Summary
और प्रोटीन का स्थानीयकरण वितरण उनके सेलुलर कार्यों को समझने के लिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का बेहतर स्थानिक संकल्प (EM) एक दिया प्रतिजन के बाद immunohistochemistry के subcellular स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) प्रणाली, संरचनात्मक अखंडता बनाए रखने जबकि बनाए रखने प्रतिजनकता EM अध्ययन में किया गया है विशेष रूप से कठिन के ऊतकों के लिए. यहाँ, हम एक प्रक्रिया है कि CNS में अध्ययन करने के लिए संरचना और प्रतिजनों की रक्षा और चूहे hippocampal CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स में synaptic प्रोटीन विशेषताएँ इस्तेमाल किया गया है अपनाने.
Protocol
1. नियतन
Fixatives कासीनजन हैं, दस्ताने पहनते हैं और एक धूआं हुड में fixatives संभाल. जब तक अन्यथा नोट, सभी incubations बर्फ पर किया जाता है और सभी समाधान का उपयोग करने से पहले फ़िल्टर्ड किया जाना चाहिए. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रेड अभिकर्मकों का प्रयोग करें.
1 दिन
- प्रयोगात्मक शर्तों के बाद (जैसे वायरल इंजेक्शन, नशीली दवाओं के उपचार), organotypic hippocampal स्लाइस के साथ में झिल्ली जगह एक 60 x 15 मिमी polystyrene पेट्री पकवान ठंडा 0.1 एम फॉस्फेट (Sorensen फॉस्फेट बफर) बफर, पीएच 7.3 युक्त. 1 जोड़ें - स्लाइस के शीर्ष पर सीधे 0.1 एम फॉस्फेट बफर के 2 मिलीलीटर उन्हें ठंडा रखने के लिए.
महत्वपूर्ण कदम: हमेशा हौसले से तैयार buffers और fixatives का उपयोग करें. सुनिश्चित करें कि बफर के पीएच वांछित सीमा के भीतर है. एक ऐसा करने के लिए विफलता सेलुलर संरचनाओं को नुकसान पहुंचा सकता है.
- टुकड़ा की CA1 subfield को अलग करने के लिए, एक का उपयोग करेंप्रयोज्य धीरे महानिदेशक के लिए अगले टुकड़ा, CA1 सेल परत (1 चित्रा) समानांतर में कटौती स्केलपेल. तो फिर शेष टुकड़ा काट खड़ी CA3 subfield और subiculum को दूर करने के लिए. टुकड़ा ऊतक के ऊपर की सतह की पहचान में मदद करने के एक कोने में कटौती.
नोट: मामले में ब्याज की प्रोटीन का कोई वायरल वितरण की आवश्यकता है, पूरे ऊतक टुकड़ा के बाद मीडिया ठंडा बफर का एक कोमल कुल्ला के साथ हटा दिया जाता है तय किया जा सकता है. यह तो बाहर CA1 काटने के द्वारा पीछा किया जाता है.
महत्वपूर्ण कदम: क्रम में ग्रिड के उचित Sectioning लिए ऊतक के टोपसाइड का ट्रैक पर बाद में रखें.
- ध्यान से स्केलपेल की पीठ का उपयोग झिल्ली से ऊतक निकालने. एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग धीरे एक 12 अच्छी तरह से 0.1 एम फॉस्फेट बफर युक्त थाली ऊतक हस्तांतरण.
- थाली से अच्छी तरह से में बफर निकालें और 500 और मीटरयू, एल 1 ठंडा लगानेवाला मिलीलीटर (7.3 पीएच) निम्न में से शामिल: 0.1% रंगाई एसिड, 1% paraformaldehyde, और 0.1 एम फॉस्फेट बफर में 2.5% glutaraldehyde. 4 में 2 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
नोट: रंगाई एसिड विस्फोटक हो सकता है, जब सूखी हो सकता है. यह एक कसकर बंद कंटेनर में पानी के साथ गीला रखो. स्टोर एक सूखी और हवादार जगह में.
- अच्छी तरह से लगानेवाला निकालें और नमूने 0.1 एम फॉस्फेट बफर में 3 बार (20 मिनट प्रत्येक) धो लो.
- 1% 0.1 एम maleate बफर, पीएच 6.0 में tannic एसिड (w / v) में 40 मिनट के लिए सेते हैं.
