Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Hipokampal Dilim Kültürleri Synaptic Proteinler Post-gömme immunogold Etiketleme

doi: 10.3791/50273 Published: April 3, 2013

Summary

Proteinlerin lokalizasyonu ve dağıtım onların hücresel fonksiyonları anlamak için önemli bilgiler sağlar. Elektron mikroskobu üstün çözünürlük uzaysal (EM), belirli bir antijen aşağıdaki immünohistokimya hücre içi lokalizasyonu belirlemek için kullanılabilir. Sürdürmek antijenite EM araştırmalarda özellikle zor olmuştur süre yapısal bütünlüğünü koruyarak merkezi sinir sistemi (MSS), dokular için. Burada, çalışma MSS yapılar ve antijenleri korumak ve sıçan hipokampal CA1 piramidal nöronlarda sinaptik proteinleri karakterize etmek için kullanılan bir yöntemle kabul.

Abstract

Immunoelectron mikroskopi Subselüler düzeyde biyolojik moleküllerin okumak için güçlü bir araçtır. Gibi kolloidal altın gibi elektron-yoğun işaretleri birleştiğinde antikorlar çeşitli dokularda 1 spesifik antijenlerin lokalizasyonu ve dağılımı ortaya çıkarabilir. İki en yaygın olarak kullanılan teknikler öncesi ve sonrası gömme gömme teknikleri vardır. Ön gömme İmmünogold-elektron mikroskobu (EM) teknikleri, doku içine gömülü önce antikor penetrasyonu izin permeabilize gerekir. Bu teknikler yapılar fakat antikorun kötü penetrasyon (genellikle sadece ilk birkaç mikrometre) bir önemli dezavantajı, 2 'dir korumak için idealdir. Antijenleri daha kolay erişilebilir yerlerde etiketleme sabit dokuların bölümlerinde yer alır, çünkü post-gömme etiketleme yöntemleri bu sorunu önleyebilirsiniz. Yıllar boyunca, bir sayı değiştirme immunoreaktivitesi geliştirmek ve ultrastrüktürel korumak için post-gömme yöntemleri geliştirdik

Doku fiksasyonu EM çalışmalarının önemli bir parçasıdır. Fiksatifler kimyasal yerinde dokuları kilitlemek için makromoleküller çapraz bağlar. Sabitleştirici seçimi yapısal koruma, aynı zamanda antijenite ve kontrast sadece etkiler. Osmium tetroksit (Oso 4), formaldehid ve glutaraldehid merkezi sinir sistemi (MSS) fiziksel ve kimyasal işleme sırasında yapısal hasar özellikle yatkındır dokular dahil olmak üzere, yıllardır standart fiksatif olmuştur. Ne yazık ki, 4 Oso yüksek bir reaktiviteye sahip olduğu ve zayıf ve yetersiz etiketleme ile sonuçlanan, antijenler 6 maskelemek için gösterilmiştir. Kimyasal sabitleme önlemek için alternatif yaklaşımlar dokuların donma içerir. Ancak bu teknikleri pahalı enstrümantasyon gerçekleştirmek ve ihtiyaç zordur. Bu sorunların bazıları ele almak ve CNS doku etiketleme, Phend ark geliştirmek. uranil asetat (UA) ve tannik aci ile Oso 4 değiştirilird (TA) ve başarıyla antijen saptama ve beyin ve omurilik dokularının 7 yapısal koruma duyarlılığı artırmak için ek modifikasyon tanıttı. Biz sıçan beyin dokusu için bu osmiyum-ücretsiz post-gömme yöntemi benimsemiş ve sinaptik proteinleri tespit etmek ve incelemek için İmmünogold etiketleme tekniği optimize ettik.

