Summary
Die Lokalisation und Verteilung von Proteinen liefern wichtige Informationen für das Verständnis ihrer zellulären Funktionen. Die überlegene Ortsauflösung der Elektronenmikroskopie (EM) verwendet, um die subzelluläre Lokalisierung eines bestimmten Antigens nach Immunohistochemie bestimmen. Für Gewebe des zentralen Nervensystems (ZNS), Erhaltung strukturelle Integrität während Antigenität war besonders schwierig im EM-Studien. Hier nehmen wir ein Verfahren, das verwendet wurde, um Strukturen und Antigene im ZNS zu studieren zu bewahren und zu charakterisieren synaptischen Proteinen in Ratten-Hippocampus-CA1 pyramidalen Neuronen.
Abstract
Immunelektronenmikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um biologische Moleküle auf subzellulärer Ebene zu studieren. Antikörper gekoppelt elektronendichten Marker wie kolloidales Gold offenbaren kann die Lokalisation und Verteilung von spezifischen Antigenen in verschiedenen Geweben ein. Die beiden am häufigsten verwendeten Techniken sind pre-embedding und Post-embedding Techniken. In vor-Einbettung Immunogold-Elektronenmikroskopie (EM)-Techniken, muss das Gewebe permeabilisiert zu Antikörper Eindringen zu ermöglichen, bevor er eingebettet werden. Diese Techniken sind ideal zum Konservieren Strukturen aber schlechte Penetration des Antikörpers (oft nur die ersten paar Mikrometer) ist ein erheblicher Nachteil, 2. Die post-Einbettung Kennzeichnung Methoden können dieses Problem vermeiden, weil Kennzeichnung erfolgt auf Abschnitten von festen Geweben, in denen Antigene leichter zugänglich sind. Im Laufe der Jahre wurden eine Reihe von Änderungen, die post-Einbettung verbessert Immunreaktivität zu verbessern und Ultrastruktur bewahren Gewebefixierung ist ein entscheidender Teil des EM-Studien. Fixative chemisch vernetzen die Makromoleküle, die Gewebestrukturen einrastet. Die Wahl der Fixateur wirkt nicht nur strukturelle Erhaltung, sondern auch Antigenität und Kontrast. Osmiumtetroxid (OsO 4), Formaldehyd, Glutaraldehyd und wurden die Standard-Fixiermittel für Jahrzehnte, einschließlich des zentralen Nervensystems (CNS) Gewebe, die besonders anfällig für strukturelle Beschädigungen bei chemischen und physikalischen Verarbeitung sind. Leider ist OsO 4 hochreaktiv und wurde gezeigt, dass maskieren Antigene 6, was zu einer schlechten und unzureichende Etikettierung. Alternative Ansätze zur chemischen Fixierung vermeiden sind Einfrieren der Gewebe. Aber diese Techniken sind schwierig durchzuführen und erfordern teure Instrumente. Um einige dieser Probleme anzugehen und ZNS-Gewebe Kennzeichnung, Phend et al verbessern. ersetzt OsO 4 mit Uranylacetat (UA) und Tannin acid (TA), und erfolgreich zusätzliche Modifikationen eingeführt, um die Empfindlichkeit der Antigennachweis und strukturelle Erhaltung im Gehirn und Rückenmark Geweben 7 zu verbessern. Wir haben dieses Osmium-free post-Einbettung Methode Rattenhirngewebe angenommen und optimiert die Immunogoldmarkierung Technik zu erkennen und zu studieren synaptischen Proteinen. Wir stellen Ihnen hier eine Methode, um die ultrastrukturellen Lokalisation der synaptischen Proteinen in Ratten hippocampalen CA1 Pyramidenzellen bestimmen. Wir verwenden organotypischen hippocampalen kultivierten Scheiben schneiden. Diese Scheiben halten die trisynaptic Schaltung des Hippocampus, und sind daher besonders nützlich zur Untersuchung synaptischer Plastizität, ein Mechanismus weithin angenommen, Lernen und Gedächtnis zugrunde liegen. Organotypischen hippocampalen Schnitten aus postnatalen Tag 5 und 6 Maus / Rattenjungen können wie zuvor beschrieben 8 werden und sind besonders nützlich, um akut Knockdown oder überexprimieren exogenen Proteinen. Wir haben dieses Protokoll ch verwendetaracterize Neurogranin (Ng), einem Neuronen-spezifischen Proteins mit einem kritische Rolle bei der Regulierung der synaptischen Funktion 8,9. Darüber hinaus haben wir es verwendet, um die Lokalisierung von ultrastrukturelle Calmodulin (CaM) und Ca 2 + / Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaMKII) 10 charakterisieren. Wie in den Ergebnissen dargestellt, ermöglicht dieses Protokoll gute ultrastrukturelle Erhaltung der dendritischen Dornen und effiziente Kennzeichnung von Ng zu helfen charakterisieren ihre Verteilung in der Wirbelsäule 8. Weiterhin kann das hier beschriebene Verfahren eine breite Anwendbarkeit bei der Untersuchung viele andere Proteine in neuronalen Funktionen beteiligt sind.
