Summary
A localização e distribuição das proteínas fornecem informações importantes para a compreensão de suas funções celulares. A resolução espacial superior, de microscopia electrónica (ME) pode ser usado para determinar a localização subcelular de um dado antigénio imuno sequência. Para tecidos do sistema nervoso central (SNC), preservando a integridade estrutural durante a antigenicidade manutenção tem sido particularmente difícil em estudos de EM. Aqui, adoptar um procedimento que tem sido utilizada para preservar as estruturas e os antigénios do SNC para estudar e caracterizar proteínas sinápticas no hipocampo de ratos neurónios CA1 piramidais.
Abstract
Imunomicroscopia é uma ferramenta poderosa para estudar moléculas biológicas em nível subcelular. Anticorpos acoplados a marcadores densos em electrões, tais como ouro coloidal podem revelar a localização e distribuição de antigénios específicos em diversos tecidos 1. As duas técnicas mais utilizadas são as técnicas de incorporação de pré-e pós-incorporação. Na incorporação de pré-imuno-microscopia eletrônica (ME) técnicas, o tecido deve ser permeabilizadas para permitir a penetração de anticorpos antes de ser incorporado. Estas técnicas são ideais para a preservação de estruturas, mas uma fraca penetração do anticorpo (geralmente apenas os primeiros poucos micrómetros) é um inconveniente considerável 2. Os métodos de pós-incorporação de rotulagem pode evitar este problema, porque rotulagem ocorre em seções de tecidos fixos onde os antígenos são mais facilmente acessíveis. Ao longo dos anos, um número de modificações têm melhorado os métodos de incorporação pós-para aumentar a imunorreactividade e para preservar a ultraestrutura Fixação do tecido é uma parte crucial de estudos EM. Fixadores quimicamente ligações cruzadas das macromoléculas para bloquear as estruturas de tecidos no seu lugar. A escolha de fixador afeta não só a preservação, mas também estrutural antigenicidade e contraste. Tetróxido de ósmio (OsO4), formaldeído, glutaraldeído e têm sido os fixadores padrão ao longo de décadas, incluindo para o sistema nervoso central (SNC), os tecidos que são especialmente propensas a danos estruturais durante processamento químico e físico. Infelizmente, OsO 4 é altamente reactivo e tem sido demonstrado que mascaram os antigénios 6, resultando na rotulagem pobre e insuficiente. Abordagens alternativas para evitar a fixação química incluem o congelamento dos tecidos. Mas estas técnicas são de difícil execução e exigem instrumentação dispendiosa. Para resolver alguns desses problemas e para melhorar a rotulagem SNC tecido, Phend et al. substituído OsO 4 com acetato de uranila (UA) e ACI tânicod (TA), e introduzidos com sucesso modificações adicionais para melhorar a sensibilidade da detecção de antigénio e preservação estrutural em tecidos cerebrais e da medula espinal 7. Adotamos este método ósmio livre de pós-incorporação ao tecido cerebral de ratos e otimizou a técnica de rotulagem immunogold para detectar e estudar proteínas sinápticas. Apresentamos aqui um método para determinar a localização ultra-estrutural de proteínas sinápticas em ratos hipocampais CA1 neurônios piramidais. Utilizamos fatias organotípicas de hipocampo cultivadas. Estas fatias de manter o circuito trisynaptic do hipocampo, e, portanto, são especialmente úteis para o estudo da plasticidade sináptica, um mecanismo muito pensou ser a base de aprendizagem e memória. Organotípicas de fatias de hipocampo pós-natais dias 5 e 6 de ratinho / rato pups pode ser preparado como descrito anteriormente 8, e são especialmente úteis para agudamente knockdown ou superexpressam proteínas exógenas. Nós já usou este protocolo para characterize neurogranin (Ng), uma proteína específica para neurónios, com um papel crítico na regulação da função sináptica 8,9. Temos também utilizado para caracterizar a localização ultraestrutural da calmodulina (CaM), e Ca2 + / CaM proteína-quinase dependente de II (CaMKII) 10. Como ilustrado nos resultados, este protocolo permite a preservação ultraestrutural bom das espinhas dendríticas e rotulagem eficiente de Ng para ajudar a caracterizar a sua distribuição na coluna 8. Além disso, o procedimento aqui descrito pode ter uma ampla aplicabilidade no estudo de muitas outras proteínas envolvidas em funções neuronais.