Biz burada sıçan hipokampal CA1 piramidal nöronları sinaptik proteinlerin ultrastrüktürel lokalizasyonu belirlemek için bir yöntem mevcut. Biz organotipik hipokampal kültürlü dilim kullanabilirsiniz. Bu dilimler hipokampusun trisynaptic devresi korumak ve dolayısıyla sinaptik plastisite çalışmak için özellikle yararlıdır, bir çok mekanizma öğrenme ve hafıza rol oynadığı düşünülmektedir. Doğum sonrası 5 ve 6 fare / sıçan yavrular Organik tip hipokampal dilimleri 8 önceden tarif edildiği gibi hazırlanmış, ve akut devirme veya overexpress ekzojen proteinler için özellikle kullanışlı olduğu saptanmıştır. Biz daha önce ch için bu protokolü kullandıkneurogranin (Ng), sinaptik fonksiyon 8,9 düzenlenmesinde kritik bir role sahip bir nöron-spesifik protein aracterize. Biz de kalmodulin (CaM) ve Ca 2 + / CaM-bağımlı protein kinaz II (CaMKII) 10 ultrastrüktürel lokalizasyonu karakterize etmek için kullanmıştır. Sonuç olarak gösterildiği gibi, bu protokol dendritik omurga ve omurga 8 dağıtım karakterize yardımcı olmak için Ng etkili etiketleme iyi bir ince yapı koruma sağlar. Ayrıca, burada açıklanan işlemden nöronal fonksiyonları içinde yer alan birçok diğer proteinler okuyan geniş uygulanabilirliği olabilir.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Tespit

Fiksatifler kanserojen vardır; eldiven giyin ve bir davlumbaz fiksatif anlaştım. Aksi belirtilmediği sürece, bütün inkübasyonlar, buz üzerinde gerçekleştirilir ve bütün çözümler kullanımdan önce filtre edilmelidir. Elektron mikroskobu dereceli reaktifleri kullanın.

1. Gün

  1. Sonra deneysel koşullar (örneğin, viral enjeksiyon, ilaç tedavisi) içinde organotipik hippokampal dilimler ile zar yerleştirin, bir 60 x buz gibi soğuk 0.1 M fosfat tampon maddesi (Sorensen en fosfat tamponu), pH 7.3 içeren 15 mm polistiren Petri kabı. 1 Ekle - doğrudan dilimleri üstünde 0.1 M fosfat tampon 2 ml onları soğuk tutmak için.

KRİTİK ADIM: Her zaman taze hazırlanmış tamponlar ve fiksatif kullanın. Tampon pH istenilen aralıkta olduğundan emin olun. Bunu yapmak için bir başarısızlık hücresel yapılar zarar verebilir.

  1. Dilim CA1 disiplinidir yalıtmak için, kullanmakyavaşça CA1 hücre tabakası (Şekil 1) paralel DG yanında dilim boyunca kesmek için tek neşter. Sonra dikey CA3 disiplinidir ve subiculum kaldırmak için kalan dilim kesti. Doku üst yüzeyine tanımlamak için dilim bir köşe kesin.

NOT: ilgi protein hiçbir viral teslimat gerekli durumda ortam buz tampon durulayın hafif ile kaldırıldıktan sonra, tüm doku dilim sabit olabilir. Bu, daha sonra CA1 kesmek tarafından takip edilir.

KRİTİK ADIM: sonra ızgaralar düzgün kesit için sırayla doku topside takip edin.

  1. Dikkatle neşter arkasına kullanarak membrandan doku kaldırmak. Yavaşça 0.1 M fosfat tamponu ihtiva eden bir 12-kuyucuklu plakaya doku aktarmak için bir Pasteur pipeti kullanarak.
  2. Plaka kuyudaki tampon çıkarın ve ekleyin 500 & mu; l - 1 aşağıdaki gibidir buz fiksatif ml (pH 7.3):% 0.1 pikrik asit,% 1 paraformaldehid, 0.1 M fosfat tamponlu% 2.5 lik glutaraldehit. 4 de 2 saat inkübe ° C.

NOT: Pikrik asit Kuru iken patlayıcı olabilir. Ağzı kapalı bir kapta su ile ıslatılmış tutun. Kuru ve iyi havalandırılan bir yerde saklayın.

  1. Kuyudan fiksatif çıkarın ve 0,1 M fosfat tamponunda örnekleri 3 kez (20 dakika her) yıkayın.
  2. 0.1 M maleat tampon, pH 6.0 'de% 1 tannik asit (w / v)' de 40 dakika süreyle inkübe edin.
  3. Maleat tamponu (20 dk her) iki kez durulayın.
  4. Karanlıkta maleat tampon içinde% 1 uranil asetat (w / v) 'de 40 dakika süreyle inkübe edin. Uranil asetat ışığa duyarlıdır ve radyoaktif. Erime sırasında Parafilm ile beher kaplayın ve 4 ° C'de karanlıkta kullanılmamış tampon depolamak
  5. Maleat tamponu (20 dk her) iki kez durulayın.
  6. % 0.5 platin klor içinde 20 dakika inkübemaleat tampon içinde ide (w / v).
  7. Maleat tamponu (20 dk her) iki kez durulayın. 4'te örnekleri Mağaza ° C de daha fazla işlem için hazır olana kadar.