Protocol
Ein. Fixierung
Fixative sind cancerogen Handschuhe tragen und handhaben die Fixiermittel in einer Abzugshaube. Soweit nicht anders angegeben, sind alle Inkubationen auf Eis durchgeführt und alle Lösungen sollten vor der Verwendung gefiltert werden. Verwenden Elektronenmikroskopie-grade Reagenzien.
Tag 1
- Nach experimentellen Bedingungen (zB virale Injektion, medikamentöse Behandlung), legen Sie die Membran mit organotypischen Schnitten des Hippocampus in einem 60 x 15 mm Polystyrol Petrischale mit eiskaltem 0,1 M Phosphatpuffer (Sorensen Phosphat-Puffer), pH 7,3. Fügen Sie 1 bis 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer direkt auf die Scheiben, um sie kalt.
Entscheidender Schritt: Verwenden Sie immer frisch zubereitet Puffer und Fixative. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert des Puffers innerhalb gewünschten Bereich. Ein Scheitern zu tun beschädigen könnten zellulären Strukturen.
- Um die CA1 Unterfeld der Scheibe zu isolieren, verwenden Sie einEinmalskalpell sanft über die Scheibe neben der DG, parallel zur CA1 Zellschicht (Abbildung 1) geschnitten. Dann schneiden Sie die restlichen Scheibe vertikal, um die CA3 Unterfeld und die Subiculum entfernen. Schneiden Sie eine Ecke der Scheibe zur Identifizierung der Oberseite des Gewebes.
HINWEIS: Falls keine virale Lieferung von Protein von Interesse erforderlich ist, das gesamte Gewebeschnitt fixiert, nachdem die Medien mit einem sanften eiskaltem Puffer spülen entfernt wird. Dieses wird dann durch Ausschneiden der CA1 gefolgt.
Entscheidender Schritt: Verfolgen Sie die Oberseite des Gewebes, um für die richtige Schneiden der Gitter später.
- Entfernen Sie vorsichtig das Gewebe aus der Membran unter Verwendung der Rückseite des Skalpells. Verwenden einer Pasteurpipette zu übertragen, um sanft das Gewebe bis zu einer 12-well Platte mit 0,1 M Phosphatpuffer.
- Entfernen Sie den Puffer in der auch von der Platte und 500 & mu, l - 1 ml eiskaltem Fixiermittel (pH 7,3) wie folgt zusammen: 0,1% Pikrinsäure, 1% Paraformaldehyd und 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer. Inkubieren für 2 Stunden bei 4 ° C.
HINWEIS: Pikrinsäure kann explosiv sein, wenn sie trocken. Halten Sie es angefeuchtet mit Wasser in einem Behälter dicht geschlossen halten. An einem trockenen und gut belüfteten Ort aufbewahren.
- Entfernen Sie die Fixiermittel aus dem Brunnen und waschen Proben 3 mal (20 min jeweils) in 0,1 M Phosphatpuffer.
- Inkubieren für 40 min in 1% Tanninsäure (w / v) in 0,1 M Maleinat-Puffer, pH 6,0.
- Spülen Sie zweimal (jeweils 20 min) in Maleatpuffer.
- Inkubieren für 40 min in 1% Uranylacetat (w / v) in Maleatpuffer im Dunkeln. Uranylacetat ist lichtempfindlich und ist radioaktiv. Das Becherglas mit Parafilm beim Auflösen und speichern Sie unbenutzte Puffer im Dunkeln bei 4 ° C.