- Maleate बफर में दो बार (20 मिनट प्रत्येक) कुल्ला.
- अंधेरे में maleate बफर में 1% uranyl एसीटेट (w / v) में 40 मिनट के लिए सेते हैं. Uranyl एसीटेट प्रकाश के प्रति संवेदनशील है और रेडियोधर्मी है. कवर Parafilm साथ बीकर जब भंग और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर किसी भी अप्रयुक्त बफर की दुकान
- Maleate बफर में दो बार (20 मिनट प्रत्येक) कुल्ला.
- 0.5% प्लैटिनम chlor में 20 मिनट के लिए सेतेmaleate बफर में IDE (w / v).
- Maleate बफर में दो बार (20 मिनट प्रत्येक) कुल्ला. 4 में नमूने की दुकान ° C जब तक वे आगे की प्रक्रिया के लिए तैयार कर रहे हैं.
2. निर्जलीकरण और एम्बेडिंग
Propylene ऑक्साइड कैंसर है. इसके साथ एक धूआं हुड में काम करके vapors से बचें. पूर्ण, 100% शुद्ध इथेनॉल है कि पानी का कोई निशान होता है. इस निरपेक्ष इथेनॉल पतला निर्जलीकरण के लिए अलग सांद्रता का उत्पादन.
2 दिन
- 50% इथेनॉल में 5 मिनट के लिए सेते और फिर 5 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में.
- हौसले से तैयार 1 पी - 70% इथेनॉल में PHENYLENEDIAMINE% (पीपीडी) में 15 मिनट के लिए सेते हैं.
- 70% इथेनॉल में तीन बार कुल्ला.
- 80% इथेनॉल में 5 मिनट के लिए और फिर 95% इथेनॉल में 5 मिनट के लिए सेते हैं.
- 100% इथेनॉल में दो बार 5 मिनट प्रत्येक सेते हैं.
- पेंच टोपी के साथ कांच की शीशियों को तैयार है और यकीन है कि वे स्वच्छ और पूरी तरह से सूखा कर रहे हैं. कांच की शीशियों स्लाइस स्थानांतरण औरशीशी में से प्रत्येक बस और स्पष्ट रूप से लेबल.
- Propylene ऑक्साइड: 1:1 इथेनॉल में 5 मिनट के लिए सेते हैं.
- 100% propylene ऑक्साइड में दो बार 5 मिनट प्रत्येक सेते हैं.
- शीशी में से प्रत्येक के लिए राल (EPON) जोड़ें propylene ऑक्साइड के साथ एक 1:1 मिश्रण बनाने के लिए. धीरे से 2 घंटे के लिए मिश्रण. भी कड़ाई से हिला नहीं शीशियों बुलबुले कि embedding के साथ हस्तक्षेप कर सकता को रोकने के.
- Propylene ऑक्साइड, और 2 घंटे के लिए मिश्रण के साथ एक 3:1 मिश्रण करने के लिए राल जोड़ें.
- 100% राल स्थानांतरण और सेते ओ / एन
3 दिन
- 60 ACLAR प्लास्टिक और 24 घंटे के लिए इलाज के स्ट्रिप्स के बीच में सैंडविच के नमूने डिग्री सेल्सियस
3. सेक्शनिंग और ग्रिड पर बढ़ते
4 दिन
- अर्द्ध पतली वर्गों (0.5 मीटर) काटें और 1% toluidine + 1% नमूनों की सही ओरिएंटेशन निर्धारित बोरेक्रस नीले रंग के साथ दाग.
- Ultrathin वर्गों (60 एनएम) काटें और निकल ग्रिड, ग्रिड प्रति एक खंड पर माउंट.
4. विशेष तकनीक द्वारा ऊतकों में विशिष्ट एन्टिजनों का प्रदर्शन
सभी buffers और पानी का उपयोग करने से पहले फ़िल्टर्ड किया जाना चाहिए.
5 दिन
- 1% Tween-20/phosphate (टी / पीबी) बफर, 7.5 पीएच, के (~ 50 μl) एक सपाट सतह पर साफ Parafilm के एक टुकड़े पर ड्रॉप रखें. धीरे किनारे द्वारा साफ संदंश के साथ ग्रिड और लेने के बफर, नीचे अनुभाग, और आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते पर नाव.