2. Dehidrasyon ve Katıştırma

Propilen oksit kanserojen. Bir davlumbaz içinde çalışarak solumaktan kaçınınız. Su hiçbir iz yoktur mutlak,% 100 saflıkta etanol kullanın. Dehidratasyon için farklı konsantrasyonlarda üretmek için bu mutlak etanol seyreltin.

2. Gün

  1. % 50 etanol içinde 5 dakika için inkübe edin ve daha sonra% 70 etanol içinde 5 dakika için.
  2. % 70 etanol içinde taze hazırlanmış% 1 p-fenilendiamin (PPD), oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
  3. % 70 etanol içinde üç kez yıkayın.
  4. % 80 etanol içinde 5 dakika için ve daha sonra% 95 etanol içinde 5 dakika için inkübe edin.
  5. % 100 etanol içinde iki kere 5 dakika her biri inkübe edin.
  6. Vidalı kapaklı cam şişelerde hazırlayın ve onlar temiz ve tamamen kuru olduğundan emin olun. Cam şişe için dilimler aktarın vebasit ve açık her flakon etiketleyin.
  7. Propilen oksit: 1:1 etanol içinde 5 dakika için inkübe edin.
  8. % 100 propilen oksit içinde iki kere 5 dakika her biri inkübe edin.
  9. Propilen oksit ile 1:1 'lik bir karışım yapmak için her bir şişeye reçine (EPON) ekleyin. Yavaşça 2 saat boyunca karıştırın. Gömme engelliyor olabilir kabarcıklarını engellemek için çok sıkı şişeleri sallamayın.
  10. Propilen oksit, ve 2 saat boyunca karıştırılır, 3:1 karışım yapmak için reçine ekleyin.
  11. 100% reçine aktarın ve inkübe O / N.

3. Gün

  1. 60 Aclar plastik ve 24 saat süre ile tedavi tabakaları arasında sandviç örnekleri ° C.

3. Kesit ve Izgaralar Bağlanış

4. Gün

  1. Yarı ince (0,5 mikron) bölümleri kesip 1% toluidin mavi + örneklerin doğru yönlendirmeyi belirlemek için% 1 boraks ile leke.
  2. Ince kesitler (60 nm) Kes ve nikel ızgaralar, ızgara başına bir bölümüne monte.

4. İmmünohistokimya

Tüm tamponları ve su kullanılmadan önce filtre edilmelidir.

5. Gün

  1. Düz bir yüzeye temiz Parafilm parçası üzerinde% 1 Tween-20/phosphate tampon (T / PB), pH 7.5, bir damla (~ 50 ul) yerleştirin. Yavaşça kenarından temiz forseps ile ızgara pick up ve tampon bölümünde aşağı ve RT 10 dakika inkübe üzerinde yüzer.
  2. Kağıt filtre bölümü tarafı yukarı koyarak ızgara fazla sıvıyı boşaltın ve ardından RT 15 dakika için T / PB 50 mM glisin üzerinde yüzer.

KRİTİK ADIM: kaçınmak için aşırı 'carry-over' bir çözüm damlacığından inkübasyonlar sırasında sonraki çözümleri, yavaşça her çözüm değişim arasında 1. filtre kağıdı üzerine ızgara kenarına dokunarak fazla sıvıyı boşaltın. Ayrıca EM kolları arasında sıkışıp herhangi bir çözüm nazikçe çıkarmaya forseps kolları arasında filtre kağıdı bir şerit ile ıslanma tarafından taşıyıcı tutarak forseps ise ensubölümleri tamamen kurumaya yok çalacak.