- Spülen Sie zweimal (jeweils 20 min) in Maleatpuffer.
- Inkubieren für 20 min in 0,5% Platin Chloride (w / v) in Maleatpuffer.
- Spülen Sie zweimal (jeweils 20 min) in Maleatpuffer. Speichern die Proben bei 4 ° C, bis sie zur weiteren Verarbeitung bereit sind.
2. Dehydration und Embedding
Propylenoxid ist krebserregend. Vermeiden Dämpfe durch die Arbeit mit ihm in einer Abzugshaube. Verwenden Sie absolute, 100% reinem Ethanol, die keine Spuren von Wasser enthält. Verdünnen Sie dieses absolute Ethanol zu unterschiedlichen Konzentrationen zur Entwässerung herzustellen.
Tag 2
- Inkubation für 5 min in 50% Ethanol und dann 5 min in 70% Ethanol.
- Inkubieren für 15 min in frisch zubereiteten 1% p-Phenylendiamin (PPD) in 70% Ethanol.
- Spülen dreimal in 70% Ethanol.
- Inkubation für 5 min in 80% Ethanol und dann 5 min in 95% Ethanol.
- Inkubieren in 100% Ethanol zweimal jeweils 5 min.
- Bereiten Glasfläschchen mit Schraubverschluss und stellen Sie sicher, sie sind sauber und komplett trocken. Übertragen Slices Glasfläschchen undbeschriften jedes Fläschchen einfach und klar.
- Inkubation für 5 min in 1:1 Ethanol: Propylenoxid.
- Inkubieren in 100% Propylenoxid zweimal jeweils 5 min.
- Fügen Harz (Epon) zu jedem Fläschchen ein 1:1-Gemisch mit Propylenoxid zu machen. Sanft für 2 Stunden zu mischen. Nicht schütteln die Fläschchen zu rigoros, um Blasen, die mit Einbettung stören könnten.
- Hinzufügen Harz, um ein 3:1-Gemisch mit Propylenoxid, und Mischen für 2 Stunden zu machen.
- Übertragen auf 100% Harz und inkubieren O / N.
Tag 3
- Sandwich-Proben zwischen Streifen aus ACLAR Kunststoff und Heilmittel für 24 Stunden bei 60 ° C.
3. Schneiden und Montage auf Grids
Tag 4
- Geschnitten semidünnen (0,5 um) Abschnitte und Flecken mit 1% Toluidinblau + 1% Borax, um die korrekte Ausrichtung der Proben zu bestimmen.
- Geschnitten Ultradünnschnitten (60 nm) und Halterungen auf Nickel Gitter, ein Abschnitt pro Raster.
4. Immunhistochemie
Alle Puffer und Wasser sollte vor dem Gebrauch gefiltert werden.
Tag 5
- Geben Sie einen Tropfen (~ 50 ul) von 1% Tween-20/phosphate Puffer (T / PB), pH 7,5, auf ein Stück sauberer Parafilm auf einer ebenen Fläche. Vorsichtig holen die Gitter mit sauberen Pinzette durch die Kante und schweben auf dem Puffer, Abschnitt unten, und inkubieren für 10 min bei RT.
- Überschüssiges Flüssigkeit aus dem Gitter durch Anordnen Abschnitt nach oben auf auf Filterpapier und anschließend schwimmen auf 50 mM Glycin in T / PB für 15 min bei RT.
Entscheidender Schritt: Zur Vermeidung übermäßigen "carry-over" von Lösungen aus einer Lösung Tropfen zum nächsten während der Inkubationen, abtropfen überschüssige Flüssigkeit durch leichtes Berühren der Kante des Gitters auf # 1 Filterpapier zwischen jeder Lösung ändern. Außerdem entfernen Lösung zwischen den Armen des EM eingefangenen Forceps Halten des Gitters durch sanftes Dochtwirkung mit einem Faserband aus Filterpapier zwischen den Zangenschenkeln während ensuklingeln die Abschnitte nicht vollständig austrocknen.
- Trocknen des Gitters mit Filterpapier und anschließend schwimmen auf blockierende Lösung, die 2,5% BSA und 2,5% Serum von dem Tier des sekundären Antikörpers in T / PB 30 min bei RT.
- Inkubieren mit primärem Antikörper (in T / PB) bei RT oder O / N bei 4 ° C. Die optimale Zeit und Temperatur der Inkubation sowie Antikörperkonzentration, müssen experimentell bestimmt.
- Waschen Sie das Raster drei Mal (2 min jeweils) mit T / PB.
- Inkubieren mit sekundärem Antikörper (1:20 Anti-Kaninchen oder Anti-Maus gekoppelt bis 10 nm Gold) für 1 Stunde bei RT.
- Dreimal (2 min jeweils) mit T / PB.
- Postfix mit 2% Glutaraldehyd in T / PB für 5 min.
- Dreimal (2 min jeweils) mit T / PB und dann dreimal (2 min jeweils) mit gefiltertem Wasser.
- Inkubieren mit 2% Uranylacetat in Wasser für 10 min.
Während das Gitter Färbung, bereiten Sie einen CO 2-freien Kammer durch placinga Stück Parafilm im Zentrum eines Glases Petrischale. Dann legen 4-6 Pellets von NaOH in der Schale um den Parafilm um CO 2 in der Luft aufnehmen. Halten Sie die oben geschlossen für ein paar Minuten. Verwenden einer Pasteurpipette und schnellen Übertragen eines kleinen Volumens von Bleicitrat Reynold-Lösung des Parafilm im Glas Petrischale. Öffnen Sie die obere gerade genug, um die Pasteurpipette einlegen, um die Wiedereinführung von CO 2 in die Kammer zu minimieren.
HINWEIS: Um Reynolds Bleicitrat Lösung zu machen, kochen 100 ml entionisiertem Wasser in einem Mikrowellenherd und lassen in einem luftdichten Behälter kühl. In einem 50-ml-Messkolben mit Stopfen, mix 1,33 g Bleinitrat, 1,76 g Natriumcitrat und 30 ml des abgekochtes Wasser durch kräftiges Schütteln für 1 min. Dann zeitweise schütteln für 30 min. Zu diesem trübe Lösung, 8 ml 1 M Natronlauge und langsam umzukehren den Kolben ein paar mal. Lösung klar geworden. Wird die Lösung auf 50 ml mit der gekochten water. Bewahren Sie die Lösung dicht geschlossen halten. Wenn Niederschlag erscheint, zu verwerfen und einen neuen ein.
- In drei kleineren Bechern vorzubereiten warm, frisch gekochtes deionisiertem Wasser. Waschen Sie die Uranylacetat durch Eintauchen des Rasters im ersten Becherglas und sanft wirbeln sie herum für 30 sek. Wiederholen Sie diesen Schritt in den beiden anderen Becher.
- Öffnen Sie die Spitze des Glases Petrischale gerade genug, um das Gitter auf der Tropfen Bleicitrat Reynold-Lösung stellen. Falls möglich, tragen eine Maske während diese Weise, um die Atmung zu Bleicitrat vermeiden und um die Bildung von Niederschlag zu verhindern. Inkubieren für 10 min.
- Öffnen Sie die obere gerade genug, um das Gitter zu entfernen. Einatmen der Bleicitrat. Waschen Sie die Grid dreimal durch Eintauchen sequentiell in drei Bechern mit warmen, frisch gekochtes destilliertes Wasser. Lassen Sie das Gitter trocken auf einem Stück Filterpapier, Abschnitt up. Die Probe ist nun bereit für das Elektronenmikroskop.