- ग्रिड से अनुभाग की ओर कागज फिल्टर पर रखने के द्वारा अतिरिक्त तरल और नाली तो आरटी पर 15 मिनट के लिए टी / पीबी में 50 मिमी ग्लाइसिन पर तैरने लगते हैं.
महत्वपूर्ण कदम: से बचने के लिए ले जाने पर 'एक समाधान छोटी बूंद से incubations के दौरान अगले समाधान के अत्यधिक धीरे # 1 प्रत्येक समाधान परिवर्तन के बीच फिल्टर पेपर पर ग्रिड के किनारे छू द्वारा अतिरिक्त तरल निकास. इसके अलावा किसी भी EM की बाहों के बीच फंस समाधान निकालने संदंश हथियार के बीच फिल्टर पेपर के एक मुट्ठी भर लोगों के साथ धीरे wicking द्वारा ग्रिड पकड़े संदंश जबकि ensuअंगूठी वर्गों बाहर पूरी तरह से सूखा नहीं है.
- फिल्टर पेपर के साथ ग्रिड सूखी और फिर आरटी पर 30 मिनट के लिए टी / पीबी में माध्यमिक एंटीबॉडी के पशु से 2.5% BSA और 2.5% सीरम युक्त समाधान रोकने पर तैरने लगते हैं.
- आरटी या / ओ एन में प्राथमिक एंटीबॉडी (टी / पीबी में) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते ऊष्मायन इष्टतम समय और तापमान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एंटीबॉडी एकाग्रता, प्रयोगात्मक निर्धारित करने की जरूरत है.
- ग्रिड टी / पंजाब के साथ तीन बार (2 मिनट प्रत्येक) धो लें.
- माध्यमिक एंटीबॉडी (1:20 विरोधी खरगोश या विरोधी माउस 10 एनएम सोने के लिए मिलकर) के साथ आर टी में 1 घंटे के लिए सेते हैं.
- टी / पंजाब के साथ तीन बार (2 मिनट प्रत्येक) धो लें.
- टी / पीबी में 5 मिनट के लिए 2% glutaraldehyde साथ पोस्टफिक्स.
- टी / पंजाब और फिर तीन बार (2 मिनट प्रत्येक) फ़िल्टर्ड पानी के साथ साथ तीन बार (2 मिनट प्रत्येक) धो लें.
- 2% पानी में 10 मिनट के लिए uranyl एसीटेट साथ सेते हैं.
जबकि ग्रिड धुंधला है, placin द्वारा एक सीओ 2 मुक्त कक्ष तैयारParafilm का एक गिलास पेट्री डिश के केंद्र में गा टुकड़ा. तो Parafilm चारों ओर पकवान में 4-6 NaOH के छर्रों हवा में सीओ 2 को अवशोषित करने के लिए जगह है. कुछ मिनट के लिए रखें ऊपर बंद कर दिया. एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग करें और जल्दी रेनोल्ड नेतृत्व साइट्रेट गिलास पेट्री डिश में Parafilm समाधान की एक छोटी मात्रा हस्तांतरण. सिर्फ पाश्चर विंदुक सम्मिलित करने के लिए कक्ष में सीओ 2 के फिर से परिचय कम से कम करने के लिए पर्याप्त ऊपर खुला.
नोट: रेनोल्ड नेतृत्व साइट्रेट समाधान करने के लिए, एक माइक्रोवेव ओवन में विआयनीकृत पानी की 100 मिलीलीटर फोड़ा और एक कंटेनर में शांत करते हैं. डाट के साथ एक 50 मिलीलीटर बड़ा फ्लास्क, मिश्रण 1.33 छ नेतृत्व नाइट्रेट, 1.76 ग्राम सोडियम साइट्रेट और 1 मिनट के लिए सख्ती झटकों से उबला हुआ पानी की 30 मिलीलीटर. फिर 30 मिनट के लिए रहकर हिला. इस बादल छाए रहेंगे समाधान के लिए, 1 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड के 8 मिलीलीटर जोड़ने और धीरे धीरे कुप्पी एक बार कुछ पलटना. समाधान स्पष्ट हो जाएगा. उबला हुआ पानी के साथ 50 मिलीलीटर के समाधान लाओआतंकवाद. कसकर सील समाधान स्टोर. यदि वेग दिखाई त्यागें, और एक नया बना.