  1. Filtre kağıdı ile ızgara kurutun ve daha sonra oda sıcaklığında 30 dakika için T / PB ikincil antikor hayvan dan% 2.5 BSA ve% 2.5 serum ihtiva eden çözelti engelleme üzerinde yüzer.
  2. 4 ° C'de RT veya O / N birincil antikor (T / PB) ile inkübe En uygun süre, sıcaklık ve inkübasyon yanı sıra antikor konsantrasyonu, deneysel olarak tespit olması gerekir.
  3. Izgara T / PB ile üç kez (2 dakika her) yıkayın.
  4. Oda sıcaklığında 1 saat için ikincil antikor (10 nm altın ile birlikte 01:20 anti-tavşan veya anti-fare) ile inkübe edin.
  5. T / PB ile üç kez (2 dakika her) yıkayın.
  6. 5 dk için T / PB içinde% 2 glutaraldehid ile Postfix'i.
  7. Sonra T / PB ve üç kez (2 dk her) filtrelenmiş su ile üç defa (2 dk her) yıkayın.
  8. 10 dk için su içinde% 2 uranil asetat ile inkübe edin.

Izgara lekelenme iken, placin göre bir CO2 serbest boşluk hazırlamakBir cam Petri kabı merkezinde Parafilm ga parçası. Sonra havada CO2 absorbe Parafilm etrafında çanak NaOH 4-6 pelet yerleştirin. Birkaç dakika için üst kapalı tutun. Pasteur pipeti kullanın ve hızla cam Petri kabındaki Parafilm için Reynold kurşun sitrat çözeltisi küçük bir hacim aktarın. Odasına CO2 yeniden giriş aza indirmek için Pasteur pipeti eklemek için yeterli üst açın.

NOT: Reynold kurşun sitrat çözeltisi yapmak için, mikrodalga fırında deiyonize 100 ml su kaynatın ve hava geçirmez bir kapta soğumaya bırakın. Tıpa ile 50 ml hacminde bir şişede, 1.33 g kurşun karışımı nitrat, 1 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde sallama ile 1.76 gr sodyum sitrat ve kaynamış su, 30 ml. Daha sonra 30 dakika boyunca aralıklı olarak çalkalanır. Bu bulutlu çözelti için, 1 M sodyum hidroksit 8 ml eklemek ve yavaş yavaş şişeye bir kaç kez ters. Çözüm belli olacak. Haşlanmış wa 50 ml çözüm getirinter. Sızdırmayacak şekilde kapalı çözüm saklayın. Çökelti belirirse, atmak ve yeni bir olun.

  1. Üç küçük bardak sıcak, taze kaynamış deiyonize su hazırlayın. İlk behere ızgara daldırma ve 30 saniye süreyle etrafında yavaşça girdap tarafından uranil asetat yıkayın. Diğer iki bardak bu adımı yineleyin.
  2. Reynold kurşun sitrat çözeltisi damla ızgara yerleştirmek için yeterli Cam Petri kabı üst açın. Mümkünse kurşun sitrat üzerine nefes önlemek ve çökelti oluşumunu önlemek için bunu yaparken, bir maske. 10 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Izgara kaldırmak için yeterli üst açın. Kurşun sitrat üzerine solumaktan kaçının. Sıcak, taze kaynamış damıtılmış su ile üç bardak sırayla batırarak ızgara üç kez yıkayın. Filtre kağıdı, bölüm kadar bir parça ızgara kurumasını bekleyin. Örnek şimdi elektron mikroskobu için hazır hale gelir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Şekil 2B CA1 piramidal hipokampal nöronlar dendritik omurga endojen Ng moleküllerinin dağılım bir örneğini göstermektedir. Hipokampusun CA1 bölgesinde (Şekil 2A'da görüldüğü gibi) içeren ultra-ince (60 nm) dokuları ile Nikel ızgaraları% 1 içinde kapalı sonra anti ile inkübasyondan önce% 2.5 BSA ve% 2.5 serum ile bloke edilmiş T / PB, 50 mM glisin, -Ng antikor. T / PB ile yıkandıktan sonra, ızgaralar sonra 10 nm altın birleştiğinde anti-tavşan sekonder antikor kaplıydı. Son olarak, ızgara T / PB ile yıkandı ve% 2 uranil asetat ile kontrast artırmak için lekeleme Reynold kurşun sitrat, ardından% 2 glutaraldehid ile sonek edildi. Asimetrik sinaps arası, Left temsili elektron mikrografikleri. Postsinaptik bölmesi tanımlanması elektron-yoğun PSD (ok başı) ve iyi tanımlanmış bir plazma membranı tarafından kolaylaştırılır. Sağ, her Ng (oklar) ve plazma membranı arasındaki en kısa mesafe yok olduOmurganın yarıçapına rmalized. Omurganın içinde Ng moleküller (ancak PSD at) plazma membranı tercihli lokalizasyon gösterirler. Bu histogram başlangıçta EMBO Dergisi 8 yayınlandı.

