlossenen Zustand zu schließen ist, und die Feder in die offene Stellung wenn die Tore ermöglichen es, dies zu tun. Modellieren des Verhaltens eines DNA Struktur integriert thermodynamischen und mechanischen Komponenten schwierig ist, und die eigentliche Aufgabe erfordert möglicherweise einige iterative Verbesserung. Dennoch, hier sind wir auf dem Design-Prozess mit einem allgemeinen Arbeitsmodell, auf dem man aufbauen kann konzentrieren.
Hinweis
Für ein umfassendes Verständnis der Prozess der DNA-Origami-Design und Falten, empfehlen wir Ihnen das Lesen der ursprünglichen caDNAno Papier von Douglas und Kollegen 19, die die abstrakte Darstellung von DNA in der Design-Oberfläche und wie sie sich auf die tatsächliche Molekülstruktur eines erklärt 3D-DNA Form. Dieses Papier wird von zwei Video-Tutorials zur Beschreibung der caDNAno Darstellung und Schnittstelle in einem sehr klaren Weg begleitet. Zusätzlich empfehlen wir das Lesen der neueren Arbeit von Dietz und Kollegen beschreiben viele wichtige Aspekte und detaillierte Protokolle der Faltung, einschließlich der Cando-Analyse-Tool 21.
tle "> 1. Downloaden und Installieren caDNAno 2.0 und Autodesk Maya 2012Hinweis: Autodesk-Software ist kostenlos für Studenten und akademischen Gebrauch. Die folgenden Anweisungen umfassen die Einrichtung eines akademischen Konto bei Autodesk.
- Erstellen Sie ein Konto bei akademischen http://students.autodesk.com/ . Nach Erhalt der Kontoeinrichtung E-Mail, klicken Sie auf den Aktivierungs-Link und füllen Sie Ihre Einstellungen wie gewünscht.
- Laden Sie die kostenlose Version von Maya 2012 von der Download-Center.
- Installieren Sie Maya 2012 auf Ihrem Computer.
- Führen Sie vor der Installation von Maya einmal caDNAno 2.0.
- Downloaden und installieren Sie die neueste Version von caDNAno 2.0 von http://cadnano.org/ .
- Führen Sie Maya 2012. Ein caDNAno Symbol sollte in der oberen rechten Ecke der grafischen Benutzeroberfläche angezeigt. Klicken Sie auf das Symbol, um in caDNAno gehen.
2. Outline der gewünschten Form und Gerüst Strand Pfad
- Das Design der Schnittstelle caDNAno innerhalb Maya enthält 3 Platten (Abbildung 2):
- Oberseite: Gitter Ansicht, wo die Form zunächst umrissen wird. Dieses Panel ermöglicht Doppelhelix-level Aktionen und bietet einen Schnitt der Form.
- Bodenplatte: Editing-Panel, so dass einzelne Base-Level-Aktionen.
- Rechts: ein Maya-generated Echtzeit 3D-Modell der Form
- Klicken Sie auf die "Honeycomb"-Symbol. Zoom auf und aus dem Gitter im oberen Bereich kann mit der Maus durchgeführt werden oben und unten scrollen, beziehungsweise.
caDNAno ermöglicht zwei mögliche Design-Gitter, Wabe und Platz; in diesem Papier werden wir die Waben Layout zu verwenden, obwohl die quadratischen Gitter der Regel verwendet, könnte auch 22 werden. - Zeichnen Sie zunächst den Abschnitt von der gewünschten Form auf der linken Seite.
Jeder Kreis stellt eine doppelte DNA-Helix. Um chOose die Helices, die die Form zu bauen, einfach auf ihre Mitte (Abbildung 3) mit der linken Maustaste. Weiter Helix Helix, bis die gesamte Form skizziert. Alternativ kann die Form, indem Sie die linke Maustaste gedrückt und zeichnen kontinuierlich die Kontur der Form gezogen werden. Jede Aktion kann durch Anklicken im Menü Bearbeiten rückgängig gemacht werden und "Rückgängig" oder durch die Tastenkombination STRG + Z (PC) oder CMD + Z (Mac).
An diesem Punkt werden die ausgewählten Helices gelb erscheinen. Zur gleichen Zeit wird die Bodenplatte zeigt eine Seitenansicht der Form dieser Spiralen besteht. Die Wendel Nummerierung in der Bodenplatte entspricht der Nummerierung in oberste. - Beachten Sie die Bodenplatte. Die Zeilen sind die beiden Stränge der Doppelhelix, wobei jedes Quadrat, das eine Basis (4) jeder Spirale ist mit zwei Reihen von Quadrate dargestellt.