- में तीन छोटे beakers गर्म, हौसले से उबला हुआ विआयनीकृत पानी तैयार करते हैं. 1 बीकर में ग्रिड की सूई और धीरे से 30 सेकंड के लिए चारों ओर ज़ुल्फ़ द्वारा uranyl एसीटेट धो लें. अन्य दो beakers में इस चरण को दोहराएँ.
- गिलास पेट्री डिश के ऊपर सिर्फ पर्याप्त ओपन ड्रॉप रेनोल्ड के नेतृत्व साइट्रेट समाधान के ग्रिड पर जगह. यदि संभव हो तो, एक मुखौटा पहनते हैं, जबकि ऐसा करने के लिए नेतृत्व साइट्रेट पर साँस लेने से बचने और तलछट के गठन को रोकने. 10 मिनट के लिए सेते हैं.
- बस के लिए ग्रिड को दूर करने के लिए पर्याप्त ऊपर खुला. नेतृत्व साइट्रेट पर सांस लेने से बचें. ग्रिड यह क्रमिक रूप से गर्म, हौसले से उबला हुआ आसुत जल के साथ तीन beakers में सूई के द्वारा तीन बार धोएं. शुष्क फिल्टर पेपर, खंड के एक टुकड़े पर ग्रिड चलो. नमूना अब इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के लिए तैयार है.
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Representative Results
चित्रा 2B CA1 hippocampal पिरामिड न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान spines में अंतर्जात एनजी अणुओं के वितरण का एक उदाहरण से पता चलता है. Ultrathin (60 एनएम) युक्त CA1 क्षेत्र (2A चित्र में देखा) हिप्पोकैम्पस के ऊतकों के साथ निकल ग्रिड 1% में शामिल किया गया टी / पंजाब, 50 मिमी ग्लाइसिन, तो विरोधी के साथ 2.5% BSA और 2.5 सीरम% के साथ पूर्व ऊष्मायन के अवरुद्ध प्रतिरक्षी - एनजी. टी / पंजाब के साथ धोने के बाद, ग्रिड तो विरोधी खरगोश माध्यमिक 10 एनएम सोने युग्मित एंटीबॉडी में कवर किया गया है. अंत में, ग्रिड टी / पंजाब के साथ धोया गया और 2% 2% uranyl एसीटेट और रेनोल्ड नेतृत्व के विपरीत बढ़ाने धुंधला साइट्रेट द्वारा पीछा glutaraldehyde साथ postfixed वाम, प्रतिनिधि इलेक्ट्रॉन विषम synapses दिखा micrographs. Postsynaptic डिब्बे की पहचान इलेक्ट्रॉन घने (तीर सिर) PSD और अच्छी तरह से परिभाषित प्लाज्मा झिल्ली द्वारा सुविधा है. ठीक है, प्रत्येक (तीर) एनजी और प्लाज्मा झिल्ली के बीच दूरी कम से कम नहीं थारीढ़ की त्रिज्या rmalized. रीढ़ के भीतर एनजी अणुओं (लेकिन नहीं PSD) प्लाज्मा झिल्ली तरजीही स्थानीयकरण दिखा रहे हैं. यह हिस्टोग्राम मूल EMBO 8 जर्नल में प्रकाशित किया गया था.
चित्रा 1. CA1 hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों से क्षेत्र विच्छेदन के योजनाबद्ध टुकड़ा, जैसे दवा उपचार या वायरल संक्रमण के लिए प्रयोगात्मक उपचार के बाद, टुकड़ा युक्त झिल्ली ठंडा फॉस्फेट बफर में रखा गया था. टुकड़ा 1 दांतेदार गाइरस (डीजी), CA1 सेल परत समानांतर नीचे क्षैतिज काट दिया. CA1 subfield तो CA3 subfield और subiculum (उप) को हटाने के द्वारा अलग किया गया था. CA1 के ऊपर सतह की पहचान में मदद करने के लिए, एक कोने में पूरबी ऊतक के लिए काट दिया गया (इस मामले में ऊपरीदाहिने हाथ कोने).