Şekil 1
Şekil 1. Hipokampal kesit kültürlerinde CA1 alanı diseksiyon şematik. Dilim, örneğin ilaç tedavisi ya da viral enfeksiyon ile deneysel tedaviden sonra, dilim içeren zar buz gibi soğuk fosfat tamponu içinde yerleştirilmiştir. Dilim ilk CA1 hücre tabakası paralel dentat girus (DG), altında yatay kesildi. CA1 alt grubuna sonra CA3 alt alanı ve subiculum (alt) çıkarılması ile izole edildi. CA1 bölgesinin üst yüzeyinde tanımlanmasına yardımcı olmak için, bir köşe (yönlendirmek doku ile kesilmiş, bu durumda üstsağ köşesinde).

Şekil 1
Şekil 2. Organotipik hipokampal dilim kültürlerde CA1 sinapslarda neurogranin arasında immunogold etiketleme. (A) Transmisyon elektron mikroskop sıçan hipokampal CA1 alanı ve sinapsların gösteren. CA1 piramidal nöron Dendrit (d) kolayca ayırt edilebilir. Aksonal terminali 9t) ve dendritik diken (ler) arasındaki asimetrik sinapsların tanımlanması post-sinaptik yoğunluk varlığı (PSD, ok başı) ve iyi tanımlanmış bir plazma membranı tarafından kolaylaştırılır. Dendritik dikenler içinde neurogranin (Ng) (B) Dağıtım. Sol, İmmünogold-EM nG (oklar) etiketleme gösteren transmisyon elektron mikroskop. Miktar için, her altın parçacık mesafe (PSD, ok başında olanlar hariç) plazma membr gelenane omurganın yarıçapı (x ekseni) normalize olduğunu. Bu nedenle, 0 omurga merkezinde uzanan bir parçacık zar ve 1 uzanan bir parçacık karşılık gelir. Sağ, bir rasgele dağılım (pembe) bir omurga-şekilli bir rasgele sayı üreteci makro (Microsoft Excel) kullanılarak oluşturulan yüzey. Ng (mavi) yakın plazma membran yüksek tepe dağılımını göstermektedir. Ölçek çubuğu, 200 nm. Bu histogram başlangıçta EMBO Dergisi 8 yayınlandı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokol, biz sıçan hipokampal dilim kültürlerde dendritik dikenler okumak beyin ve omurilik dokularının için Phend ve Weinberg yöntemi benimsemiştir. Hipokampal CA3-CA1 bölgesinde dendritik dikenler nöronal fonksiyonları düzenleyen önemli roller oynamaktadır proteinlerin geniş bir çeşitlilik içeren hassas yapılarıdır. Sunulan yöntem makul etiketleme verimliliği ve omurga içindeki spesifik antijenlerin dağılımı karakterize için yararlıdır iyi tekrarlanabilirlik izin, iyi ultrastrüktürel korunması (Şekil 2A) korurken gelişmiş antijenite ulaşmak için dengeli bir yaklaşım sağlıyor. Burada, biz 10 nm koloidal altın Ng etiketli. Biz sonra sinaptik fonksiyon (Şekil 2B) 8 rolünü anlamak için yardımcı Ng etiketleme desen oluşturmak için altın sayılabilir.

İmmünogold nicel analizi yolu 11-13 çeşitli yapılabilir 14-17 bir dizi ele alınmıştır.

Bu yaklaşımda TA, UA tarafından osmiyum değiştirilmesi, ve p-fenilendiamin (PPD) büyük ölçüde önceki yöntemlerden 7 kıyasla nöronal dokularda antijen saptama duyarlılığını artırmıştır. Formaldehid ve glutaraldehid ile kullanılması, amino asitler gibi küçük çözünebilir antijenlere yapısal koruma ve koruma sağlar. Epoksi bazlı reçineler, yerine akrilik plastik reçineler, antijenite 7 ödün vermeden elektron ışını altında gömmek için iyi dengeyi sağlar. Standart osmiyum protokolü, Phend ark. </ Em> TA, UA ve PPD ayrıca yapısal korunması (orijinal Phend kağıt bkz. Şekil 1) 7 geliştirilmiş, ve bu etkili immun madde dahil olmak üzere birden proteinlerin bulunduğunu göstermişti P, kalsitonin gen-ilişkili peptid (CGRP), AMPA reseptör subunit 1 (GluA1) ve gama-amino butirik asit (GABA) 7. Bu bulgular nöronal dokularda farklı proteinler incelemek için bu prosedürün kabiliyeti göstermek. Bu yöntemin diğer bir avantajı TA, UA ve PPD hazırlamak ve işlemek için kolay ve solunması ve cilt ile temasında son derece uçucu ve çok zehirli olan osmiyum, çok daha küçük tehlikeli riskler olduğunu olduğunu.