Protocol
1. Fixação
Fixadores são cancerígenas; usar luvas e lidar com os fixadores em uma coifa. Salvo indicação em contrário, todas as incubações são realizadas em gelo e todas as soluções devem ser filtrados antes da utilização. Use microscopia eletrônica de grau de reagentes.
Dia 1
- Após condições experimentais (por exemplo, injecção viral, o tratamento medicamentoso), colocar a membrana com organotípicas de fatias do hipocampo de 60 x 15 mm de poliestireno placa de Petri contendo gelada de tampão fosfato 0,1 M (tampão de Sorensen fosfato), pH 7,3. Adicionar 1 - 2 ml de tampão fosfato 0,1 M directamente em cima das fatias para mantê-las frias.
Passo crítico: Sempre utilize buffers recém preparados e fixadores. Certifique-se de que o pH do tampão está dentro do intervalo desejado. A incapacidade de fazê-lo pode danificar estruturas celulares.
- Para isolar o subcampo CA1 do corte, usar umdescartável bisturi para cortar suavemente através da próxima fatia a DG, em paralelo com a camada de células CA1 (Figura 1). Em seguida, corte a fatia restante verticalmente para remover o subcampo CA3 eo subículo. Cortado um canto da fatia para ajudar a identificar a superfície superior do tecido.
NOTA: No caso de nenhum de entrega viral de proteína de interesse é necessária, a fatia de tecido inteiro pode ser fixada após o meio é removido com uma suave lavagem de tampão arrefecido com gelo. Isto é então seguido por corte para fora do CA1.
Passo crítico: Acompanhe a parte de cima do tecido para que corte apropriado das grades mais tarde.
- Cuidadosamente remover o tecido a partir da membrana usando a parte traseira do bisturi. Usar uma pipeta de Pasteur para transferir cuidadosamente o tecido a uma placa de 12 poços contendo 0,1 M de tampão fosfato.
- Remover o tampão no poço da placa e adicionar 500 & mu, l - 1 ml de fixador gelada (pH 7,3) composta do seguinte: 0,1% de ácido pícrico, paraformaldeído a 1%, e 2,5% de glutaraldeído em tampão de fosfato 0,1 M. Incubar durante 2 horas a 4 ° C.
NOTA: ácido pícrico pode ser explosivo quando seco. Mantenha-o molhado com água em um recipiente bem fechado. Armazenar em local seco e bem ventilado.
- Remova o fixador do poço e lavar as amostras 3 vezes (20 minutos cada) em tampão de fosfato 0,1 M.
- Incubar durante 40 min em 1% de ácido tânico (w / v) em 0,1 M de tampão de maleato, pH 6,0.
- Lavar duas vezes (20 minutos cada) em tampão de maleato.
- Incubar durante 40 min, em acetato de uranilo a 1% (w / v) em tampão de maleato no escuro. Acetato de uranilo é sensível à luz e é radioactivo. Cobrir a proveta com Parafilm ao dissolver-se e armazenar qualquer tampão não utilizado no escuro a 4 ° C.
- Lavar duas vezes (20 minutos cada) em tampão de maleato.
- Incubar durante 20 min em 0,5% de cloro platinaide (w / v) em tampão de maleato.
- Lavar duas vezes (20 minutos cada) em tampão de maleato. Armazenar as amostras a 4 ° C até estarem prontos para processamento adicional.
2. Desidratação e incorporação
Óxido de propileno é cancerígeno. Evite vapores por trabalhar com ele em uma coifa. Use absoluto, etanol puro a 100%, que não contém qualquer traço de água. Diluir esta etanol absoluto para produzir diferentes concentrações de desidratação.
Dia 2
- Incubar durante 5 min em etanol a 50% e, em seguida, durante 5 min em etanol a 70%.
- Incubar durante 15 min, em recém-preparados a 1% de p-fenilenodiamina (PPD) em etanol a 70%.
- Enxaguar três vezes em etanol a 70%.
- Incubar durante 5 min em etanol a 80% e, em seguida, durante 5 min em etanol a 95%.
- Incubar em etanol 100% duas vezes por 5 minutos de cada.