Die orange vertikale Balken bestimmt, wo die Bearbeitung Aktionen statt entlang einer Helix. Die Grundstellung entlang des Rasters wird alseine Zahl über dem orangefarbenen Balken. Der Helix Frameworks Standardlänge beträgt 42 Basen. Die Länge, indem Sie auf einen der grauen Pfeilsymbole in der oberen rechten Ecke der Bearbeitung Panel und die Wahl der Länge der Verlängerung (in Vielfachen von 21, die zwei volle Umdrehungen der DNA-Helix entsprechen verlängert werden kann, in dem man wiederum überspannt 10,5 Basen) (Abbildung 4). Das Gitter wird auf die Richtung des gewählten Pfeil erstrecken. - Um die tatsächliche Gerüst Strangweg ganzen Form darzustellen, drücken Sie die Maustaste, starten aus der ersten Helix und gehen kontinuierlich über alle Helices nach dem gleichen Reihenfolge, wie sie wurden zunächst in Abschnitt 2.3 ausgewählt. Beachten Sie, dass:
- Die Helices ausgewählt diesmal die Farbe orange.
- In der Bodenplatte wird Gerüst Strang Fragmente automatisch an den ausgewählten Helices gezogen werden.
- Das rechte Bild zeigt das 3D-Modell der Form in Echtzeit aufgebaut. Am Ende diesesProzess, ein Entwurf des Gerüsts Strangweg wird automatisch in der unteren Platte (Abbildung 5) gezogen werden.
- Zeichnen Sie ein Rechteck um alle linken Kanten des Gerüsts Weg. Beachten Sie, dass Kanten so gewählt wird rot (Abbildung 6) erscheinen.
- Erweitern Sie das Gerüst Pfad, indem Sie die ausgewählten Kanten als eine Gruppe auf der linken Seite des Gitters. Wiederholen Sie diesen Vorgang für den rechten Rand, bis der Pfad richtig ausgefahren ist. Beachten Sie, dass Gerüst Erweiterung erstreckt sich auch die 3D-Form auf der rechten Seite (Abbildung 7).
- Suchen Sie die Teile, die Gerüst Weg vom Rest getrennt werden und sich ihnen anzuschließen. In unserer Form, zum Beispiel bilden Helices 0-9 einen isolierten Teil. Helix 9 Bedürfnisse zu Helix 12 angeschlossen werden (beachten Sie, dass Helices 9 und 10 sind nicht in der Form [Oberseite], so dass sie nicht angeschlossen werden benachbarte).
- Vergrößern Sie die Stränge angeschlossen werden, und mit Hilfe der "Select"-Werkzeug auf einen beliebigen Punkt auf einesder Stränge. Beim Anklicken eines beliebigen Punkt entlang einer blauen Gerüst Fragment erscheinen "Brücke" zwischen den Helices Symbole, bezeichnet die Positionen, an denen Frequenzweichen sind erlaubt. In diesen Positionen konfrontiert Basen in benachbarten Helices direkt aufeinander, so dass die Stränge zu überqueren von Helix Helix ohne sich zu verformen oder Verdrehen der DNA. Die Nummer, die neben jeder Brücke Symbol zeigt die Anzahl der Helix wird es Crossover auf (Abbildung 8).
- Um Überschneidungen zu erstellen, klicken Sie links über die Brücke Symbol der Wahl. Ein Gerüst Crossover generiert werden, was bedeutet das Gerüst kreuzt an dieser Stelle von Helix Helix (Abbildung 9). Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Gerüst durchläuft alle Helices und schafft eine geschlossene Schleife, die die gesamte Form überspannt, so dass keine Regionen, die vom Rest der Form isoliert werden.
Beachten Sie, dass während Frequenzweichen, um einen Abstand in der Software umfassen erscheinen, in Wirklichkeit sind sie enthalten keine DNA-Basen. Körperlich, das Crossover"Brücke" enthält nur einen Phosphat-Einheit der DNA-Rückgrat, das die beiden Basen von den benachbarten Wendeln miteinander verbindet. - Bevor wir zum nächsten Schritt zu machen, dass das gesamte Gerüst ist kontinuierlich, und kein Teil davon wird von den anderen isoliert.
3. Definieren Öffnungsmechanismus Achsen
Die beschriebene Roboter wird in Reaktion auf eine definierte biologische Eingang zu seinem Nutzlast freizulegen. Das Öffnen erfolgt in einer Shell-Manier, mit zwei Hälften (Helices 0-29 stellen die Hälfte, Wendeln 30-61 bilden die zweite Hälfte) rund um zwei Achsen. Die Achsen werden von Übergängen zwischen den Helices 29-30 und 61-0, die die einzigen Übergänge zwischen diesen Hälften sind und die nur in oder in der Nähe der linken Seite des Gitters positioniert ist. Die rechte Kante enthält die Gate-Stränge (siehe unten).
- Löschen Sie die vorhandene Crossover zwischen den Helices 29-30. Um den Übergang zu löschen, klicken Sie auf die "Knie" Punkt in beiden Strängen.Dies lässt einen nick in beiden Strängen, wo die Frequenzweiche verwendet werden. Um die Naht nicks, drücken Sie SHIFT gedrückt und klicken Sie auf jede nick.
- Erstellen Sie ein neues Crossover zwischen den Helices 29-30 so nah wie möglich an den linken Rand des Gitters (Abbildung 10).
- Erstellen Sie ein neues Crossover zwischen den Helices 61 und 0 so nah wie möglich an den linken Rand des Rasters.