Bu yöntemin bir sınırlama olarak koruyan ve amino asitler gibi küçük antijen korur rağmen, geleneksel osmiyum tedavi ile karşılaştırıldığında, bu moleküller için geliştirilmiş immün göstermemektedir olmasıdır. Ağır metal platin klorür avantaj stru korumak içincture ve immunoreaktivitesi geliştirmek için de tamamen 7 anlaşılmış değildir nedenlerden dolayı, omurilik ile sınırlı görünüyor. Osmiyum gerektirmeyen yöntem antijenite ve doku kontrastı geliştirir olmasına rağmen, bu presinaptik vezikül (bkz. Şekil 2) gibi diğer yapıların korunması için iyi çalışmak için görünmüyor. Buna ek olarak, Phend ve ark. TA membran 7 korumak için hücre içi bileşenleri içine sınırlı bir işlenebilirlik sahip olduğu osmiyum yokluğunda aynı zamanda, daha az miyelin koruma sağladığını gözlemlemiştir. Ultrastrüktürel korunması en önemli endişe ise bu nedenlerden dolayı, numune hazırlama için dondurma yöntemleri daha iyi alternatifler olabilir. Numunenin Ultrarapid dondurma kimyasal tespit kullanımı ile ortaya edilebilir potansiyel eşya olmadan, daha doğal bir şekilde 18 molekül koruma sağlar.

Önceki EM varlığında gerçekleştirmek içinörnek antijeni gibi Western blot analizi gibi yollarla teyit edilmelidir. Her immün çalışmaları gibi, veri doğru tercüme uygun, spesifik antikorların kullanımına dayanır. Yüksek derecede saflaştırılmış monoklonal antikorların her zaman kullanılması gerektiğini mevcut ise. Kontrol deneyleri, üretilen etiketleme kalıp birincil antikor ile antijen arasında spesifik etkileşimlere bağlı olmasını sağlamak için gereklidir. Etiketleme özgüllük, negatif ve pozitif kontroller yaparak test edilebilir. Örneğin, bir negatif kontrol olarak, birincil antikor boyama protokolü başka adımlar değiştirmeden, non-immün IgG ilgisiz bir kontrol serumu ile değiştirilebilir. İkinci olarak, bir hücre bölme içinde mevcut diğerlerinde bir protein, bir pozitif kontrol olarak da kullanılabilir. GAP-43 presinaptik terminali 19-22 öncelikle varken glutamaterjik sinaps Örneğin, PSD-95 postsinaptik belirteçtir.Primer antikor ihmal ya da protein mevcut olmamak bilinen bölümlerinde olduğunda etiketleme görülürse, o zaman etiketleme spesifik değildir.

Primer antikor özgüllü titizlikle test edildikten sonra, hiç kimse dokusu mevcut olduğu iyi etiketleme örnekleri arka planda aşırı altın parçacıkları birçok topaklanma sergilendiği veya olmamalıdır farkında olmalıdır. Altın miktarı çok yüksek ya da çok düşük olursa, buna göre bloke edici ve antikor konsantrasyonu seviyesini veya süresini ayarlamak. Maunsbach ve Afzelius bazı mükemmel örnekler ve 23 immün konusunda ipuçları sağlar.