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Representative Results
2B zeigt ein Beispiel der Verteilung des endogenen Ng Moleküle in dendritischen Dornen von hippocampalen CA1 pyramidalen Neuronen. Nickelgittern mit ultradünnen (60 nm) enthält Geweben CA1-Region des Hippocampus (wie in 2A zu sehen) wurden in 1% abgedeckt T / PB, 50 mM Glycin, dann mit 2,5% BSA und 2,5% Serum vor der Inkubation mit Anti blockiert Ng-Antikörpers. Nach dem Waschen mit T / PB, wurden Netze dann in anti-Kaninchen sekundären Antikörper gekoppelt an 10 nm Gold bedeckt. Schließlich wurden Gittern mit T / PB gewaschen und nachfixiert mit 2% Glutaraldehyd um 2% Uranylacetat und Reynold-Bleicitrat Anfärben zu Kontrastverstärkung gefolgt. Left, repräsentativen elektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigen asymmetrischen Synapsen. Identifizierung des postsynaptischen Abteil durch die Elektronen-dichte PSD (Pfeilspitze) und wohldefinierte Plasmamembran erleichtert. Rechten betrug der kürzeste Abstand zwischen jedem Ng (Pfeile) und der Plasmamembran keinenrmalized dem Radius der Wirbelsäule. Ng Moleküle innerhalb der Wirbelsäule (aber nicht an der PSD) aufweisen bevorzugte Lokalisierung auf der Plasmamembran. Dieses Histogramm wurde ursprünglich im EMBO Journal 8 veröffentlicht.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der CA1-Region des Hippocampus Dissektion von den Slice-Kulturen. Nach experimentellen Behandlung der Scheibe, zB medikamentöse Behandlung oder viralen Infektion, die Membran, die die Scheibe wurde in eiskaltem Phosphat-Puffer gegeben. Der Schnitt wurde zunächst horizontal unter dem Gyrus dentatus (DG), die parallel zu der CA1 Zellschicht geschnitten. Die CA1 Unterfeld wurde dann durch Entfernen der CA3 Unterfeld und das Subiculum (sub) isoliert. Um zur Ermittlung der oberen Oberfläche der CA1 wurde eine Ecke zu orientieren dem Gewebe geschnitten (in diesem Fall der obererechten Ecke).
Abbildung 2. Immunogoldmarkierung der Neurogranin am CA1 Synapsen im organotypischen hippocampalen Slice-Kulturen. (A) Transmissionselektronenmikroskopaufnahmen zeigt Ratten hippocampalen CA1-Region und Synapsen. Dendriten (d) von CA1 pyramidalen Neuronen sind leicht zu erkennen. Identifizierung von asymmetrischen Synapsen zwischen axonalen Endgerät 9t) und dendritischen Dornen (s) wird durch die Gegenwart von postsynaptischen (PSD, Pfeilspitze) und wohldefinierte Plasmamembran erleichtert. (B) Verteilung der Neurogranin (Ng) in dendritischen Dornen. Left, TEM-Aufnahmen zeigen Immunogold-EM Kennzeichnung von nG (Pfeile). Zur Quantifizierung der Abstand jedes Goldpartikel (ausgenommen die, die bei PSD, Pfeilspitze) aus dem Plasma membrane ist Normalisieren (x-Achse) zu dem Radius der Wirbelsäule. Daher 0 zu einer Partikelgröße, die auf der Membran und ein an ein Teilchen liegen in der Mitte der Wirbelsäule entspricht. Rechts ist eine statistische Verteilung (rosa) unter Verwendung eines Zufallszahlengenerators Makro (Microsoft Excel) in einer Wirbelsäule-förmigen erzeugten Oberfläche. Ng (blau) zeigt die höchste Spitze Verteilung nahe der Plasmamembran. Maßstabsbalken, 200 nm ist. Dieses Histogramm wurde ursprünglich im EMBO Journal 8 veröffentlicht.
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Discussion
In diesem Protokoll haben wir die Phend und Weinberg Methode für Gehirn und Rückenmark Gewebe dendritischen Dornen in Ratten Hippocampusschnitt Kulturen zu studieren angenommen. Dendritischen Dornen in der hippocampalen CA3-CA1-Region sind empfindliche Strukturen, die eine Vielzahl von Proteinen, die eine wichtige Rolle spielen bei der Regulierung der neuronalen Funktionen. Das vorgestellte Verfahren stellt eine ausgewogene Ansatz zur Erzielung verbesserter Antigenizität unter Beibehaltung guter ultrastrukturelle Konservierung (2A), gestattet angemessenen Kennzeichnung Effizienz und guter Reproduzierbarkeit nützlich zur Charakterisierung der Verteilung der spezifischen Antigenen innerhalb der Wirbelsäule. Hier bezeichnet man mit 10 nm kolloidalem Gold Ng. Wir haben dann das Gold quantifiziert, um die Kennzeichnung Muster von Ng, die zu seiner Rolle in der synaptischen Funktion (2B) 8 zu verstehen geholfen, zu generieren.
Quantitative Analyse der Immunogold kann in vielfältiger Weise geschehen 11-13 14-17 angesprochen worden.
Der Ersatz von Osmium mit TA, UA, und p-Phenylendiamin (PPD) in diesem Ansatz deutlich die Empfindlichkeit Antigennachweis in neuronalen Gewebe im Vergleich zu bisherigen Verfahren 7 verbessert. Die Verwendung von Formaldehyd und Glutaraldehyd gewährleistet strukturellen Konservierung und Aufbewahrung von kleinen löslichen Antigenen wie Aminosäuren. Epoxy basierende Harze, anstatt Acrylkunststoff Harze, eine bessere Stabilität für die Einbettung unter dem Elektronenstrahl ohne Antigenität 7. Im Vergleich zu Standard-Osmium-Protokoll, Phend et al. </ Em> hatten gezeigt, dass TA, UA und PPD verbessert Strukturerhaltung (siehe Abbildung 1 der ursprünglichen Phend Papier) 7, und dass eine effiziente Immunfärbung wurde für mehrere Proteine, einschließlich Substanz gefunden P, Calcitonin gene-related peptide (CGRP), AMPA-Rezeptor-Untereinheit 1 (GluA1) und Gamma-Aminobuttersäure (GABA) 7. Diese Ergebnisse zeigen die Fähigkeit des Verfahrens an verschiedene Proteine in neuronalen Geweben zu untersuchen. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist, dass TA, UA und PPD einfach herzustellen und zu handhaben sind, und stellen viel kleiner gefährliche Risiken als Osmium, die extrem volatilen und sehr giftig beim Einatmen und Berührung mit der Haut ist.
Eine Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass, obwohl es und erhält beibehält kleine Antigene wie Aminosäuren, es zeigt nicht verbessert Immunmarkierung für diese Moleküle im Vergleich zu herkömmlichen Osmium Behandlung. Der Vorteil des Schwermetalls Platinchlorid zu bewahren structure und Immunreaktivität verbessern scheint auch zum Rückenmark begrenzt werden, aus Gründen, die nicht vollständig verstanden 7. Obwohl die Osmium-freie Methode verbessert Antigenität und Gewebe dagegen scheint es nicht gut zu funktionieren für die Erhaltung von anderen Strukturen wie präsynaptischen Vesikeln (siehe Abbildung 2). Außerdem hatte Phend et al. Beobachtet, dass die Abwesenheit von Osmium führte auch zu reduzierten Myelin Konservierung, als TA hat begrenzte Penetration in die intrazellulären Komponenten zu erhalten Membranen 7. Aus diesen Gründen kann das Einfrieren Methoden zur Probenvorbereitung bessere Alternativen, wenn ultrastrukturelle Erhaltung ist das wichtigste Anliegen. Ultraschnellen Einfrieren der Probe ermöglicht die Erhaltung von Molekülen in einer natürlicheren Art und Weise 18, ohne potentielle Artefakte, die durch die Verwendung von chemischen Fixiermittel eingeführt werden könnten.
Vor der Durchführung der EM, das Vorhandensein vondas Antigen in der Probe soll über Wege, wie Western-Blot-Analyse bestätigt werden. Wie bei allen Studien Immunmarkierung stützt korrekte Interpretation der Daten für die Verwendung geeigneter, spezifische Antikörper. Hochgereinigte monoklonalen Antikörpern sollte immer verwendet werden, sofern vorhanden. Kontrollversuche sind wesentlich, um sicherzustellen, dass die Kennzeichnung Muster erzeugt aufgrund der spezifischen Wechselwirkung zwischen dem primären Antikörper und das Immunogen ist. Die Spezifität der Markierung kann durch die Durchführung negative und positive Kontrollen getestet werden. Zum Beispiel, in einer negativen Kontrolle kann der primäre Antikörper durch einen unabhängigen Kontrollserum von nicht-immunen IgG ersetzt werden, ohne dass irgendwelche anderen Schritte in dem Färbeprotokoll. Zweitens kann ein Protein, das in einem Zellkompartiment, nicht aber in anderen ist als eine positive Kontrolle verwendet werden. Zum Beispiel in glutamatergen Synapsen ist PSD-95 a postsynaptischen Marker während GAP-43 ist in erster Linie in der Präsynapse 19-22.Bei Etikettierung gesehen, als primären Antikörper weggelassen oder in Kompartimenten, in denen das Protein bekanntermaßen nicht vorhanden sein wird, so ist die Beschriftung ist nicht spezifisch.
Sobald die Spezifität des primären Antikörpers rigoros getestet wird, sollte man sich bewusst sein, dass Proben mit gut Kennzeichnung sollte nicht zeigen viele Verklumpung oder übermäßige Goldpartikel im Hintergrund, wo kein Gewebe vorhanden ist. Wenn die Menge des Goldes zu hoch oder zu niedrig ist, um den Pegel oder die Dauer der Sperrung und die Konzentration des Antikörpers entsprechend. Maunsbach und Afzelius bieten einige hervorragende Beispiele und Tipps für Immunmarkierung 23.
Guten baulichen Erhaltung der Proben zu eliminieren Artefakte, die mit Morphologie stören und verwirren die Interpretation der Daten kann. Daher macht die überlegene Bautenschutz nach dieser Methode dargestellte diese Technik anwendbar auf eine Reihe von biologischen Geweben insbesondere wenn feine Strukturen sein kannleicht verzerrt oder zerstört während der Probenaufbereitung. Folglich, zusätzlich zu organotypischen hippocampalen Schnitten, kann diese Methode auch für andere wertvolle enorm neuronalen Zubereitungen einschließlich akuter Gehirnschnitten und primären neuronalen Kulturen. Organotypischen Schnitten des Hippocampus sind leicht änderbare der medikamentösen Behandlung und die Expression von Proteinen durch virale Infektion, die anwendbar sein für die Untersuchung des Hippocampus synaptische Plastizität kann. Dieses Verfahren ist auch nützlich, um die Effekte von verschiedenen experimentellen Bedingungen auf Antigen Verteilung oder Lokalisation im Zellkörper, Dendriten oder dendritischen Dornen untersuchen. Weiterhin sind kolloidale Goldpartikel mit Größen von 6, 10, 15 oder 25 nm erhältlich, wodurch es möglich, mehrere Kennzeichnung ohne Überlappung. Wir glauben, dass der Vorteil der verbesserte Antigenität, Flexibilität von Sonden und Reproduzierbarkeit Immungoldmarkierung die Kraft dieser Technik, um eine Vielfalt von Antigenen zu studieren demonstrieren. Es ist potentiell Wissel, um die Lokalisierung und Verteilung der Rezeptoren, Rezeptor-wechselwirkende Proteine, Transporter, Ionenkanäle und viele andere in den Hirngeweben einschließlich Cortex, Thalamus, Kleinhirn und Riechkolben charakterisieren.
Zusammenfassend ist die vorliegende Protokoll einer Osmium-freie, post-Einbettung Immungoldmarkierung von Ratten Hippocampusschnitt Kulturen ein wertvolles Instrument, um verschiedene Antigene innerhalb dendritischen Dornen studieren. Das Potenzial Anwendbarkeit dieser Methode in anderen empfindlichen zentralen Nervengewebe wird sehr nützlich sein, um die ultrastrukturelle Eigenschaften der verschiedenen Schlüssel-Moleküle zu untersuchen und besser zu verstehen ihre Rolle in der biologischen Funktionen.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten sich Matthew Florence zur Herstellung der Hippocampusschnitt Kulturen danken. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus US-amerikanischen National Institute on Aging und Alzheimer Association NZG unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 x 15 mm polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Disposable scalpel | EXELINT | 29552 | |
| Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| 10 nm Goat-anti-rabbit gold | Electron Microscopy Sciences | 25108 | |
| Anti-Neurogranin antibody | Millipore | AB5620 | |
| 100% Picric acid | Electron Microscopy Sciences | 19550 | |
| 96% Paraformaldehyde | Acros Organics | AC41678-0030 | |
| 25% Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma | G5882 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
| p-Phenylenediamine | Sigma | P6001 | |
| Platinum (IV) chloride | Sigma | 379840 | |
| Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 |
References
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