- Prepare frascos de vidro com tampas de rosca e verifique se eles são limpos e completamente secos. Transferir as fatias de frascos de vidro erotular cada frasco simples e clara.
- Incubar durante 5 min em 1:1 etanol: óxido de propileno.
- Incubar em óxido de propileno a 100% duas vezes por 5 minutos de cada.
- Adicionar resina (Epon) a cada frasco para dar uma mistura 1:1 com o óxido de propileno. Misture delicadamente para 2 horas. Não agite os frascos muito rigor para evitar bolhas que possam interferir com a incorporação.
- Adicionar resina para fazer uma mistura 3:1 de óxido de propileno, e mistura-se durante 2 h.
- Transferir a resina 100% e incubar O / N.
Dia 3
- Amostras sanduíche entre as tiras de plástico ACLAR e cura durante 24 horas a 60 ° C.
3. Corte e montagem em Grids
Dia 4
- Cortar semi-finas (0,5 mm) e as secções coradas com azul de toluidina a 1% + 1% de bórax para determinar a orientação correcta de amostras.
- Corte cortes ultrafinos (60 nm) e montar em grades de níquel, uma seção por grade.
4. Imunohistoquímica
Todos os amortecedores e água deve ser filtrada antes de usar.
Dia 5
- Colocar uma gota (~ 50 ul) de tampão de Tween-20/phosphate 1% (T / PB), pH 7,5, em um pedaço de Parafilm limpo sobre uma superfície plana. Gentilmente pegar a grade com fórceps limpas pela extremidade e flutuar sobre o tampão, a secção abaixo, e incubar durante 10 min à TA.
- Drenar o excesso de líquido a partir da rede, colocando-se na secção do lado de papel de filtro e, em seguida, flutuar na glicina 50 mM em T / PB, durante 15 minutos à temperatura ambiente.
Passo crítico: Para evitar o excesso de "carry-over" de soluções a partir de uma gota de solução para o próximo durante as incubações, drenar o excesso de líquido por tocar suavemente a borda da grade em # 1 filtro de papel entre cada mudança de solução. Também remover qualquer solução de presa entre os braços da pinça EM prende a grade por wicking suavemente com um pedaço de papel de filtro entre os braços de pinça enquanto ensutocar os seções não seque completamente.
- Seca-se a grelha com papel de filtro e, em seguida, flutuar na solução de bloqueio contendo BSA a 2,5% e 2,5% de soro a partir do animal de que o anticorpo secundário em T / PB, durante 30 min à TA.
- Incubar com o anticorpo primário (em T / PB), à TA ou O / N a 4 ° C. O tempo óptimo e a temperatura de incubação, assim como a concentração do anticorpo, devem ser determinadas experimentalmente.
- Lava-se a grelha de três vezes (2 minutos cada) com T / PB.
- Incubar com o anticorpo secundário (anti-coelho de 01:20 ou anti-rato acoplado a ouro de 10 nm), durante 1 h à TA.
- Lavar três vezes (2 minutos cada) com T / PB.
- Postfix com glutaraldeído a 2% em T / PB, durante 5 min.
- Lavar três vezes (2 minutos cada) com T / PB e, em seguida, três vezes (2 minutos cada) com água filtrada.
- Incubar com acetato de uranilo a 2% em água durante 10 min.
Enquanto a grade é a coloração, a preparar uma câmara de CO 2-livre por placinga pedaço de Parafilm no centro de uma placa de Petri de vidro. Em seguida, coloca 4-6 pellets de NaOH no prato em torno do Parafilm para absorver CO 2 no ar. Manter a parte superior fechada por alguns minutos. Usar uma pipeta de Pasteur e rápida transferência de um pequeno volume de solução de citrato de chumbo de Reynold para o Parafilm no prato de Petri de vidro. Abrir a parte superior apenas o suficiente para inserir a pipeta de Pasteur para minimizar a re-introdução de CO 2 para a câmara.
NOTA: Para fazer a solução de Reynold citrato de chumbo, ferver 100 ml de água deionizada em um forno de microondas e deixe esfriar em um recipiente hermético. Num balão volumétrico de 50 ml com rolha, misturar 1,33 g de nitrato de chumbo, 1,76 g de citrato de sódio e 30 ml de água fervida, mediante agitação vigorosa durante 1 min. Em seguida, agitar intermitentemente por 30 min. A esta solução turva, adicionar 8 ml de hidróxido de sódio 1 M e, lentamente, inverter o frasco algumas vezes. Solução se tornará claro. Levar a solução para 50 ml com o wa fervidater. Guardar a solução hermeticamente fechado. Se parece precipitado, descartar e fazer um novo.
- Em três copos menores preparar quente, água recém-fervida deionizada. Lavar o acetato de uranilo, por imersão a grade no primeiro béquer e agitar suavemente-la em torno de 30 seg. Repita este passo nos outros dois copos.
- Abrir a parte superior da placa de Petri de vidro apenas o suficiente para colocar a grelha sobre a gota de solução de citrato de chumbo de Reynold. Se possível, use uma máscara ao fazer isto para evitar respirar em citrato de chumbo e para evitar a formação de precipitado. Incubar durante 10 min.
- Abrir a parte superior apenas o suficiente para remover a rede. Evite respirar no citrato de chumbo. Lave a rede três vezes por imersão sequencialmente em três copos com água morna, recentemente fervida destilada. Deixe que a grade seco sobre um pedaço de papel de filtro, a secção para cima. A amostra está pronta para o microscópio eletrônico.
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Representative Results
A Figura 2B mostra um exemplo de distribuição de moléculas endógenas Ng nas espinhas dendríticas de CA1 do hipocampo neurónios piramidais. Grelhas de níquel com ultrafinas (60 nm) contendo tecidos CA1 região do hipocampo (como pode ser visto na Figura 2A) foram cobertos em 1% T / PB, 50 mM de glicina, e depois bloqueadas com BSA a 2,5% e 2,5% de soro, antes da incubação com anti Ng-anticorpo. Após a lavagem com T / PB, grelhas foram então cobertas com anticorpo anti-coelho secundário acoplado a 10 nm de ouro. Finalmente, as grades foram lavadas com T / PB e pós-fixados com glutaraldeído a 2%, seguido por acetato de uranilo a 2% e citrato de chumbo de Reynold para aumentar a coloração de contraste. Esquerda, micrografias electrónicas representativas mostrando sinapses assimétricas. Identificação do compartimento de pós-sináptica é facilitada pelo PSD electrões denso (ponta de seta) e bem definida da membrana plasmática. Direita, a distância mais curta entre cada Ng (setas) e a membrana de plasma não foirmalized ao raio da coluna vertebral. Ng moléculas dentro da coluna (mas não no PSD) exibem localização preferencial para a membrana plasmática. Este histograma foi publicado originalmente no Jornal EMBO 8.
Figura 1. Esquemática de CA1 área de dissecção a partir de culturas de fatias do hipocampo. Depois do tratamento experimental para a fatia de tratamento de drogas, por exemplo, ou uma infecção virai, a membrana contendo a fatia foi colocado em tampão gelado de fosfato. A fatia foi primeiro cortado horizontalmente por baixo do giro denteado (DG), em paralelo com a camada de células CA1. O subcampo CA1 foi então isolado por remoção do subcampo CA3 e o subiculum (sub). Para ajudar a identificar a superfície de topo da CA1, um canto foi cortado para orientar o tecido (neste caso, a parte superiorcanto direito).
Figura 2. Immunogold rotulagem de neurogranin em CA1 sinapses em culturas organotípicas de hipocampo. (A) microscopia eletrônica de transmissão mostrando rato área CA1 do hipocampo e sinapses. Dendritos (d) de neurônios piramidais CA1 são facilmente distinguíveis. Identificação de sinapses assimétricas entre terminais axonais 9t) e as espinhas dendríticas (s) é facilitado pela presença de pós-sináptica densidade (PSD, ponta de seta) e bem definida da membrana plasmática. (B) Distribuição do neurogranin (Ng) nas espinhas dendríticas. Esquerda, microscopia eletrônica de transmissão mostrando immunogold-EM rotulagem de nG (setas). Para a quantificação, a distância de cada partícula de ouro (excepto os de PSD, a cabeça de seta) a partir do plasma Membrane é normalizar (eixo x) para o raio da coluna vertebral. Assim, 0 corresponde a uma partícula encontra-se na membrana e uma a uma partícula encontra-se no centro da coluna. Direito, uma distribuição aleatória (rosa) é gerado usando um gerador de números aleatórios macro (Microsoft Excel) em uma coluna em forma de superfície. Ng (azul) mostra o maior pico de distribuição perto da membrana plasmática. Barra de escala, a 200 nm. Este histograma foi publicado originalmente no Jornal EMBO 8.