4. Definieren Nutzlast Bindungsstellen
Nachdem wir das Gerüst Plotten Strangweg beenden, müssen wir die Nutzlast Befestigung (Laden) Websites zu definieren. Lädt Seiten sind in der Tat Grundnahrungsmittel Stränge, die aus erstrecken ihrer Helices als einzelsträngige 'Zweige'. Daher ist es wichtig, sehr genau zu definieren, wo entlang der Helix diese Verzweigung auftritt, um sicherzustellen, dass es sich in die gewünschte Richtung. Wenn wir Heftklammer Erweiterungen definieren beliebig könnte Ladestellen auf der äußeren Seite des Roboters anstelle der Innenseite auf.
To sicherzustellen, dass eine Klammer erstreckt, um eine bestimmte Richtung, wir eine zusätzliche Wendel, die als Führungen für die gerichtete Verzweigung der Klammer von dem Hauptkörper dient plotten. Nachdem sich die gewünschte Ladestelle Grundnahrungsmittel ist die Führung Helix entfernt.
- Wir definieren 4 Ladestellen zugewandten Innenseite des Roboters. Die Ladestellen wird verzweigen sich von Helices 3, 27, 34 und 58. Für jeden Standort in der oberen Platte auf die Helix unmittelbar neben dieser Helices, die die interne Seite (Abbildung 11) zugewandt ist. Dadurch werden die Helices an das Netz in der Bodenplatte hinzuzufügen. Kein zweiter klicken diese Helices noch.
5. Hinzufügen und Bearbeiten von Staples
- Klicken Sie auf "AutoStaple". Die Software wird automatisch Grundnahrungsmittel Sequenzen in verschiedenen Farben (Abbildung 12). Beachten Sie, dass Heftklammern in die 3D-Form auf der rechten Seite wurden hinzugefügt. Staple Farben sind konsistent für die unteren und rechten Platten. In additiauf, es gibt eine Anzeige auf der linken unteren Ecke der Benutzeroberfläche, die eine Klammer angibt.
Hinweis: Heftklammern kann nicht zu lang, zu kurz oder kreisförmig. Die meisten der hier erzeugten Heftklammern nicht diese Kriterien erfüllen, und müssen bearbeitet werden. Der erste Schritt bei der Bearbeitung sie erfolgt automatisch (siehe nächster Schritt). - Klicken Sie auf "AutoBreak". Ein Dialogfenster wird geöffnet (Abbildung 13) und bat um benutzerdefinierte Parameter für diese Aktion:
- Ziel Länge (bp): erwartete Länge von Grundnahrungsmitteln, wenn möglich
- Min. Länge (bp): minimale Länge für ein Grundnahrungsmittel erlaubt
- Max Länge (bp): maximale Länge für ein Grundnahrungsmittel erlaubt
- Min dest zu xover (bp): die minimale Anzahl von Basenpaaren ein Grundnahrungsmittel zwischen ihrem Rand und einem Crossover oder zwischen zwei Kreuzungen überqueren können.
Verwenden Sie die Standard-Parameter, klicken Sie auf OK. Die Software wird die Heftklammern nach diesen Parameter an die besten Kräften zu brechen (Abbildung 14).
- Löschen Sie alle Grundnahrungsmittel Crossover zwischen den Helices 29-30 und 61-0, damit diese Helices zu trennen und damit den Roboter zu öffnen. Löschen Grundnahrungsmittel Frequenzweichen erfordert einige manuelle Bearbeitung zu korrigieren Heftklammern, die zu kurz oder irrational als Ergebnis dieser Aktion geworden. Um dies richtig zu machen, folgen Sie den Anweisungen in den folgenden Abschnitten.
Achten Sie darauf, das Gerüst Frequenzweichen in den Abschnitten 3.2 und 3.3 erstellt intakt verlassen. - Betrachten Sie zum Beispiel die erste Klammer Crossover (Cyan und Schwarz Klammern) von der linken Seite zwischen den Helices 29 und 30 (Abbildung 15). Löschen Sie die beiden Brücken dieser Crossover durch Anklicken jedes Knie Point oder als Bridge so rot erscheint, dann schlagen DELETE (Abbildung 16).
- Seam die beiden Klammern auf Helix 29 durch Drücken von SHIFT und auf den nick zwischen ihnen. Ebenso Naht die drei Heftklammern auf Strang 30 zu einem einzigen Klammer (Abbildung 17). Staples kannmanuell erweitert werden oder durch Klicken auf eine Kante und zieht es nach Wunsch verkürzt. Achten Sie darauf, keine Grundnahrungsmittel zirkularisieren. Abbildung 18 zeigt die Kluft zwischen den Helices 29-30 nach vollständiger Bearbeitung von Grundnahrungsmitteln Frequenzweichen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für Helices 0 und 61, und manuell bearbeiten alle Heftklammern in jeder Spirale.
- Finde Klammern, die durch eine dicke Linie gezeichnet werden, das heißt, sie benötigen die weitere Bearbeitung. Untersuchen Sie jeden ein und ggf. korrigieren. Zum Beispiel können Heftklammern, die zu kurz sind gelöscht (Abbildung 19) oder verlängert werden soll, wenn möglich.
6. Gestalten Seite wird geladen Websites und Tore
- Zweitens auf die Website geladen Helices in der oberen Platte, und erweitern die resultierende Gerüst Strang Fragmente in der Bodenplatte, indem Sie auf eine Kante und zieht es nach Bedarf (Abbildung 20).
