Utforme en Bio-responsive Robot fra DNA Origami

Summary

DNA origami er en kraftig metode for fabrikasjon presise nanoskala gjenstander ved å programmere selv-montering av DNA-molekyler. Her beskriver vi hvordan DNA origami kan brukes til å designe en robot robot som kan registrere biologiske signaler og reagere etter form skiftende, senere videresendt til en ønsket effekt.

Abstract

Nukleinsyrer er utrolig allsidig. I tillegg til deres naturlig rolle som lagringsmedium for biologisk informasjon ^en, kan de anvendes i parallell databehandling ^2,3, gjenkjenne og binde cellulære eller molekylære mål ^4,5, katalysere kjemiske reaksjoner ^6,7 og generere beregnede responser i en biologisk system ^8,9. Viktigere, kan nukleinsyrer være programmert til å selv montere inn 2D-og 3D-strukturer ^10-12, muliggjør integrasjon av alle disse bemerkelsesverdige funksjonene i en enkelt robot knytter sensing av biologiske signaler til en forhåndsinnstilt respons for å utøve en ønsket effekt.

Lage figurer fra nukleinsyrer ble først foreslått av Seeman ^13, og flere varianter på dette temaet har siden blitt realisert ved hjelp av ulike teknikker ^11,12,14,15. Imidlertid er den viktigste kanskje den som foreslås av Rothemund, kalt scaffolded DNA origami16. I denne teknikken blir bretting av en lang (> 7000 baser) enkelt-trådet DNA "stillas 'ledet til en ønsket form av hundrevis av korte komplementære tråder betegnet' stifter '. Folding utføres ved temperatur Annealing rampen. Denne teknikken ble demonstrert i etableringen av et variert utvalg av 2D-figurer med bemerkelsesverdig presisjon og robusthet. DNA origami ble senere utvidet til 3D i tillegg ^17,18.

Dagens papir vil fokusere på caDNAno 2.0-programvaren ¹⁹ utviklet av Douglas og kolleger. caDNAno er en robust, brukervennlig DAK-verktøyet muliggjør utformingen av 2D og 3D DNA origami figurer med allsidige funksjoner. Designprosessen er avhengig av en systematisk og nøyaktig abstraksjon ordning for DNA strukturer, noe som gjør det relativt enkelt og effektivt.

I denne artikkelen viser vi utformingen av en DNA origami nanorobot som nylig er beskrevet ^20. Denne roboten er "robot" i den forstand at den kobler sensing til aktivering, for å utføre en oppgave. Vi forklarer hvordan ulike sensing ordninger kan integreres i strukturen, og hvordan dette kan bli videresendt til en ønsket effekt. Til slutt bruker vi Cando ²¹ for å simulere de mekaniske egenskapene til designet form. Konseptet vi diskutere kan tilpasses flere oppgaver og innstillinger.

Protocol

Roboten vil vi utforme i dette papiret svarer til et protein P ved å lage en last C tilgjengelig for å bindes til reseptorer på overflaten av en utvalgt målcelle. Roboten er vist i figur 1 C kan være en reseptor-blokkerende medikament,. En vekstfaktor etc., og en måte for kjemisk å knytte den til en DNA-oligonukleotid må være tilgjengelig som ikke ødelegger dets funksjon. Roboten har to stater. Når inaktive, DNA portene på de to eksterne 'lepper' er hybridisert, noe som gjør at roboten forblir lukket slik at enhver last lastet innen den er godt sequestered. I nærvær av protein P, portene kan åpnes enten ved en av flere mekanismer (omtalt nedenfor) slik at roboten for å åpne og utsette lasten. Ved utformingen av strukturen, mener at roboten må være fleksibel nok til å lukke på seg selv i lukket tilstand, og våren til åpen tilstand når portene gjør det mulig å gjøre det. Modellering av oppførsel av en DNA struktur integrere termodynamiske og mekaniske komponenter er vanskelig, og selve objektet kan kreve litt iterativ forbedring. Likevel, her er vi fokusere på design prosessen med en generell fungerende modell, som kan bygges på.

Note

For en mer helhetlig forståelse av prosessen med DNA origami design og folding, vi anbefaler å lese den opprinnelige caDNAno papir ved Douglas og kolleger ¹⁹ som forklarer den abstrakt representasjon av DNA i design grensesnitt og hvordan den forholder seg til den faktiske molekylære strukturen av en 3D DNA form. Dette papiret er ledsaget av to video tutorials som beskriver caDNAno representasjon og grensesnitt i en veldig klar måte. I tillegg anbefaler vi å lese mer nyere artikkel av Dietz og kolleger beskriver mange viktige aspekter og detaljerte protokoller for folding prosessen, inkludert Cando analyseverktøyet ^21.

tle "> en. Last ned og installer caDNAno 2.0 og Autodesk Maya 2012

Merk: Autodesk programvaren er gratis for studenter og vitenskapelig bruk. Instruksjonene nedenfor inkluderer å sette opp en akademisk konto hos Autodesk.

1. Lag en akademisk konto på http://students.autodesk.com/ . Etter å ha mottatt kontooppsettet e-post, kan du klikke aktiverings-link og fyll inn dine preferanser som ønsket.
2. Last ned gratis versjon av Maya 2012 fra Download Center.
3. Installer Maya 2012 på datamaskinen.
4. Kjør Maya gang før du installerer caDNAno 2.0.
5. Last ned og installer den nyeste versjonen av caDNAno 2,0 fra http://cadnano.org/ .
6. Kjør Maya 2012. En caDNAno ikoner som skal vises øverst i høyre hjørne av det grafiske brukergrensesnittet. Klikk på ikonet for å gå inn caDNAno.

2. Outline ønsket form og Stillas Strand Sti

1. Utformingen av grensesnittet caDNAno innenfor Maya omfatter tre paneler (figur 2):
   1. Topplate: gitter utsikt, hvor formen er i utgangspunktet skissert. Dette panelet gir dobbel helix-nivå handlinger og gir et snitt av formen.
   2. Bunnpanel: redigering panel, slik at enkelt base-nivå handlinger.
   3. Høyre panel: en Maya-generert sanntids 3D-modell av formen
2. Klikk på "Honeycomb"-ikonet. Zoomer inn på og ut av gitteret i topplaten kan gjøres ved mus bla opp og ned, hhv.
   caDNAno kan to mulige motiv gittere, honeycomb og torg, i denne artikkelen vil vi bruke honeycomb layout, selv om firkantet gitter kan generelt benyttes i tillegg ^22.
3. Start med å tegne den delen av den ønskede formen på venstre panel.
   Hver sirkel representerer en dobbel DNA-spiralen. Til choose de helices som bygger formen, bare venstre-klikk på deres senter (figur 3). Fortsett helix av helix til hele formen er skissert. Alternativt kan formen bli trukket ved å trykke på venstre museknapp og kontinuerlig tegne figuren sin disposisjon. Enhver handling kan angres ved å klikke på Edit-menyen og "Angre", eller med hurtigtasten Ctrl + Z (PC) eller CMD + Z (Mac).
   På dette punktet, vil de valgte helices se gul ut. Samtidig, vil den nederste panel viser et sideriss av den form, som består av disse helikser. Den heliks nummereringen i bunnfeltet er forenlig med en nummerering på den øverste.
4. Observere det nedre panelet. Hver heliks er representert med to rekker av kvadrater: radene er de to tråder av dobbeltspiralen, med hver firkant representerer en base (figur 4).
   Den oransje vertikale linjen avgjør hvor redigering handlinger foregå langs en helix. Basen posisjon langs risten som viseset tall over den oransje bar. Helix Rammeverket er standard lengde er 42 baser. Lengden kan utvides ved å klikke på en av de grå pilene øverst i høyre hjørne av redigering panel og velge uttrekkingslengde (i multipler av 21, som tilsvarer to fulle omdreininger av DNA-spiralen, der en omdreining spenner 10.5 baser) (figur 4). Risten vil forlenges til retningen av den valgte pilen.
5. For å plotte selve stillaset strand sti gjennom formen, trykker museknappen, starter fra første helix og gå kontinuerlig over alle helices følger samme rekkefølge som de ble først valgt i avsnitt 2.3. Merk at:
   1. De helices valgt denne gangen vil skifte farge til oransje.
   2. På den nederste delen, vil stillaset strand fragmenter automatisk bli trukket på de valgte helices.
   3. På høyre side vise 3D-modellen av formen bygges i sanntid. Ved slutten av denneprosessen, et utkast av stillaset strand banen vil bli automatisk trukket i bunnen panel (figur 5).
6. Tegn et rektangel rundt alle lengst til venstre kant av stillaset banen. Legg merke til at kantene så valgte vises røde (figur 6).
7. Utvide stillaset bane ved å dra de valgte kantene som en gruppe til venstre side av nettet. Gjenta denne prosessen for de rette kantene før banen er riktig forlenges. Legg merke til at stillaset forlengelse også utvider 3D-form i panelet til høyre (figur 7).
8. Lokalisere stillaset sti deler som er isolert fra resten, og koble dem. I formen vår, for eksempel helices 0-9 danne en isolert del. Helix 9 behov for å bli koblet til helix 12 (merk at helices 9 og 10 er ikke grenser i form [topplaten] slik at de ikke kan kobles til).
9. Zoome inn på de strengene som skal kobles, og ved hjelp av "Select"-verktøyet klikker på et punkt på enav strengene. Ved å klikke på et punkt langs en blå stillas fragment, 'bro' ikoner vises mellom helices, betegner posisjoner hvor crossovers er tillatt. I disse stillinger, baser i tilstøtende helikser vender direkte mot hverandre, slik at strengene til å krysse over fra heliks til heliksen uten å deformere eller vridning DNA. Tallet som vises ved siden av hver bro ikonet indikerer antall helix det vil crossover til (Figur 8).
10. For å opprette crossovers, til venstre klikker broen ikonet av valget. Et stillas crossover vil bli generert, noe som betyr at stillaset krysser ved dette punkt fra heliks til heliksen (figur 9). Gjenta denne prosessen til stillaset traverserer alle helices og skaper en lukket sløyfe som spenner over hele formen, etterlot ingen regioner som er isolert fra resten av formen.
    Legg merke til at mens crossovers ser ut til å strekke seg over en distanse i programvaren, i virkeligheten de ikke inkludere noen DNA basen. Fysisk, crossover"Bro" inneholder bare én fosfat enhet av DNA ryggrad som forbinder de to baser fra de tilstøtende helices sammen.
11. Før du går videre til neste trinn, sørge for at hele stillaset er kontinuerlig, og ingen del av det er isolert fra de andre.

3. Definer åpningsmekanisme Axes

Den beskrevne roboten åpnes som svar på en biologisk definert inngang for å eksponere sin nyttelast. Åpningen finner sted i et skall-aktig måte, med to halvdeler (helices 0-29 utgjør den ene halvdelen, helikser 30-61 utgjør den andre halvparten) kretser rundt to akser. Aksene er dannet av crossovers mellom helices 29-30 og 61-0, som er de eneste crossovers mellom disse halvdeler og er plassert bare i eller nær venstre kant av nettet. Høyre kant vil inneholde gate tråder (omtalt nedenfor).

1. Slett den eksisterende crossover mellom helices 29-30. For å slette crossover, klikk på "kneet" poenget i noen tråd.Dette etterlater et nick i begge tilnærmingene der crossover pleide å være. Til søm de kutt, trykker du SKIFT og klikker hver nick.
2. Opprett en ny crossover mellom helices 29-30 så nært som mulig til venstre kant av nettet (Figur 10).
3. Opprett en ny crossover mellom helices 61 og 0 så nært som mulig til venstre kant av nettet.

4. Definer Nyttelast festesteder

Etter at vi er ferdig med å plotte stillaset strand banen, må vi definere nyttelast vedlegg (lasting) nettsteder. Lasting steder er faktisk stifting tråder som strekker seg ut av sine helices som enkelkjedede filialer ". Det er derfor viktig å definere svært nøyaktig hvor langs helix denne forgrening skjer, for å sørge for at det strekker seg i ønsket retning. Hvis vi definerer stift utvidelser vilkårlig, kan lasting steder oppstå på den ytre side av roboten i stedet for den interne siden.

To sørge for en stift strekker seg til en bestemt retning, plotte vi en ekstra helix, som fungerer som guider for retningsbestemt forgrening av stiften fra hoveddelen. Etter utvide ønsket lasting nettstedet stift, er guiden helix fjernet.

1. La oss definere fire lasting nettsider som vender mot den indre side av roboten. Lasting områder vil armen ut av tre helices, 27, 34, og 58. For hvert område, i topplaten klikke helix umiddelbart tilstøtende til disse helikser som står overfor den indre side (figur 11). Dette vil legge til helices til rutenettet i det nedre panelet. Ikke nest klikke disse helices ennå.

5. Legge til og redigere Staples

1. Klikk "AutoStaple". Programvaren vil automatisk legge stifte sekvenser i forskjellige farger (Figur 12). Merk at stiftene har blitt lagt til 3D-formen i panelet til høyre. Staple farger er konsistente for de nederste og høyre paneler. I tilpå, er det en indikator på nedre venstre hjørne av grensesnittet, noe som indikerer en stift.
   Merk: stifter kan ikke være for lang, for kort eller rundskriv. De fleste av de stifter genereres her ikke oppfyller disse kriteriene, og må bli redigert. Det første trinnet i å redigere dem skjer automatisk (se neste trinn).
2. Klikk "autobreak". En dialogboks vil åpnes (Figur 13), ber om brukerdefinerte parametere for denne handlingen:
   1. Mållengden (bp): ventet lengde stift hvis mulig
   2. Min lengde (bp): minimal lengde for en stift
   3. Maks lengde (bp): maksimal tillatt lengde for en stift
   4. Minst dist til Xover (bp): minimalt antall basepar en stift kan bla mellom sin kant og en crossover eller mellom to crossovers.
      Bruk standard parametere, klikker du OK. Programvaren vil bryte stifter i henhold til disse parametrene etter beste evne (Figur 14).
3. Slett alle stiften crossovers mellom helices 29-30 og 61-0, slik at disse helices å skille og sørge for at roboten til å åpne. Slette stifte crossovers vil kreve litt manuell redigering å rette stifter som blir for kort eller irrasjonelle som følge av denne handlingen. For å gjøre dette riktig, følger du instruksjonene i de neste avsnittene.
   Sørg for å forlate stillaset crossovers som er opprettet i pkt. 3.2 og 3.3 intakt.
4. Tenk for eksempel, den første stift crossover (cyan og sort stifter) fra venstre helikser mellom 29 og 30 (figur 15). Slett begge broer av denne crossover ved å klikke på hver knekkpunktet eller bro så det ser rødt, så treffer DELETE (Figur 16).
5. Seam de to stifter på helix 29 ved å trykke Shift og klikke på nick mellom dem. Tilsvarende søm de tre stifter på tråd 30 til en enkelt stift (figur 17). Staples kanmanuelt forlenges eller forkortes ved å klikke på en kant og dra den etter ønske. Pass på å ikke sirkulær noen stift. Figur 18 viser gapet mellom helices 29-30 etter fullstendig redigering av stift crossovers. Gjenta denne prosessen for helices 0 og 61, og manuelt redigere alle stifter i hver helix.
6. Finn stifter som er tegnet av en tykk linje, noe som betyr at de krever videre redigering. Undersøk hver en og korrigere etter behov. For eksempel kan kramper som er for kort slettes (Figur 19) eller forlenges dersom det er mulig.

6. Lag Laster Nettsteder og Gates

1. Second-klikk velteplass, helices i topplaten, og utvide de resulterende stillaset tråd fragmenter i det nedre panelet ved å klikke på en kant og dra det etter ønske (Figur 20).
2. Manuelt legge stifter til disse stillaset fragmenter ved å plassere den oransje loddrett strek på ønsket posisjon langs tHan stillas, gå over guiden helices på venstre panel, holder SKIFT og klikke. Dette vil legge en stift forløper på hver helix (Figur 21).
3. Utvide stiften forløpere til full lengde, så vel ved å klikke og dra.
4. Plasser de Red Bridge ikoner, betegner tillatt crossover posisjoner mellom guiden tråd (for eksempel heliks 62) og chassiset (for eksempel heliks 3).
5. Velg den mest passende sted å innføre en crossover og klikk broen ikonet (Figur 22). En praktisk beliggenhet krever minimalt med redigering av eksisterende stifter i kabinettet.
6. I guiden helix (helix 62), slett stiften del som ikke er en del av lasting området, og forkorte deltakende delen til ønsket lengde. Ønsket lengde bør gi både spesifisitet du legger ulike typer last, og bindende styrke. Vanligvis bør en 18-mer halen være i orden. Kontroller at stiften er fortsatt dramatiskwn av en tynn linje, ellers redigere det før det er.
7. I chassiset, redigere de endrede stifter som nødvendig.
8. Slette guide (helix 62) slik at bare stift forlengelse.
9. Gjenta trinn 06.04 til 06.08 for alle lasting nettsteder (Figur 23).

7. Designing Gate Strands

Porten tråder er de eneste tråder, med unntak av aksene, linking helikser 29-30 og 61-0. I motsetning til aksene, gate-strengene er ikke oversteg. Snarere hybridisere de til å danne en dobbelt-trådet segment som tjener som sensor for det biologiske input av valget. Når porten tomannsboliger er på flukt, kan hele roboten entropically dreie seg om aksene og åpne.

1. Finn de riktige posisjoner for gate tråder. Disse vil være kramper 29. helikser, 30, 61, og 0.
2. For eksempel undersøke 29-30 gateelektrodeområdet. Det er praktisk stifting tråder flankerer helices 29 og 30 påhøyre side av gitteret, som kan brukes som gate-tråder. Legg merke til at de står overfor motsatte retninger.
3. Klikke på kanten av en av de potensielle gate strengene for å forlenge det i utsiden av formen. Hvis kanten ligger over et stillas crossover, kunne sitt utvalg forenkles ved å sørge only "Stap" (les) kan velges ved å klikke off "Scaf" (fold) i "valgbar" verktøylinjen øverst til høyre side av grensesnittet .
4. Strekker begge stifter å danne gate tråder. Redigere stifter hvis denne utvidelsen krever det (Figur 24). Gjenta dette for porten tråder av helices 0 og 61.
   Merk at for nå, ikke den faktiske lengden ikke saken, siden sensoren DNA (f.eks aptamer) vil erstatte gate tråd sekvenser på sekvensen ferdigstillelse trinn.