चित्रा 2. Organotypic hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों में CA1 synapses पर Immunogold neurogranin की लेबलिंग. (ए) ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन micrographs चूहे hippocampal CA1 क्षेत्र और synapses दिखा. CA1 पिरामिड न्यूरॉन्स की Dendrites (घ) आसानी से अलग पहचाना जा रहे हैं. Axonal 9T टर्मिनल) और वृक्ष के समान spines (एस) के बीच विषम synapses की पहचान बाद synaptic घनत्व की उपस्थिति (PSD, arrowhead) और अच्छी तरह से परिभाषित प्लाज्मा झिल्ली द्वारा सुविधा है. (बी) के वृक्ष के समान spines में neurogranin (एनजी) का वितरण. वाम, संचरण इलेक्ट्रॉन micrographs immunogold EM एनजी (तीर) की लेबलिंग दिखा. मात्रा का ठहराव के लिए, प्रत्येक सोना कण की दूरी (PSD, तीर सिर पर लोगों को छोड़कर) प्लाज्मा membr सेane रीढ़ की त्रिज्या (एक्स अक्ष) मानक के अनुसार है. इसलिए, 0 एक झिल्ली और रीढ़ की हड्डी के केंद्र में झूठ बोल रही है कण के लिए 1 पर झूठ बोल कण अधिकार मेल खाती है, एक यादृच्छिक वितरण (गुलाबी) एक रीढ़ की हड्डी के आकार में एक यादृच्छिक संख्या जनरेटर मैक्रो (माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल) का उपयोग करके उत्पन्न होता है सतह. एनजी (नीला) उच्चतम शिखर प्लाज्मा झिल्ली के पास वितरण से पता चलता है. स्केल बार, 200 एनएम. यह हिस्टोग्राम मूल EMBO 8 जर्नल में प्रकाशित किया गया था.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों चूहे hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों में वृक्ष के समान spines का अध्ययन के लिए Phend और Weinberg विधि को अपनाया है. Hippocampal CA3 - CA1 क्षेत्र में वृक्ष के समान spines नाजुक प्रोटीन कि neuronal कार्यों को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने की एक विशाल विविधता युक्त संरचनाओं हैं. प्रस्तुत विधि बढ़ाया प्रतिजनकता जबकि अच्छा ultrastructural संरक्षण (2 चित्रा) को बनाए रखने, उचित लेबलिंग दक्षता और अच्छा रीढ़ के भीतर विशिष्ट प्रतिजनों के वितरण के लिए निस्र्पक उपयोगी reproducibility की अनुमति प्राप्त करने के लिए एक संतुलित दृष्टिकोण प्रदान करता है. यहाँ, हम 10 एनएम कोलाइडयन सोने के साथ एनजी लेबल. हम तो सोने की मात्रा निर्धारित करने के लिए एनजी की लेबलिंग पैटर्न है कि synaptic समारोह (चित्रा 2B) 8 में अपनी भूमिका को समझने में मदद उत्पन्न.
Immunogold के मात्रात्मक विश्लेषण 11-13 तरीके की एक किस्म में किया जा सकता है 14-17 समीक्षा की संख्या में संबोधित किया गया है.
टीए, UA आज़मियम के प्रतिस्थापन, और इस दृष्टिकोण में पी PHENYLENEDIAMINE (पीपीडी) बहुत neuronal ऊतकों में प्रतिजन का पता लगाने के पिछले 7 तरीकों की तुलना में संवेदनशीलता बढ़ाया. formaldehyde और glutaraldehyde का उपयोग संरचनात्मक और अमीनो एसिड के रूप में इस तरह के छोटे घुलनशील प्रतिजनों के संरक्षण प्रतिधारण सुनिश्चित करता है. Epoxy रेजिन आधारित, बजाय ऐक्रेलिक प्लास्टिक रेजिन, 7 प्रतिजनकता समझौता किए बिना इलेक्ट्रॉन बीम के तहत embedding के लिए बेहतर स्थिरता प्रदान करते हैं. मानक आज़मियम प्रोटोकॉल, Phend एट अल की तुलना में./ Em> दिखाया था कि टीए, UA, और पीपीडी भी संरचनात्मक संरक्षण (मूल Phend कागज के चित्रा 1 देखें) 7 में सुधार, और है कि कुशल immunostaining पदार्थ सहित कई प्रोटीन के लिए पाया गया पी, कैल्सीटोनिन जीन संबंधी पेप्टाइड (CGRP), AMPA रिसेप्टर सबयूनिट 1 (GluA1), और गामा aminobutyric एसिड (GABA) 7. इन निष्कर्षों को इस प्रक्रिया के neuronal ऊतकों में अलग प्रोटीन का अध्ययन क्षमता प्रदर्शित करता है. इस विधि का एक और लाभ यह है कि प्रादेशिक सेना, UA, और पीपीडी के लिए तैयार है और संभाल के लिए आसान कर रहे हैं, और आज़मियम, जो बहुत अस्थिर है और साँस लेना और त्वचा के संपर्क द्वारा बहुत विषैला होता है की तुलना में बहुत छोटे खतरनाक जोखिम मुद्रा.
इस पद्धति का एक सीमा यह है कि हालांकि यह बरकरार रखता है और अमीनो एसिड के रूप में इस तरह के छोटे प्रतिजनों को बरकरार रखे हुए है, यह पारंपरिक आज़मियम उपचार की तुलना में इन अणुओं के लिए सुधार immunolabeling नहीं प्रदर्शित नहीं करता है. stru की रक्षा करने के लिए भारी धातु प्लैटिनम क्लोराइड का लाभcture और immunoreactivity बढ़ाने के भी कारण है कि पूरी तरह से 7 समझ नहीं रहे हैं के लिए रीढ़ की हड्डी को सीमित किया जा लगता है. हालांकि आज़मियम मुक्त विधि प्रतिजनकता और ऊतक विपरीत में सुधार है, यह अच्छी तरह से presynaptic vesicles (चित्रा 2) के रूप में अन्य संरचनाओं के संरक्षण के लिए काम नहीं लगता. इसके अलावा, Phend एट अल. देखा था कि आज़मियम के अभाव भी कम myelin संरक्षण में हुई है, के रूप में प्रादेशिक सेना intracellular घटकों में सीमित प्रवेशनीयता झिल्ली 7 बनाए रखने के है. इन कारणों के लिए, नमूना तैयार करने के लिए ठंड तरीकों बेहतर विकल्प हो सकता है अगर ultrastructural संरक्षण सबसे महत्वपूर्ण चिंता का विषय हो सकता है. एक अधिक प्राकृतिक 18 रास्ते में नमूना के Ultrarapid ठंड संभावित कलाकृतियों कि रासायनिक fixatives के उपयोग के द्वारा पेश किया जा सकता है बिना अणुओं के संरक्षण की अनुमति देता है.
पूर्व EM, की उपस्थिति में प्रदर्शन करने के लिएनमूने में प्रतिजन पश्चिमी धब्बा विश्लेषण जैसे तरीकों के माध्यम से पुष्टि की जानी चाहिए. सभी immunolabeling अध्ययन के साथ के रूप में, डेटा की सही व्याख्या उचित, विशिष्ट एंटीबॉडी के उपयोग पर निर्भर करता है. उच्च शुद्ध मोनोक्लोनल एंटीबॉडी हमेशा उपलब्ध अगर किया जाना चाहिए. नियंत्रण प्रयोगों के लिए यह सुनिश्चित करें कि लेबलिंग उत्पन्न पैटर्न प्राथमिक एंटीबॉडी और रोगक्षमजनररोरारतत के बीच विशिष्ट बातचीत करने के लिए कारण है के लिए आवश्यक हैं. लेबलिंग की विशिष्टता नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण से बाहर ले जाने के द्वारा परीक्षण किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, एक नकारात्मक नियंत्रण में, प्राथमिक एंटीबॉडी गैर प्रतिरक्षा आईजीजी के एक असंबंधित नियंत्रण सीरम द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है धुंधला प्रोटोकॉल में किसी भी अन्य कदम को बदलने के बिना. दूसरा, एक प्रोटीन है कि एक सेल डिब्बे में मौजूद है, लेकिन दूसरों में नहीं है एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. Glutamatergic synapses में उदाहरण के लिए, PSD-95 postsynaptic मार्कर है जबकि गैप-43 presynaptic 19-22 टर्मिनल में मुख्य रूप से मौजूद है.यदि लेबलिंग जब प्राथमिक एंटीबॉडी लोप या डिब्बों जहां प्रोटीन के लिए उपस्थित नहीं हो जाना जाता है में देखा जाता है, तो लेबलिंग विशिष्ट नहीं है.