- Manuelles Hinzufügen von Heftklammern auf diese Fragmente Gerüst, indem Sie den orangefarbenen vertikalen Balken an der gewünschten Position entlang ter Gerüst, geht über die Führung Helices auf der linken Seite, SHIFT gedrückt halten und klicken. Dadurch wird eine Heftklammer Vorläufer an jedem Helix (Abbildung 21).
- Verlängern Sie die Heftklammer-Vorstufen in voller Länge als auch durch Klicken und Ziehen.
- Finde die rote Brücke Symbolen, bezeichnet erlaubt Crossover Positionen zwischen der Führung Strang (beispielsweise Helix 62) und dem Chassis (zum Beispiel Helix 3).
- Wählen Sie die günstige Lage, um einen Crossover einzuführen und auf die Brücke-Symbol (Abbildung 22). Eine günstige Lage erfordert minimale Bearbeitung bestehender Heftklammern in das Chassis.
- In der Führung Wendel (Helix 62), löschen die Klammer Teil, das nicht ein Teil der Ladestelle und verkürzen die teilnehmenden Teil auf die gewünschte Länge. Die gewünschte Länge sollte sowohl Spezifität für Laden verschiedener Arten von Fracht und Bindungsstärke. In der Regel sollte ein 18-mer Schwanz in Ordnung sein. Stellen Sie sicher, das Grundnahrungsmittel bleibt drawn durch eine dünne Linie, sonst bearbeiten, bis es ist.
- In dem Chassis, bearbeiten die geänderten Heftklammern wie nötig.
- Löschen Sie die Führung (Helix 62) und nur die Grundnahrungsmittel Erweiterung.
- Wiederholen Sie die Schritte 6,4-6,8 für alle Ladestellen (Abbildung 23).
7. Entwerfen Tor Strands
Die Gate-Stränge sind nur Litzen, mit Ausnahme der Achsen, die Verknüpfung Helices 29-30 und 61-0. Im Gegensatz zu den Achsen sind die Gate-Stränge nicht Frequenzweichen. Vielmehr hybridisieren sie eine doppelsträngige Segment, das als Sensor für die biologische Eingang dient der Wahl zu bilden. Wenn die Gate-Duplexe versetzt sind, kann der gesamte Roboter entropisch um die Achsen drehen und öffnen.
- Suchen Sie die richtige Position für Gate-Stränge. Diese werden Heftklammern auf sein Helices 29, 30, 61 und 0.
- Zum Beispiel untersuchen 29-30 Gate-Bereich. Es gibt günstige Grundnahrungsmittel Stränge flankierenden Helices 29 und 30 auf dierechten Seite des Gitters, das als Gate-Stränge verwendet werden können. Beachten Sie, dass sie entgegengesetzte Richtungen weisen.
- Klicken Sie auf die Kante eines der möglichen Gate Stränge, um es außerhalb der Form zu verlängern. Wenn die Kante liegt über einem Gerüst Crossover, könnten diese Auswahl, indem sichergestellt wird nur "Stap" (les) ausgewählt werden, indem Sie aus "Scaf" (fach) in der "Wählbar"-Symbolleiste auf der rechten oberen Seite der Benutzeroberfläche vereinfacht werden .
- Verlängern Sie die beiden Klammern an die Gate-Stränge bilden. Bearbeiten Sie die Klammern, wenn diese Erweiterung erfordert (Abbildung 24). Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Gate-Stränge Helices 0 und 61.
Beachten Sie, dass für jetzt, die tatsächliche Länge spielt keine Rolle, da der Sensor-DNA (zB Aptamer) wird die Gate-Strang-Sequenzen an die Sequenz abschließenden Schritt ersetzen.
8. Wählen Gerüst Sequence
- Klicken Sie auf "Seq"-Tool. Platzieren Sie den Cursor auf dem Schafott Strang und klicken. Ein Dialogfenster öffnet sich fragen uns,wählen Sie das Gerüst DNA-Quelle (Abbildung 25).
- Die Wahl der Ursprungs-DNA hängt stark von der Größe Roboter. Zum Beispiel, M13mp18 ssDNA (p7249) und seinem erweiterten Derivate (p7308 etc.), wurden in der Regel die Wahl für große DNA-Origami-Formen, passen, wenn das Gerüst Strang ~ 7 kb lang. Wenn das Gerüst des gestaltete Form ist wesentlich kürzer als der gewählten Quelle, der Überschuss Gerüst Strang, der nicht auf eine Klammer hybridisiert ist eine Schleife von ssDNA, der von der gefalteten Form. Während dies in der Regel stellt kleines Problem für relativ kurze Schlaufen könnte multi-kb langen Schleifen drastisch Faltung und Funktion des Roboters stören. Deshalb ist es wichtig, um die gewählte Quelle zu der Form Gerüstlänge passen.
Zum Beispiel, wenn das Gerüst Strang, um eine kleine Form ist ~ 1.600 Basen lang, die wesentlich kürzer als die voreingestellten Quellen im Dialogfeld falten benötigt, kann eine benutzerdefinierte Reihenfolgeals Gerüst verwendet werden. Mehrere Quellen berücksichtigt werden können. Zum Beispiel kann der M13mp18 mit einem spezifischen Restriktionsenzym, das ein Fragment der gewünschten Länge erzeugt verdaut werden. Entwerfen eine solche Quelle kann NebCutter (getan werden http://tools.neb.com/NEBcutter2/ ) durch Einfügen der Sequenz M13mp18 im NebCutter Eingabefenster und Mapping Restriktionsschnittstellen. Eine weitere Möglichkeit ist vorverdaut ssDNA, wie die phiX174 virion ssDNA HaeIII Digest, erhältlich von New England Biolabs verwenden.
- Im Dialogfeld klicken Sie auf "M13mp18". Beachten Sie, dass die gewählte DNA-Sequenz mit dem Gerüst und heften Stränge in der Bodenplatte wurde hinzugefügt.
9. Export Staple Sequence als Spreadsheet
- Klicken Sie auf "Export" in der oberen Symbolleiste, und wählen Sie ein Ziel Dateinamen für die Grundnahrungsmittel Liste. Klicken Sie auf "Speichern".
- Suchen Sie den Zielort. Csv-Datei und öffnen Sie sie.
- Die Tabelle zeigt die Klammer Liste, die geschickt wie ein DNA-Synthese Unternehmen werden kann. Die ersten beiden Spalten zeigen die Start-und End-Koordinaten, wobei die Zahl außerhalb der Klammer bezeichnet Helix und die Nummer in Klammern bezeichnen Grundposition.
10. Vergeben Tor und Ladesequenzen
- In der Klammer Liste, werden Sie feststellen, dass einige Sequenzen beginnen oder enden, mit einer Reihe von Fragezeichen "???". Diese Frage Markierungen kennzeichnen, dass da kein Gerüst Strang mit dieser spezifischen Regionen Grundnahrungsmittel, sie nicht komplementären Sequenzen zugeordnet werden. Dies sind in der Tat die Erweiterungen entwarfen wir für die Gate-Stränge und Ladestellen und daher diese müssen jetzt manuell zugeordnet werden. Gate:
- Die Tore bestimmen die Art der biologischen Eingang, auf dem der Roboter von inaktiven in den aktiven Zustand schaltet und setzen ihre Nutzlast. Jede einzelne dsDNA Tor kann als Reaktion auf eine biologische Eingang (oder mehr) kodieren, so dass ein Profil von Eingängen zum Roboter Aktivierung erforderlich definiert werden.
Nehmen wir zum Beispiel annehmen, dass die biologische Cue Auslösen Roboter Aktivierung ein Restriktionsenzym, das die Anwesenheit von infektiösen Bakterien geben könnte. - Betrachten wir zunächst, dass die Gate-ssDNA-Stränge nicht sofort nach der Verzweigung hybridisieren aus ihren Helices. Designing the Gate sonst vielleicht Hybridisierung während der Faltung zu behindern. Daher sollte jeder Zweig mit einem Abstandhalter Zeichenfolge beginnen. Wir verwenden in der Regel Poly-T als Abstandshalter Saiten, als diese Sequenz bietet Flexibilität.
- Darüber hinaus wird vorausgesetzt, dass die Länge der Gate-Hybridisierungsbereich 20 Basen ist, die die Target-Beschränkung sitE in der Mitte.
- Daher das Tor könnte wie folgt aussehen:
[Helix 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTxxxxxxGCTAGAG-3 '
[Helix 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAxxxxxxCGATCTC-5 '
Der "....." bezeichnen die Klammer Region, die mit dem Gerüst Strang hybridisiert, hat daher eine Sequenz bereits und sollte nicht geändert werden.
Die zufällige duplex "GTGAGTT" und seine Ergänzung stellt die Restriktionsschnittstelle ist nicht teilweise offen und bietet einige zusätzliche Basen effektive Verdauung durch das Enzym zu gewährleisten.
Das "x" steht für die Restriktionsschnittstelle.
Die zufällige duplex "GCTAGAG" und sein Komplement bieten einige zusätzliche Basen für das Enzym effizient zu arbeiten, sondern stellt auch sicher, das Tor Strang ausreichend lang, um gute Roboter Schließung zu gewährleisten.
Vor der Auswahl einer Restriktionsschnittstelle als Ziel, sicherzustellen, dass der gesamte Roboter Struktur, Be-Websites und andere Teil des Tores selbst nicht durch das verdauteEnzym der Wahl. In dieser Prüfung, die NEBCutter 0-Cutter Liste (Enzyme, die nicht schneiden die gesamte Sequenz) hervorgehoben EagI, aus der Enterobacter Pantoea agglomerans isoliert, als potentielle Enzym, das die Anwesenheit eines enterobakteriellen Infektionskrankheiten hinweisen könnte. - Das Tor sieht nun so aus (gelbe Markierungen EagI Restriktionsschnittstelle):
[Helix 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTCGGCCGGCTAGAG-3 '
[Helix 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAGCCGGCCGATCTC-5 '
Beachten Sie, dass diese Konstruktion wird vorausgesetzt, dass nach der Verdauung wird die Sequenz "GTGAGTTCGG" (T m = 32 ° C) nicht ausreichend lang ist oder thermodynamisch stabil zu halten, der Roboter geschlossen mehr. Diese Annahme wird wahrscheinlich benötigen, um experimentell überprüft werden. - Das zweite Gate kann die gleiche sein, wobei der Roboter nur um ein Enzym zu reagieren, oder mit einer anderen Stelle ausgebildet sein, wodurch die Spezifität des Roboters. Weitere Restriktionsstellen können auf dem gleichen Strang aufgenommen werden, Erhöhen der Komplexität und Spezifität des Roboters.