8. Velg Stillas Sequence

1. Klikk på "Sekv"-verktøyet. Plasser markøren hvor som helst på stillaset strand og klikk. En dialogboks åpnes be oss om åvelge stillaset DNA kilde (Figur 25).
2. Velge kilde DNA avhenger mye av robot størrelse. For eksempel M13mp18 ssDNA (p7249), og dens utvidede derivater (p7308 etc.) som har generelt vært valget for store DNA-origami figurer, passer når stillaset strand er ~ 7 kb lang. Dersom stillaset av formen er utformet vesentlig kortere enn den valgte kilde, vil det overskytende stillaset tråd som ikke er hybridisert til en hvilken som helst stift lage en løkke av ssDNA som stikker ut fra den brettede formen. Selv om dette vanligvis utgjør liten problem for relativt korte løkker, kan multi-kb lange sløyfer drastisk forstyrre bretting og funksjon av roboten. Derfor er det viktig å passe den valgte kilde til formen stillaset lengde.

For eksempel, dersom stillaset tråd nødvendig å brette en liten form er ~ 1600 baser lang, noe som er vesentlig kortere enn de forhåndsinnstilte kilder i dialogboksen, en tilpasset sekvens kanbenyttes som stillas. Flere kilder kan bli vurdert. For eksempel kan den M13mp18 bli fordøyd med en spesifikk restriksjon enzym som produserer et fragment av den ønskede lengde. Utforme en slik kilde kan gjøres på NebCutter ( http://tools.neb.com/NEBcutter2/ ) ved å lime inn M13mp18 sekvens i NebCutter innspill vinduet, og kartlegging restriksjonsseter. Et annet alternativ er å bruke pre-fordøyd ssDNA, slik som phiX174 virion ssDNA Haelll fordøye, tilgjengelig fra New England Biolabs.

3. I dialogboksen, klikk på "M13mp18". Legg merke til at den valgte DNA sekvensen har blitt lagt til skafottet og stifting tråder i det nedre panelet.

9. Export Staple Sequence som et regneark

1. Klikk "Export" på den øverste verktøylinjen, og velg en destinasjon filnavn for stiften listen. Klikk på "Lagre".
2. Finne destinasjonen. Csv-fil og åpne den.
3. Regnearket viser stift liste, som kan sendes som er i DNA-syntese selskap. De to første kolonnene viser start-og slutt koordinater, med antall utenfor parentes betegner helix og nummeret inne parentes betegner grunnstilling.

10. Tildele Gate and Loading Sekvenser

1. I stiften listen, vil du legge merke til at noen sekvenser begynne eller slutte med en rekke spørsmålstegn "???". Disse spørsmålstegn betegne at siden ingen stillas strand hybridiserer med disse spesifikke stifte regioner, kan de ikke bli tildelt komplementære sekvenser. Dette er faktisk de utvidelser vi designet for gate tråder og lasting nettsteder, og derfor disse må tildeles manuelt nå. Gate:
   1. Portene bestemme innholdet i den biologiske innspill hvorpå roboten vil bytte fra inaktiv til aktiv tilstand og avsløre dens nyttelast. Hver enkelt dsDNA gate kan kode respons til en biologisk inngang (eller flere), slik at en profil av data som kreves for aktivering robot kan defineres.
      La oss anta for dette eksemplet at den biologiske cue utløsende robot aktivering er en begrensning enzym, noe som kan indikere tilstedeværelse av smittsomme bakterier.
   2. Først vurdere at porten ssDNA tråder ikke hybridize umiddelbart etter forgrening ut av sine helices. Designing porten ellers kan hindre hybridisering under folding. Derfor bør hver gren begynne med en spacer strengen. Vi bruker vanligvis poly-T som avstands-strenger, som denne sekvensen gir fleksibilitet.
   3. Vi antar også at lengden av porten hybridiserings-regionen er 20 baser, inneholde target begrensning site i midten.
   4. Derfor porten kan se slik ut:
      [Helix 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTxxxxxxGCTAGAG-3 '
      [Helix 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAxxxxxxCGATCTC-5 '
      Den "....." betegne stift region som hybridiserer med stillaset hårstreng derfor det har en sekvens som allerede, og bør ikke endres.
      Den tilfeldige duplex "GTGAGTT" og dens komplement sikrer begrensning området ikke er delvis åpen, og gir noen ekstra baser for å sikre effektiv fordøyelse av enzymet.
      "X" angir begrensning nettstedet.
      Den tilfeldige duplex "GCTAGAG" og dens komplement gi noen ekstra baser for enzymet til å arbeide effektivt, men også sørger for at porten tråd er tilstrekkelig lang for å sikre gode roboten nedleggelse.
      Før du velger en begrensning nettstedet som et mål, sikre at hele roboten struktur, blir fyllt opp nettsteder og andre deler av selve porten ikke fordøyd avenzym av valget. I denne undersøkelsen, NEBCutter 0-cutter listen (enzymer som ikke kutte hele sekvensen) uthevet EagI, isolert fra Enterobacter Pantoea agglomerans, som en potensiell enzym som kan indikere tilstedeværelse av en Enterobakteriell smittsomme.
   5. Porten ser nå slik ut (gul merkene EagI begrensning stedet):
      [Helix 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTCGGCCGGCTAGAG-3 '
      [Helix 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAGCCGGCCGATCTC-5 '
      Legg merke til at denne utforming går ut på at etter at fordøyelsen, sekvensen "GTGAGTTCGG" (T _m = 32 ° C) er ikke tilstrekkelig lange eller termodynamisk stabile til å holde den stengt roboten lenger. Denne forutsetningen vil mest sannsynlig trenger å bli bekreftet eksperimentelt.
   6. Den andre port kan være den samme i hvilket tilfelle roboten vil bare svare på ett enzym, eller kan være utformet med et annet område, og øker spesifisiteten av roboten. Flere restriksjonsseter kan legges inn på samme tråd, i krølling kompleksiteten og spesifisiteten av roboten.
2. Lasting steder:
   1. Lastingen nettstedet kan være en universell sekvens. Alternativt kan lasting områder være basert på unike sekvenser, noe som vil redusere modularitet, men bedre kontroll over lasten orientering og forholdstall (for ulike typer last).
   2. Endelig bør lasting stedet oligonukleotider omfatter en kjemisk funksjonell gruppe slik at de kan bøye med en hvilken som helst nyttelast: protein, nanopartikkel, etc. sørge for den kjemiske gruppe er montert på den riktige ende (5 'eller 3'), i henhold til den retning stiften .

11. Simulere Resultater i Cando

1. Etter at jobben er lagret som en. Json fil, kan den lastes opp til Cando for analyse. Cando er en endelig-element basert simulering av DNA-struktur som kan estimere sin stivhet og stabilitet i løsning ^21..
2. Gå tilami.org / "target =" _blank "> http://cando-dna-origami.org/
3. Klikk "Send en caDNAno fil til analyse" og fyll all nødvendig informasjon.
4. Analyse i Cando tar vanligvis opptil 15-20 min. På slutten, lar en e-postmelding oss beskjed analysen er ferdig, gi en link til å laste ned simulering resultater (Figur 26).

12. Bestill DNA og Brett Robot

Når design er fullført og Cando analyse viser tilfredsstillende prediksjon av produktet, stiften tråd liste generert på avsnittene 9-10 kan bestilles. Vanligvis gjør stiften strengene ikke krever spesiell rensing, men, er det anbefalt at spesielle formål tråder slik som porter eller lasting steder renses ved HPLC.

Den følgende fremgangsmåten DNA rekkefølge, nemlig folding, rensing og evaluering av produktet, også visualisering av det foldede struktur av enten atomic forcemikroskopi (AFM) eller transmisjonselektronmikroskopi (TEM) er utenfor omfanget av denne artikkelen, og kan finnes i tidligere rapporter ^17,18,20,21. En TEM-bilde av roboten utformet her er brakt som et eksempel (fig. 27). Prøveopparbeidelse og farging ble utført nøyaktig som beskrevet andre steder ^21.

Representative Results

Tallene 1-25 er skjermbilder av caDNAno 2.0-grensesnittet viser utformingen prosessen trinn for trinn. Tverrsnittet av formen ble først beskrevet (figur 3), fulgt av automatisk tilsetning av stillaset strengbrudd fragmenter og ferdigstillelse av hele stillaset banen (figur 7). Stifting tråder legges automatisk (Figur 12), brutt i henhold til bruker-definerte parametere (figur 14), og manuelt redigert for å tilpasse stifter til ønsket funksjon av enheten (figur 15-18). Tallene 23-24 beskrive hvordan lasting området og gate tilnærmingene er lagt til og redigert. Til slutt viser figur 27 en TEM-bilde av modellen utformet her.

"/>
Figur 1. En 3D-modell av det ferdige robot, designet av caDNAno 2.0 og generert av Autodesk Maya 2012.

Figur 2. En visning av caDNAno 2.0/Autodesk Maya 2012 grensesnitt. Øvre panel: gitter panel for skisserte den opprinnelige form. Bunnpanel: redigering panel. Høyre panel:. 3D-modell generator (se punkt 2.1) Klikk her for å se større figur .

Figur 3.. Tegning den delen av formen på toppen panel (se punkt 2.3).

Figur 4. Den nederste (redigering) panel av caDNAno 2.0. Den oransje vertikale linjen avgjør hvor langs rutenettet redigering handlinger vil skje. De grå pilene øverst i høyre hjørne brukes til å utvide rutenettet til hver side (se kapittel 2.4).

Figur 5. Et utkast av stillaset strand etter den første skisse i topplaten (se punkt 2.5). Klikk her for å se større figur .

ogether.within-page = "always">
Figur 6. Velger alle stillaset tråd banen kanter og utvide banen til ønsket lengde (se punkt 2.7).

Figur 7. Et generelt syn på de nederste og høyre paneler som viser hvordan 3D-modellen endringer i sanntid sammen med redigering handlinger. Klikk her for å se større figur .

8/50268fig8highres.jpg "/>
Figur 8. The Blue Bridge ikoner mellom helices betegne posisjoner hvor stillaset crossovers er tillatt (røde ikoner se stifte crossovers og ennå ikke er vist, se kapittel 2.9).

Figur 9. Opprette ny stillas crossovers ved å klikke på broen ikoner av valget (se avsnitt 2.10).

Figur 10. Opprette en akse (en crossover et nært som mulig til venstre side av rutenettet) mellom helices 29 og 30 (se punkt 3.2).

Figur 11. Legge helices som styrer forgrening av lasting nettsteder (se pkt. 4.1).

Figur 12. Den blåkopi etter "AutoStaple" handling. Stiften farger i bunnen, og til høyre panel er konsistent (se pkt. 5.1). Klikk her for å se større figur .

Figur 13. Den "autobreak" dialogboks der Brukeren kan definere autobreak parametere (se pkt. 5.2).

Figur 14. Den blåkopi etter "autobreak" handling (se pkt. 5.2). Klikk her for å se større figur .

Figur 15 Manuell redigering av stifter I:. Finne stifter som krysser over fra helix 29 og 30, og bør slettes.

5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50268/50268fig16highres.jpg "/>
Figur 16 Manuell redigering av stifter II:. Slette broer mellom de ligger stifter.

Figur 17 Manuell redigering av stifter III:. Sømming av nicks sammen fragmenterte stifter (se punkt 5.5).

Figur 18. Hele gap mellom helices 29-30 viser ingen crossovers knytte de to (se kapittel 5.5). Klikk her for å se større figur .

= "Jove_content" fo: keep-together.within-page = "always">
Figur 19. Manuell redigering av stifter trukket i tykk linje (betegner de enten er for kort, for lang eller rund, se kapittel 5.6).

Figur 20. Legge guide helices for lasting nettstedet forgrening (se pkt. 6.1). Klikk her for å se større figur .

1highres.jpg "/>
Figur 21. Manuell tillegg av stifting tråder til føringsaktuatorene helices, så forgrening poeng kan være plassert (se pkt. 6.2). Klikk her for å se større figur .

Figur 22. Presenterer en lasting nettstedet crossover til roboten chassis stillaset på et passende sted (en som krever minimalt med redigering av chassis stifter, se kapittel 6.5).

Figur 23. Sikt til nettstedet stifter sett i the nedre panelet etter fjerning guiden helices, som ikke lenger er nødvendig (se pkt. 6.9).

Figur 24. Anordne to stifter, som kommer til å bli brukt som gate-tråder, fra helikser 29 og 30. Merk at de to tilnærmingene står overfor motsatte retninger, som er obligatorisk for dannelsen av porten duplex (se punkt 7.4). Klikk her for å se større figur .

Figur 25. Stillaset sekvens tillegg ("Seq" verktøyet) dialogboksen, slik at å velge enten en av forhåndsdefinerte stillasene, eller å sette inn et egendefinert sekvens (se punkt 8.1).

Figur 26. Resultater av analyse av cando utformingen beskrevet her. Simuleringen genererer en. Zip-arkiv som inneholder de ulike filer som gir nødvendig informasjon. Her RMSF (root mean square svingninger) filer (. Png) er avbildet, viser en modell av design fra tre synsvinkler, farget i henhold til nøkkelen beskrevet i vedlagte fil som heter "HeatMap4RMSF.txt". I dette tilfellet er minimum RMSF (blåeste) 1.03 nm, og 95% RMSF (redest) er 3,19 nm. Stigningen av farger på tvers av modellen stammer fra polariteten av roboten (portene i "front", aksen i 'tilbake') og det faktum at det finnes ingen flyforbindelser med stifter langs helices 29-30 og 61-0, slik at "front 'side for å svinge mer enn' tilbake 'side.

Figur 27. TEM-bilde av den robot som er laget i denne artikkelen. Prøveopparbeidelse og farging ble utført nøyaktig som beskrevet andre steder ^21.

Discussion

DNA origami gjør oss i stand til å dikte nøyaktig definerte objekter med vilkårlige funksjoner på nanonivå. Et viktig neste trinn vil være å integrere funksjon i disse utførelser. Mens mange programmer og utfordringer kan løses med denne teknologien, er det en særlig interesse i å fabrikkere terapeutiske og vitenskapelig roboter fra DNA origami, da disse representerer en naturlig miljø av DNA. DNA grensesnitt allerede med molekylære maskiner i celler som en genetisk informasjon lagringsmedium. Interessant, kan det foldede DNA i en nanorobot eller en annen maskin fremdeles tjene som genetisk informasjon i tillegg til å være et konstruksjonsmateriale, som kan formidles til ekspresjon av et ønsket protein etter nanorobot sprengmidler, som deler av en sekvens av utganger.

I eksempelet omtalt i denne artikkelen, bruker vi en begrensning enzym for å betjene roboten. Imidlertid flere mekanismer som DNA-roboter kan ansvaretd til inngangene omfatter følgende.

Molekylær anerkjennelse: vi nylig demonstrert aptamer-baserte porter for DNA-roboter som gjenkjenner protein molekyler på overflaten på målceller ^20. Aptamers kan velges in vitro ved hjelp av metoder som SELEX ^23, outsourcet fra selskaper, eller brukt fra aptamer database ( http://aptamer.icmb.utexas.edu/ ). Når aptamers anvendes, er det viktig å vurdere at tråden komplementær til aptamer, som sammen danner den port, kan være konstruert for å inkludere uoverensstemmelser, som vil lette binding av aptamer sin ligand og forskyvning av den komplementære tråden. Mens den mekanisme som tillater dette er ukjent, kan sensitiviteten og spesifisiteten av en aptamer-basert port være innstilt ved å øke eller redusere% av mismatch mellom de to tråder, for å få enten en meget stringent men ineffektiv port, eller en raskmen lekk ett.

Enzymatisk spalting: for dette, bør portene være utformet slik at de inneholder substratet av det enzymet. For eksempel kan et lite peptid substrat av en protease være tjoret fra begge sider til den port, som vil holde roboten lukket i fravær av enzymet.

Fjernkontroll: en potensiell tilnærming som ikke har blitt brukt til DNA-maskiner bruker en gull nanocrystal antenne i et høyfrekvent elektromagnetisk felt å indusere dsDNA smelting ^24. Dette kan gi en bruker-operert bryter i tillegg til bio-responsive seg. Selv om DNA-origami roboter er relativt enkelt å designe og lage, utgjør de en rekke tekniske utfordringer som en terapeutisk plattform. DNA er ikke et ideelt materiale for levering av legemidler som det er svært sårbare for spalting av nukleaser. Videre kan det utfelle en immunrespons. En grundig studie av virkemåten til DNA-origami gjenstander i en organisme er needed å definere sin skjebne og sørge for at de ikke samlet i vev eller integrert i vertens genom.

I sammendraget, presenterte vi bruk av caDNAno, en grei, robust CAD verktøy for å designe DNA origami figurer. Vi håper å begynne å se programmet forskningen innen DNA origami, i områder som terapi, energi, metamaterials, og utdanning. I alle disse stedene, er caDNAno forventes å ha en betydelig innvirkning på å realisere løsninger. I fremtiden kan det bli en industriell og design standard, som kan byttes ut (eller deler som kan) av alle brukere fordi de er alle kompatible.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autodesk Maya 2012	Autodesk		A student/academic account needs to be created first (see platform-specific instructions in http://cadnano.org)
caDNAno 2.0 (software)	(Open source)		Software for the design of DNA origami structures http://cadnano.org
Cando (webpage)	(Open source)		Webpage running a simulator of DNA origami shapes http://cando-dna-origami.org