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Discussion
Neste protocolo, adotamos o método Phend e Weinberg para o cérebro e nos tecidos da medula espinhal para estudar espinhas dendríticas em culturas de ratos hipocampo fatia. Espinhas dendríticas na área CA3-CA1 do hipocampo são delicadas estruturas que contêm uma grande variedade de proteínas que desempenham papéis importantes na regulação de funções neuronais. O método apresentado fornece uma abordagem equilibrada para alcançar antigenicidade melhorada, mantendo boa preservação ultraestrutural (Figura 2A), que permite a eficiência de marcação razoável e boa reprodutibilidade útil para caracterizar a distribuição de antigénios específicos dentro da coluna vertebral. Aqui, nós rotulado Ng com 10 nm de ouro coloidal. Em seguida, quantificou o ouro para gerar padrão de marcação de Ng que ajudou a compreender o seu papel na função sináptica (Figura 2B) 8.
A análise quantitativa da imunomarcação pode ser feito de uma variedade de maneiras 11-13 14-17.
A substituição de ósmio em TA, UA, e p-fenilenodiamina (PPD), nesta abordagem aumentou grandemente a sensibilidade de detecção de antigénios em tecidos neuronais em comparação com métodos anteriores 7. O uso de formaldeído e glutaraldeído assegura a preservação estrutural e retenção de pequenos antigénios solúveis, tais como os aminoácidos. Epóxi à base de resinas acrílicas, ao invés de resinas plásticas, proporcionar uma melhor estabilidade para a incorporação sob o feixe de elétrons, sem comprometer a antigenicidade 7. Comparado com o protocolo padrão de ósmio, Phend et al. </ Em> tinham mostrado que a AT, AU, e também melhorou a PPD preservação estrutural (ver figura 1 do documento Phend original) 7, e que a imunocoloração foi encontrada eficiente para múltiplas proteínas, incluindo a substância P, a calcitonina de peptídeo relacionado com o gene (CGRP), subunidade do receptor AMPA 1 (GluA1), e ácido gama-aminobutírico (GABA) 7. Estes resultados demonstram a capacidade de este procedimento para estudar diferentes proteínas em tecidos neuronais. Outra vantagem deste método é que a AT, UA e PPD são fáceis de preparar e manipular, e representam muito menores riscos perigosos do que o ósmio, o que é extremamente volátil e muito tóxico por inalação e contato com a pele.
Uma limitação deste método é que, embora se preserve e retém antigénios pequenos, tais como os aminoácidos, ela não mostra imunomarcação melhorada para essas moléculas em comparação com o tratamento convencional de ósmio. A vantagem de o cloreto de metal pesado de platina para preservar structure e para aumentar a imunorreactividade também parece estar limitado à medula espinhal, por razões que não estão completamente compreendidas 7. Embora o método de ósmio livre melhora a antigenicidade e contraste do tecido, não parece funcionar bem para a preservação de outras estruturas, tais como vesículas pré-sinápticas (ver Figura 2). Além disso, Phend et al. Observaram que a ausência de ósmio também resultou na redução da mielina preservação, como TA tem penetrabilidade limitada para os componentes intracelulares para preservar membranas 7. Por estas razões, os métodos de congelamento para a preparação de amostras podem ser alternativas melhores se preservação ultra-estrutural é a preocupação mais importante. Congelamento ultra-rápido das amostras permite a preservação de moléculas de uma maneira mais natural, 18, sem artefactos potenciais que poderiam ser introduzidos através da utilização de fixadores químicos.
Antes de realizar a EM, a presença deo antigénio na amostra deve ser confirmada através de meios tais como a análise de Western blot. Tal como acontece com todos os estudos de imunomarcação, a interpretação correcta dos dados baseia-se na utilização de anticorpos específicos, apropriados. Altamente purificados anticorpos monoclonais devem ser sempre utilizados, se disponível. As experiências de controlo são essenciais para garantir que o padrão de marcação gerada é devido à interacção específica entre o anticorpo primário e o imunogénio. A especificidade da marcação pode ser testada através de controlos negativos e positivos. Por exemplo, no controlo negativo, o anticorpo primário pode ser substituído por um soro de controlo não relacionada de IgG não-imune, sem alterar as outras etapas do protocolo de coloração. Em segundo lugar, uma proteína que está presente em um compartimento da célula, mas não em outros, pode ser usada como um controlo positivo. Por exemplo, em sinapses glutamatérgicas, PSD-95 é um marcador de pós-sináptica, enquanto GAP-43 é principalmente presente no terminal pré-sináptico 19-22.Se a rotulagem é visto quando o anticorpo primário é omitido ou em compartimentos em que a proteína não é conhecida a estar presente, então a rotulagem não é específica.
Uma vez que a especificidade do anticorpo primário é rigorosamente testados, um deve estar ciente de que as amostras com boa rotulagem não deve apresentar aglutinação muitos ou têm excesso de partículas de ouro no fundo onde não há tecido está presente. Se a quantidade de ouro que é demasiado alta ou demasiado baixa, aumentar o nível ou a duração do bloqueio e da concentração de anticorpo de acordo. Maunsbach e Afzelius fornecer alguns excelentes exemplos e dicas para imunomarcação 23.
Preservação estrutural bom de amostras pode eliminar artefatos que podem interferir com a morfologia e confundir a interpretação dos dados. Assim, a conservação superior de estruturas ilustradas por este método faz com que esta técnica aplicável a um certo número de tecidos biológicos, especialmente onde as estruturas delicadas podem serfacilmente distorcidos ou destruídos durante o processamento da amostra. Assim, para além de fatias de hipocampo organotípicas, este método também pode ser extremamente valiosa para outras preparações neuronais incluindo fatias cerebrais agudas e culturas primárias neuronais. Fatias de hipocampo organotípicas são facilmente alteráveis ao tratamento medicamentoso e expressão das proteínas através de infecção virai, o qual pode ser aplicado para estudar a plasticidade sináptica hipocampal. Este método também é útil para examinar os efeitos de diferentes condições experimentais sobre a distribuição de antigénio ou de uma localização no corpo celular, dendritos, ou espinhas dendríticas. Além disso, as partículas de ouro coloidal com tamanho de 6, 10, 15 ou 25 nm estão disponíveis, o que torna possível proceder a rotulagem múltiplo sem sobreposição. Acreditamos que a vantagem de antigenicidade aumentada, flexibilidade de sondas e reprodutibilidade de rotulagem immunogold demonstrar o poder desta técnica para estudar uma variedade de antigénios. É potencialmente useful para a caracterização da localização e distribuição de receptores, receptor-interagindo proteínas, transportadores, canais de iões e muitas outras em tecidos diferentes do cérebro, incluindo o córtex, tálamo, cerebelo e bolbo olfactivo.
Em resumo, o presente protocolo de um ósmio livre de marcação imuno, pós-incorporação de culturas de ratos hipocampo fatia é uma ferramenta valiosa para estudar vários antígenos dentro de espinhas dendríticas. O potencial de aplicação desse método em outros delicados tecidos nervosos centrais será muito útil para examinar as características ultra-estruturais de diferentes moléculas-chave e para ajudar a compreender o seu papel nas funções biológicas.
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Disclosures
Não temos nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Matthew Florença para preparação das culturas de hipocampo. Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional dos EUA sobre Envelhecimento e Associação de Alzheimer de NZG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 x 15 mm polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Disposable scalpel | EXELINT | 29552 | |
| Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| 10 nm Goat-anti-rabbit gold | Electron Microscopy Sciences | 25108 | |
| Anti-Neurogranin antibody | Millipore | AB5620 | |
| 100% Picric acid | Electron Microscopy Sciences | 19550 | |
| 96% Paraformaldehyde | Acros Organics | AC41678-0030 | |
| 25% Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma | G5882 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
| p-Phenylenediamine | Sigma | P6001 | |
| Platinum (IV) chloride | Sigma | 379840 | |
| Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 |
References
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