- Die Tore bestimmen die Art der biologischen Eingang, auf dem der Roboter von inaktiven in den aktiven Zustand schaltet und setzen ihre Nutzlast. Jede einzelne dsDNA Tor kann als Reaktion auf eine biologische Eingang (oder mehr) kodieren, so dass ein Profil von Eingängen zum Roboter Aktivierung erforderlich definiert werden.
- Lädt Seiten:
- Die Beladung Website kann eine universelle Sequenz sein. Alternativ können Ladestellen auf einzigartige Sequenzen, die Modularität verringern aber verbessern Kontrolle über cargo Orientierung und Verhältnissen (für verschiedene Arten von Fracht) basieren wird.
- Schließlich sollten die Ladestelle Oligonukleotide umfassen eine chemische funktionelle Gruppe damit sie mit jedem Nutzlast konjugieren: Eiweiß, Nanopartikel, etc. Stellen Sie sicher, dass die chemische Gruppe auf dem richtigen Ende (5 'oder 3') befestigt ist, nach der Klammer Richtung .
11. Simulieren Ergebnisse in CANDO
- Nachdem der Job als. Json-Datei gespeichert wird, kann es zu CANDO zur Analyse hochgeladen werden. CANDO ist eine Finite-Elemente-Simulation der DNA-Struktur, die ihre Steifigkeit und Stabilität in Lösung 21 schätzen.
- Gehe zuami.org / "target =" _blank "> http://cando-dna-origami.org/
- Klicken Sie auf "Einen caDNAno Datei zur Analyse" und füllen Sie alle notwendigen Informationen.
- Analysis in CANDO dauert in der Regel bis zu 15-20 min. Am Ende können Sie eine E-Mail-Nachricht uns die Analyse abgeschlossen ist, mit einem Link, um die Simulationsergebnisse (Abbildung 26) herunterzuladen.
12. Bestellen DNA und Falzen der Roboter
Sobald das Design abgeschlossen ist und CANDO Analyse zeigt zufriedenstellende Vorhersage des Produkts, das Grundnahrungsmittel Strang Liste in den Abschnitten 9-10 bestellt werden können generiert. In der Regel müssen Grundnahrungsmittel Stränge keine besondere Reinigung, aber es wird empfohlen, mit besonderer Zweckbestimmung Stränge wie Tore oder Ladestellen durch HPLC gereinigt werden.
Die folgenden Schritte, um DNA, nämlich Falten, Reinigung und Bewertung von Produkten einschließlich der Visualisierung der gefalteten Struktur entweder durch atomic forceMikroskopie (AFM) oder Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) liegen außerhalb des Geltungsbereichs dieses Papier, und kann in früheren Berichten 17,18,20,21 gefunden werden. Eine TEM-Aufnahme des Roboters ausgelegt ist hier als Beispiel (Fig. 27) gebracht wird. Probenvorbereitung und Färbung wurde genau wie an anderer Stelle beschrieben 21 durchgeführt.
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Representative Results
Die Zahlen 1-25 sind Screenshots der caDNAno 2.0-Schnittstelle, die den Design-Prozess Schritt-für-Schritt. Der Querschnitt der Form wurde zuerst skizziert (Abbildung 3), gefolgt durch automatische Zugabe von Gerüst Strang Fragmente und Fertigstellung des gesamten Gerüst Pfad (Abbildung 7). Staple Stränge werden automatisch hinzugefügt (Abbildung 12), gebrochen nach benutzerdefinierten Parametern (Abbildung 14), und manuell bearbeitet werden, um die Klammern zu der gewünschten Funktion des Gerätes (Abb. 15-18) anzupassen. Figuren 23-24 beschreiben, wie Be- Ort und Gate-Stränge erstellt und bearbeitet wird. Schließlich zeigt Abbildung 27 eine TEM-Aufnahme des Modells konzipiert hier.
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Abbildung 1. Ein 3D-Modell des fertigen Roboter durch caDNAno 2.0 entworfen und gefertigt von Autodesk Maya 2012.
Abbildung 2. Ein Blick auf die caDNAno 2.0/Autodesk Maya 2012 design-Schnittstelle. Oberseite: Gitterrost für umreißt die ursprüngliche Form. Bodenplatte: Editing-Panel. Rechts:. 3D-Modell-Generator (siehe Abschnitt 2.1) Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 3. Zeichnen Sie den Abschnitt von der Form auf der Oberseite panel (siehe Abschnitt 2.3).
Abbildung 4. Unten (Bearbeitung) Panel caDNAno 2.0. Die orange vertikale Balken bestimmt, wo entlang des Rasters Bearbeitungsaktionen auftreten. Die grauen Pfeile auf der rechten oberen Ecke werden verwendet, um das Gitter zu beiden Seiten erstrecken (siehe Abschnitt 2.4).
Abbildung 5. Ein Entwurf des Gerüsts Strang nach dem ersten Entwurf in der Oberseite (siehe Abschnitt 2.5). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Abbildung 6. Auswahl aller Gerüst Strangweg Kanten und sich den Weg auf die gewünschte Länge (siehe Abschnitt 2.7).
Abbildung 7. Ein allgemeiner Blick auf den unteren und rechten Panels zeigen, wie das 3D-Modell Änderungen in Echtzeit zusammen mit der Bearbeitung von Aktionen. Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Abbildung 8. Die blauen Brücke zwischen den Helices Icons kennzeichnen die Stellen, an denen Gerüst Frequenzweichen sind erlaubt (rote Symbole beziehen sich auf Grundnahrungsmittel Frequenzweichen und noch nicht gezeigt, siehe Abschnitt 2.9).
Abbildung 9. Erstellen neuer Gerüst Frequenzweichen indem Sie auf die Brücke Ikonen der Wahl (siehe Abschnitt 2.10).
Abbildung 10. Anlegen einer Achse (ein Crossover ein nah wie möglich an der linken Seite des Gitters) zwischen den Helices 29 und 30 (siehe Abschnitt 3.2).
Abbildung 11. Hinzufügen Helices, die die Verzweigung der Ladestellen (siehe Abschnitt 4.1) zu führen.
Abbildung 12. Den Bauplan nach dem "AutoStaple" Aktion. Die Grundnahrungsmittel Farben in der Bodenplatte und der rechten Seite sind konsistent (siehe Abschnitt 5.1). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 13. Die "AutoBreak" Dialog, in dem die Benutzer können festlegen, AutoBreak Parameter (siehe Abschnitt 5.2).
Abbildung 14. Die Blaupause nach dem "AutoBreak"-Aktion (siehe Abschnitt 5.2). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 15 Manuelle Bearbeitung von Heftklammern I:. Ortung Klammern, die über Kreuz von Helix 29 und 30 und sollte gestrichen werden.
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Abbildung 16 Manuelle Bearbeitung von Heftklammern II:. Löschen der Brücken zwischen den Klammern befindet.
Abbildung 17 Manuelle Bearbeitung von Heftklammern III:. Säumen die Kerben entlang fragmentierten Heftklammern (siehe Abschnitt 5.5).
Abbildung 18. Die gesamte Lücke zwischen den Helices 29-30 zeigt keine Übergänge verbinden die beiden (siehe Abschnitt 5.5). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Abbildung 19. Manuelle Bearbeitung von Heftklammern in dicke Linie (bezeichnet sie sind entweder zu kurz, zu lang oder kreisförmige, siehe Abschnitt 5.6) erstellt.
Abbildung 20. Hinzufügen Führung Helices zum Laden Website Verzweigung (siehe Abschnitt 6.1). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Abbildung 21. Manuelle Zugabe von Grundnahrungsmitteln Stränge zum Reiseführer Helices, so Verzweigungen können befindet (siehe Abschnitt 6.2). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 22. Einführung einer Ladestelle Übergang zum Roboter-Chassis Gerüst in verkehrsgünstiger Lage (eine, die minimale Bearbeitung von Chassis Klammern benötigt, siehe Abschnitt 6.5).
Abbildung 23. Der Ladestelle Heftklammern Ansehen als in th gesehene Bodenplatte nach dem Entfernen der Führung Helices, die nicht mehr notwendig sind (siehe Abschnitt 6.9).
Abbildung 24. Erweitern zwei Klammern, die gehen, um als Gate-Stränge verwendet werden, von Helices 29 und 30 sind. Beachten Sie, dass die beiden Stränge entgegengesetzte Richtungen, die zwingend für die Bildung des Gate-duplex (siehe Abschnitt 7.4) ist zu stellen. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 25. Das Gerüst Sequenz Zugabe ("Seq" Werkzeug) DialogBox, so dass entweder eine der vordefinierten Gerüste wählen, oder eine benutzerdefinierte Reihenfolge einfügen (siehe Abschnitt 8.1).
Abbildung 26. Ergebnisse CANDO Analyse des Design hier beschrieben. Die Simulation erzeugt eine. Zip-Archiv enthält die verschiedenen Dateien, die die gewünschten Informationen liefern. Hier werden die RMSF (root mean square Schwankung)-Dateien (. Png) dargestellt sind, zeigt ein Modell des Design aus 3 Blickwinkeln, gefärbt nach dem Schlüssel in der beigefügten Datei "HeatMap4RMSF.txt" beschrieben. In diesem Fall ist mindestens RMSF (blauesten) 1,03 nm, und 95% RMSF (redest) ist 3.19 nm. Die Steigung der Farbe über das Modell stammt aus der Polarität des Roboters (Tore in "Front", Achse 'back') und der Tatsache, dass es keine Verbindung Heftklammern entlang Helices 29-30 und 61-0, wodurch die "Front 'Seite stärker schwanken als die "zurück"Seite.
Abbildung 27. TEM-Bild des Roboters in diesem Artikel bestimmt. Probenvorbereitung und Färbung wurde genau wie an anderer Stelle beschrieben 21 durchgeführt.
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Discussion
DNA-Origami ermöglicht es uns, genau definierten Objekten mit beliebigen Eigenschaften im Nanobereich herzustellen. Ein wichtiger nächster Schritt wäre die Integration der Funktion werden in dieser Entwürfe. Während viele Anwendungen und Herausforderungen, die mit dieser Technik behandelt werden könnten, gibt es ein besonderes Interesse an der Herstellung von therapeutischen und wissenschaftlichen Roboter aus DNA-Origami, da diese eine natürliche Milieu der DNA darstellen. DNA bereits Schnittstellen zu molekularen Maschinen in den Zellen als genetische Information Speichermedium. Interessant ist, dass der gefaltete DNA in einer nanorobot oder einer anderen Maschine noch als genetische Information dienen zusätzlich dazu, dass ein Baustoff, der zur Expression eines gewünschten Proteins nach nanorobot zerfällt weitergeleitet werden kann, als Teile einer Folge von Ausgängen.
Bei dem in dieser Veröffentlichung diskutiert, verwenden wir ein Restriktionsenzym, um den Roboter zu arbeiten. Jedoch zusätzliche Mechanismen, durch die DNA Roboter Verantwortungd Eingaben sind die folgenden.
Molekulare Erkennung: wir kürzlich gezeigt Aptamer-basierten DNA Tore für Roboter, die Protein-Moleküle auf der Oberfläche erkennen auf Zielzellen 20. Aptamere können in-vitro ausgewählt werden mit Methoden wie SELEX 23, ausgelagert aus Unternehmen, oder verwendet von der Aptamer-Datenbank ( http://aptamer.icmb.utexas.edu/ ). Wenn Aptamere eingesetzt werden, ist es wichtig, zu berücksichtigen, dass der Strang komplementär zu dem Aptamer, der zusammen das Tor, entworfen werden können, Fehlanpassungen, erleichtern die Bindung des Aptamers Liganden und Verschiebung des komplementären Stranges wird erweitert. Während der Mechanismus so ist nicht bekannt, kann die Empfindlichkeit und Spezifität eines aptamerbasierten Gate durch Erhöhen oder Verringern der% der Abweichung zwischen den beiden Strängen abgestimmt werden, um entweder eine sehr hohe, aber ineffiziente Tor, oder einen schnellen erhaltenaber undicht eins.
Enzymatische Spaltung: dafür, die Tore sollten so gestaltet werden, dass sie das Substrat dieses Enzyms enthalten. Beispielsweise kann ein kleines Peptid Substrat einer Protease, die aus beiden Seiten des Tores, das Halten der Roboter geschlossen in Abwesenheit des Enzyms gebunden werden.
Fernsteuerung: ein möglicher Ansatz die nicht an DNA Maschinen angewandt wurde, mit einem Gold-Nanokristall Antenne in einem hochfrequenten elektromagnetischen Feld dsDNA Schmelzpunkt 24 zu induzieren. Dies kann eine Benutzer-schalter neben bio-responsive diejenigen. Obwohl DNA-Origami-Roboter relativ einfach zu entwerfen und herzustellen sind, stellen sie mehrere technische Herausforderungen als therapeutische Plattform. DNA ist nicht ein ideales Material für Drug-Delivery, da es sehr anfällig für Spaltung durch Nukleasen ist. Darüber hinaus könnte es auszufällen einer Immunantwort. Eine gründliche Untersuchung des Verhaltens von DNA-Origami-Objekte in einem Organismus ist needed ihrem Schicksal zu definieren und sicherzustellen, dass sie nicht in den Geweben Aggregat oder Integration in das Genom des Wirts.
Zusammenfassend haben wir den Einsatz von caDNAno, eine einfache, robuste CAD-Tool zum Entwerfen DNA-Origami-Formen. Wir hoffen, zu sehen, beginnen anwendungsorientierte Forschung in DNA-Origami, in Bereichen wie Therapeutika, Energie, Metamaterialien und Bildung. In all diesen Orten wird caDNAno voraussichtlich einen erheblichen Einfluss auf die Realisierung der Lösungen. In Zukunft könnte es ein Industrie-und Design-Standard, der ersetzt (oder Teile davon können) können von jedem Benutzer werden, weil sie alle kompatibel sind geworden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken S. Douglas für extrem wertvolle Diskussionen und Ratschläge, und alle Mitglieder der Bachelet Labor für hilfreiche Diskussionen und Arbeit danken. Diese Arbeit wird durch Zuschüsse aus der Fakultät für Life Sciences und Institut für Nanotechnologie und Advanced Materials an der Bar-Ilan-Universität unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autodesk Maya 2012 | Autodesk | A student/academic account needs to be created first (see platform-specific instructions in http://cadnano.org) | |
| caDNAno 2.0 (software) | (Open source) | Software for the design of DNA origami structures http://cadnano.org | |
| Cando (webpage) | (Open source) | Webpage running a simulator of DNA origami shapes http://cando-dna-origami.org |
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