एक बार प्राथमिक एंटीबॉडी की विशिष्टता को कड़ाई से परीक्षण किया जाता है, एक पता है कि कई clumping अच्छी लेबलिंग के साथ नमूने प्रदर्शन नहीं या अत्यधिक सोने के कणों होना चाहिए पृष्ठभूमि में जहां कोई ऊतक मौजूद होना चाहिए. अगर सोने की मात्रा बहुत अधिक या बहुत कम है, या अवरुद्ध और तदनुसार एंटीबॉडी की एकाग्रता के स्तर की अवधि को समायोजित करें. कुछ उत्कृष्ट Maunsbach और Afzelius उदाहरण और 23 immunolabeling के लिए सुझाव प्रदान करते हैं.
नमूनों का अच्छा संरचनात्मक संरक्षण कलाकृतियों कि आकारिकी साथ हस्तक्षेप और डेटा की व्याख्या उलझाना को समाप्त कर सकते हैं. इसलिए, इस विधि द्वारा सचित्र संरचनाओं के बेहतर संरक्षण जैविक ऊतकों खासकर जहां नाजुक संरचनाओं हो सकता है की एक संख्या के लिए लागू इस तकनीक बनाता हैआसानी से विकृत या नमूना प्रसंस्करण के दौरान नष्ट कर दिया. इसलिए, organotypic hippocampal स्लाइस के अलावा, इस पद्धति का भी तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें और प्राथमिक neuronal संस्कृतियों सहित अन्य neuronal तैयारी के लिए काफी कीमती हो सकता है. Organotypic hippocampal स्लाइस आसानी से दवा उपचार और प्रोटीन की अभिव्यक्ति के वायरल संक्रमण के माध्यम से, जो hippocampal synaptic plasticity का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है संशोधनीय हैं. इस पद्धति का भी प्रतिजन या सेल शरीर, dendrites, या वृक्ष के समान spines में वितरण स्थानीयकरण पर विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के प्रभाव की जांच करने के लिए उपयोगी है. इसके अलावा, 6, 10, 15, या 25 एनएम के आकार के साथ कोलाइडयन सोने के कणों उपलब्ध हैं, यह संभव बाहर ले जाने के लिए कोई ओवरलैप के साथ कई लेबलिंग बना. हम मानते हैं कि बढ़ाया प्रतिजनकता, जांच के लचीलेपन और immunogold लेबलिंग के reproducibility का लाभ प्रतिजनों की एक किस्म का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक की शक्ति का प्रदर्शन. यह संभावित है usefuस्थानीयकरण और रिसेप्टर्स, रिसेप्टर बातचीत प्रोटीन, ट्रांसपोर्टर, आयन चैनल प्रांतस्था, thalamus, सेरिबैलम और घ्राण बल्ब सहित विभिन्न मस्तिष्क के ऊतकों में और कई दूसरों के वितरण को चिह्नित करने के लिए एल.
सारांश में, एक आज़मियम मुक्त, के बाद embedding चूहे hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों के immunogold लेबलिंग के वर्तमान प्रोटोकॉल एक मूल्यवान वृक्ष के समान spines के भीतर विभिन्न प्रतिजनों के अध्ययन के लिए एक उपकरण है. अन्य नाजुक केंद्रीय तंत्रिका ऊतकों में इस विधि के संभावित प्रयोज्यता बहुत उपयोगी हो सकता है अलग कुंजी अणुओं के ultrastructural विशेषताओं की जांच करने के लिए और मदद के लिए जैविक कार्यों में अपनी भूमिका को समझना होगा.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों के लिए मैथ्यू फ्लोरेंस hippocampal टुकड़ा संस्कृतियों की तैयारी के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम अमेरिका के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एजिंग पर और अल्जाइमर NZG एसोसिएशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 x 15 mm polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Disposable scalpel | EXELINT | 29552 | |
| Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| 10 nm Goat-anti-rabbit gold | Electron Microscopy Sciences | 25108 | |
| Anti-Neurogranin antibody | Millipore | AB5620 | |
| 100% Picric acid | Electron Microscopy Sciences | 19550 | |
| 96% Paraformaldehyde | Acros Organics | AC41678-0030 | |
| 25% Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma | G5882 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
| p-Phenylenediamine | Sigma | P6001 | |
| Platinum (IV) chloride | Sigma | 379840 | |
| Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 |
References
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