Numunelerin İyi yapısal korunması morfolojisi ile müdahale ve verilerin yorumlanması yanıltabilecek eserler ortadan kaldırabilir. Bu nedenle, bu yöntem ile gösterilen yapının üst muhafaza hassas yapılar olabilir, özellikle biyolojik dokular arasında bir sayı için bu tekniği uygulanabilir hale getirirkolayca bozulabilir veya örnek işleme sırasında yıkıldı. Bu nedenle, organotipik hipokampal dilimler ek olarak, bu yöntem, aynı zamanda akut beyin kesitleri ve primer nöronal kültürler de dahil olmak üzere diğer nöronal preparatlar için son derece değerli olabilir. Organotipik hipokampal dilim hipokampal sinaptik plastisite eğitim için geçerli olabilir viral enfeksiyon yoluyla proteinlerin ilaç tedavisi ve ifade, kolayca düzeltilebilir vardır. Bu yöntem aynı zamanda hücre gövdesi, dendrit veya dendritik dikenler antijen dağıtım veya yerelleştirme farklı deneysel koşullar etkilerini incelemek yararlı olacaktır. Dahası, 6, 10, 15 ya da 25 nm arasında değişen toplam koloidal altın parçacıkları mümkün çakışma ile çoklu etiketleme gerçekleştirmek için yapım kullanılabilir. Biz gelişmiş antijenite, probların esneklik ve İmmünogold etiketleme tekrarlanabilirliği avantajı antijenler çeşitli incelemek için bu tekniğin gücünü göstermek inanıyoruz. Bu potansiyel FAYDALI olduğunukorteks, talamus, serebellum ve koku ampul dahil olmak üzere farklı beyin dokularında reseptörler, reseptör-etkileşen proteinlerinin, taşıyıcı, iyon kanalları ve diğerleri lokalizasyonu ve dağılımı nitelemek için l.

Özetle, sıçan hipokampal dilim kültürlerin bir osmiyum ücretsiz, sonrası gömme İmmünogold etiketleme bugünkü protokol dendritik dikenler içinde çeşitli antijenlere incelemek için değerli bir araçtır. Diğer hassas santral sinir dokularında bu yöntemin potansiyel uygulanabilirliği farklı anahtar moleküllerin ultrastrüktürel özelliklerini incelemek ve biyolojik fonksiyonları rollerini anlamalarına yardımcı olmak için çok yararlı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Acknowledgments

Yazarlar hipokampal dilim kültürlerin hazırlanması için Matthew Floransa teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, ABD Ulusal Yaşlanma Enstitüsü ve NZG Alzheimer Derneği bağışları ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 x 15 mm polystyrene Petri dish Falcon 351007
Disposable scalpel EXELINT 29552
Cell culture inserts Millipore PICM03050
10 nm Goat-anti-rabbit gold Electron Microscopy Sciences 25108
Anti-Neurogranin antibody Millipore AB5620
100% Picric acid Electron Microscopy Sciences 19550
96% Paraformaldehyde Acros Organics AC41678-0030
25% Glutaraldehyde (EM grade) Sigma G5882
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 22400
p-Phenylenediamine Sigma P6001
Platinum (IV) chloride Sigma 379840
Tannic acid Electron Microscopy Sciences 21710

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  2. Stirling, J. W. Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques. J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).
  3. Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).
  4. Berryman, M. A. Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).
  5. Akagi, T., et al. Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses. J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).
  6. Stirling, J. W. Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution. J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).
  7. Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).
  8. Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. Embo J. 28, 3027-3039 (2009).
  9. Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
  10. Zhong, L., Gerges, N. Z. Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation. PloS one. 7, e41275 (2012).
  11. Horisberger, M., Vauthey, M. Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin. Histochemistry. 80, 13-18 (1984).
  12. Bendayan, M. A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology. Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).
  13. Racz, B., Weinberg, R. J. Spatial organization of coflin in dendritic spines. J. Neuroscience. 138, (2), 447-456 (2006).
  14. Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections. J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).
  15. Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5'-nucleotidase in frozen thin sections. Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 Forthcoming.
  16. Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. [Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency]. Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).
  17. Kehle, T., Herzog, V. Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation. Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).
  18. Bozzola, J. R., Lonnie, Ch. 2. Electron Microscopy. 30, Second Edition, Jones and Bartlett Publishers. (1992).
  19. Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
  20. Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses. J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).
  21. Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism. Brain Research. 328, 381-385 (1985).
  22. Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity. Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).
  23. Maunsbach, A. A., Bjorn, Ch. 16. Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. Academic Press. 383-426 (1999).
Hipokampal Dilim Kültürleri Synaptic Proteinler Post-gömme immunogold Etiketleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhong, L., Brown, J. C., Wells, C., Gerges, N. Z. Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures. J. Vis. Exp. (74), e50273, doi:10.3791/50273 (2013).More

Zhong, L., Brown, J. C., Wells, C., Gerges, N. Z. Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures. J. Vis. Exp. (74), e50273, doi:10.3791/50273 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter