Summary
אנו מתארים פרוטוקולים לarteriosclerois שוחדנו העכבר (GA) דגמים אשר כרוך חציצה של מגזר כלי עכבר לנמען של אותו הזן המולד. על ידי backcrossing שינויים גנטיים נוספים לתורם הכלי, המודל יכול להעריך את ההשפעה של גנים ספציפיים על GA.
Abstract
arteriosclerois שתל (GA), המכונה גם vasculopathy שתל, הוא נגע פתולוגי שמתפתח במשך חודשים עד שנים באיברים מושתלים המתאפיינים בהיצרות מפוזרת, היקפית של כלי דם שתל העץ כולו. המרכיב הקריטי ביותר של פתוגנזה GA הוא ההתפשטות של תאים דמויי שריר חלק בתוך אינטימה. כאשר קטע עורק הכלילי אנושי התערב לaortae אינפרא הכליה של עכברי immunodeficient, את intimas אפשר היה להרחיב בתגובה שהועברו adoptively תאי T האנושיים אלוגנאית לתורם העורק או אקסוגני אנושי IFN-γ בהיעדר תאי T אנושיים. התערבותם של אב העורקים עכבר מזן אחד לנמען זן עכבר אחר היא מוגבלת כמודל לדחייה כרונית בבני אדם, כי תגובת הדחייה חריפה תא בתיווך במודל עכבר זה מבטלת לחלוטין את כל תורמים שמקורם בתאי הדם מהשתל בתוך שניים השלוש שבועות. לאחרונה פיתחנו שניים מ 'חדשouse דגמים לעקוף את הבעיות הללו. המודל הראשון כולל חציצה של קטע כלי מעכבר זכר לנקבת נמען של אותו הזן המולד (C57BL/6J). דחיית שתל במקרה זה מופנה רק נגד אנטיגנים histocompatibility קלים המקודדים על ידי כרומוזום Y (בהווה בזכר אך לא נקבה) ותגובת הדחייה שמתפתחת הוא עצל במידה מספקת כדי לשמר הנגזרות תורמות תאי שריר חלק למשך מספר שבועות. המודל השני כולל חציצת קטע עורק מתורם עכבר C57BL/6J סוג בר לעכבר שורה של אותו הזן ומין שחסר את הקולטן לIFN-γ ואחריו ממשל של עכבר IFN-γ (מועבר באמצעות זיהום של העכבר כבד עם וקטור adenoviral. אין דחייה במקרה זה כמו גם תורם ועכברי נמען הם מאותו הזן והמין, אך תאי שריר חלק תורם להתרבות בתגובה לציטוקינים ואילו מארח שמקורם בתאים, חסרי קולטן לציטוקין זה, לא מגיב. על ידי backcrossing שינויים גנטיים נוספים לתורם הכלי, ניתן להשתמש בשני המודלים כדי להעריך את ההשפעה של גנים ספציפיים על התקדמות GA. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לדגמי GA העכבר שלנו.
Introduction
arteriosclerois שתל (GA), המכונה גם vasculopathy שתל, הוא נגע פתולוגי שמתפתח במשך חודשים עד שנים באיברים מושתלים המתאפיינים בהיצרות מפוזרת, היקפית של עץ כלי דם השתל כל 7. בשלבים מוקדמים עלולים לגרום להיצרויות אקסצנטרית ומוקדים כי הם ברורים יותר בעורקים, ובכך דומה יותר מקרוב היצרויות ראתה בטרשת עורקת קונבנציונלית. אובדן לומן של התוצאות מהתרחבות כלי שתל intimal עקב חדירה של תאי T ומקרופגים מארחים ובמיוחד להצטברות של מטריקס ודמוי תאי שריר חלק שמקורו משתל, מארח או שניהם 5, 13, 19, כי הוא יפוצה כראוי על ידי שיפוץ כלי החוצה. בallografts לב, הנגעים המשמעותיים ביותר מהבחינה קלינית הם אלה בעורקים הכליליים וepicardial intramyocardial. סופו של דבר, GA של העורקים הכליליים יגרום אי ספיקת לב איסכמית. GA הוא הגורם העיקרי לגר לב מאוחרהפסד מאחור. ביצרויות של GA לעצור בקווי התפר, חזק להפליל את תגובת המארח לalloantigens שתל בפתוגנזה שלה ומוביל אותנו לסווג GA כסוג של דחייה כרונית 3. עם זאת, צורות אחרות של פגיעה בעורקים עלולות להגביר את הסיכון של GA, בין אם באמצעות הגדלת נטל הנקי של פציעה או על ידי העמקת ו / או ויסות תגובת alloimmune. התא רירית (EC) האנדותל של עורקי שתל נשמר בGA האנושי והאזורים השטחיים ביותר של אינטימה בסמוך לרירית EC הוא האתר הסתנן ביותר בכבדות על ידי מארח נגזר IFN-γ-ייצור תאי T ומקרופגים 11; ב חלק מהחולים GA קשור עם ההתפתחות של alloantibodies תורם ספציפי אשר נקלטות על ידי EC שתל 16 אך הכלים להראות מעט עדויות של נמק fibrinoid שאופייני לדחיית נוגדן בתיווך 11 חריפה.
המרכיב הקריטי ביותר של פתוגנזה GA הואהתפשטות של תאים דמויי שריר חלק בתוך אינטימה, אם ניתן לעצור את התהליך הזה, GA סביר להתקדם. עבודות קודמת מהקבוצה שלנו הראו כי intimas של מגזרי עורקים הכליליים אדם התערב לaortae אינפרא הכליה של עכברי immunodeficient להרחיב בתגובה שהועברו adoptively תאי T אנושי אלוגניות לתורם העורק ושתהליך זה יכול להיות מעוכב על ידי נטרול האנושי IFN- γ 18. IFN-γ האנושי יתר אקסוגני עלול לגרום intimal (והמדיאלי) תא שריר חלק (VSMC) ריבוי כלי דם בשתלים עורקיים אלה בהיעדר תאי T האנושי 15, 17. (חשוב לציין כי אדם ועכבר IFN-γ לא חוצה מינים, פוסלי השפעות עקיפות על מארח העכבר במערכת הניסיונית הזה.) יש מודלים עכבריים אלו טובת משחזר תא T / אינטראקציות תא כלי דם אנושיים וintimal נגעים מורכבים במידה רבה של תאי אדם (כלומר שתל המופק),כפי שכבר ציין בדגימות קליניות, אבל הם לא לסכם את המצב הקליני באופן מלא משום שהם מתעלמים מתפקידו של מקרופאגים המארחים ואולי גם סוגי תאים אחרים מעורבים בנגעי השתלות קליניים. מודל עכבר רגיל של תהליך זה באופן תיאורטי יכול לטפל בבעיה זו, המשלימה את המגבלות של המודל האנושי על ידי מעורב מערכת חיסונית מארח שלמה ומתן יתרון נוסף המאפשר את כוחו של עכבר גנטי גישות שיחולו על GA. שני המודלים העכבר הנפוץ ביותר כרוכים בהשתלת לב ועורקי heterotopic orthotopic 1 השתלה. הנגעים המתפתחים בעורקים של לב heterotopic שתלים עשויים במידה רבה של תאים מארחים, העשויים ממוצא מח עצם, ואילו תאי intimal של העורקים בלב אדם שתלי הם בעיקר ממוצא שתל 5, 13, 19. זוהי הבחנה משמעותית שהובילה אותנו לפתח מודלים עכבר חלופיים. התערבותם שלאב העורקים עכבר מזן אחד לנמען זן עכבר אחר הוא עוד יותר מוגבל כמודל לדחייה כרונית בבני אדם, כי תגובת דחייה חריפה תא בתיווך במודל עכבר זה מבטל לחלוטין את כל תאי כלי הדם תורם הנגזרים מאת השתל בתוך שניים השלוש שבועות 19. כתוצאה מכך, השינויים שלאחר מכן ראו במגזר הכלי התערב הם אך ורק תגובה של תאי מארח שאכלסו מחדש את decellularized כלי הפיגום, יוצרת מצב artifactual ביותר של שייכות מוגבלת כמודל לשינויים בכלי שתל המתרחשים במרפאת. לאחרונה פיתחנו שני מודלים עכבר חדשים כדי לעקוף את הבעיות האלה 21. המודל הראשון כולל חציצה של קטע כלי מעכבר זכר לנקבת נמען של אותו הזן המולד (C57BL/6J). המודל השני כולל חציצת קטע עורק מתורם עכבר C57BL/6J סוג בר לעכבר שורה של אותו הזן ומין שחסר את receptor לIFN-γ (IFN-γR-KO) ואחריו ממשל של עכבר IFN-γ (מועבר באמצעות זיהום של כבד העכבר עם וקטור adenoviral. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים ואת היתרונות של דגמי GA העכבר שלנו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
שתל עכבר ומודל השתלת שתל syngeneic
כל המחקרים בבעלי החיים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים וועדות שימוש באוניברסיטת ייל. עבור דגם שתל, קטעים של אב העורקים החזי מזכר, 4-5 הישן WT שבוע (C57BL/6J) או עכברי IFN-γR ק.ו. היו התערב לאב העורקים בבטן של נמען נשי, WT 8-12 השבוע הישן באמצעות קצה ל סוף טכניקת microsurgical anastomotic (ראה הבא לפרטים נוספים). עבור דגם שתל syngeneic, קטעים של aortae בית החזה מעכברי זכרים, 4-5 בשבוע ישן WT היו התערב לaortae הבטן של זכר, 8-12 בשבוע ישן IFN-γR1-KO באמצעות טכניקת anastomotic microsurgical מקצה לקצה. בשבוע שלאחר ניתוח 1, החיות היו מחוסנת IV עם Ad5.CMV עכבר IFN-γ או Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) בשעה 10 9 PFU x 1. סרום עכבר IFN-γ הרמות נמדדו על ידי ELISA (eBioscience) בשעה 1 ו5 שבועות לאחר מתן אדנווירוס. חיות מסוימות קיבל BrdU(סיגמא אולדריץ ') ב 100 מ"ג / ק"ג SC עבור 2 שבועות לפני הקרבה.
מקצה לקצה טכניקת anastomotic microsurgical (וידאו יילקח לחלק זה):
1. נוהל תורם
- הרדימי את העכברים התורמים עם זריקות intraperitoneal של קטמין (50 מ"ג / ק"ג) וxylazine (10 מ"ג / ק"ג).
- לאחר שווידאת הרדמה נאותה, הנח את העכברים התורמים תחת מיקרוסקופ בהגדלה של X8-30 על מגש במצב שכיבה, ולהשתמש בפד Prep יוד והאלכוהול Prep פד להכנת קיר חזה.
- לחתוך את קיר החזה הקדמי דרך הצלעות והסרעפת כדי לחשוף את הלב.
- לפתוח את העלייה הימנית, להזריק 10 מ"ל של heparinized (100 U / מ"ל) תמיסת מלח לתוך החדר השמאלי כדי לשטוף את העכברים באמצעות מזרק 10 מ"ל עם מחט 25 מד.
- לכרות את הלב וריאות על מנת לחשוף את כל אורכו של אב העורקים החזי.
- לנתח את אב העורקים החזי בזהירות כדי למזער את הטראומה הישירה, whilהדואר לזהות, לקשור ולחלק את ענפי העץ באמצעות 11-0 תפר בסמוך לאב העורקים.
- ברגע שהאב העורקים החזי הוא חופשי מרקמות, אב העורקים החזי כל הבלו להשתלה.
- לשטוף את הקצוות של אב העורקים התורם עם תמיסת מלח heparinized (100 U / מ"ל), ולאחסן אותו באותו פתרון על קרח (HR עד 6) עד להשתלה.
2. נוהל נמען
- הזרק את עכברי הנמען עם ketoprofen IP (5 מ"ג / ק"ג) לשיכוך כאבים, וthenanesthetize העכברים עם קטמין IP (50 מ"ג / ק"ג) וxylazine (10 מ"ג / ק"ג). את עכברי הנמען הם הרדמה עמוקה בתוך 10 דקות למשך תקופה של 60-90 דקות. במהלך ניתוח, ברמה של הרדמה נבחנת בכל 15 דקות על ידי צובט את קיר הבטן הקדמי או רגל באמצעות מלקחיים. אם בעל החיים מגיבים לגירויים המזיקים בכל עת במהלך ניתוח, מנה נוספת של קטמין ו xylazine (1/4 או מינון מקורי 1/3) תנוהל על ידי SC או im
- לאחר שווידאת הרדמה נאותה, לגלח את הפרווה בדופן הבטן הקדמי באמצעות מכונת גילוח חשמלי, לנקות את העור באמצעות יוד Prep פד ופד Prep אלכוהול, לכסות את העיניים בשימוש במשחת עיניים. במהלך ניתוח, בטכניקות אספטיים הבאות תשמש לפעילות, כולל ניקוי שולחן ניתוחים עם 10% אקונומיקה, לובש כפפות סטריליות ושימוש במכשירי microsurgery מעוקרים (מכשירי קיטור מעוקרים לתחילת המבצע, זכוכית חמה אז חרוז מעוקר מכשירים בין פעולות מרובות, וכו ').
- מניחים את עכברי הנמען תחת מיקרוסקופ בהגדלה של X8-30 על מגש במצב שכיבה.
- לחתוך את דופן הבטן בקו האמצע מxyphoid לחיק, ולהפיץ את דופן הבטן בנפרד באמצעות מיקרו-מפשק כדי לחשוף את חלל הבטן.
- לחזור בו את המעיים superiorly ולעטוף עם גזה טבולה בתמיסת מלח. את עכברי הנמען להיות מקוררים על ידי אובדן של חימוםלא דרך מעיים המוחצנים. זה חשוב כדי לשמור על חום של בעלי חיים. עם זאת, לוח החימום לא נעשה שימוש במהלך הניתוח כהיפותרמיה צנועה היא תועלת במניעת פגיעה בעמוד השדרה בעת החסימה של זרימת דם אב העורקים וכן יש העברת חום יעילה עם זרימת דם נעדר למחצית התחתונה של גוף העכברים.
- להזיז את איברי הרבייה inferiorly, לעטוף את אזורי הבטן של עכברי נמען עם מי מלח-פתרון טבולה גזה, ולהשתמש בו כדי לחזור לפי הטבעת בצד ימין של הבטן. הרקמות החשופות מושקות מעת לעת עם תמיסת מלח במהלך ההשתלה.
- לנתח בוטות קטע של אב העורקים infrarenal בין כלי כליות proximally והסתעפות אב העורקים distally ולהיפרד מנחות וריד נבובה (IVC) בזהירות.
- לזהות ולקשור את כל הענפים הקטנים שמקורם בקטע זה של אב העורקים בבטן באמצעות 11-0 התפר monofilament פוליאמיד.
- לחצות מהדק הקטע הבודד שלאב העורקים bdominal באמצעות שני חבקי כלי דם סמיכות 5 מ"מ זה מזה, אחד בכל קצה.
- Transect אב העורקים בבטן בין מלחציים באמצעות מיקרו מספריים חדים כדי ליצור את אתרי anastomotic.
- לכרות קטע קטן של אב העורקים בבטן (עד 0.4 מ"מ באורך) מקצה אחד של חתך אב העורקים נמען transected כדי להכיל את השתל של אב העורקים התורם.
- לשטוף מגזרי אבי העורקים בין מלחציים באמצעות תמיסת מלח heparinized כדי להסיר את הדם שיורית. מגזרי אבי העורקים בין מלחציים ושתלו אב העורקים התורם מושקים מעת לעת עם פתרון heparinized (100 U / ml) מלוח (מ"ל / ק"ג עד 40) בזמן ההשקה.
- Transect שני הצדדים של אב העורקים תורם עם מיקרו מספריים חדים כדי ליצור שתל קטע של 2.5 מ"מ באורך להשתלה.
- מניחים את השתל של אב העורקים התורם בעמדת orthotopic, anastomose הקצה הפרוקסימלי והדיסטלי של שתל מתורם לסוף חתך פרוקסימלי ודיסטלי של הנמען של אב העורקים בבטן, בהתאמה, עם תום-Tדפוס O-end באמצעות 11-0 התפר monofilament פוליאמיד.
- לתפרים הרציפים, למקם את התפרים להישאר ב3 ו09:00 עמדות ראשית. בין שני תפרים להישאר בכל צד של שתל, anastomose שני קצוות לחתוך בתפרים 3-4 תוך שימוש בתפרים בריצה, ולקשור את התפרים פועלים כדי להישאר עם תפרי קשר כפול. מאחר ששתי השכבות של סגירה הן רציפה, את הסיכון של בקיעה הוא גדל. השתל של אב העורקים התורם צריך להיות באורך המתאים כדי להתחבר סוף חתך פרוקסימלי ודיסטלי של הנמען של אב העורקים בבטן.
- לתפרים, לבנות ארבע השקה ב 3 ו09:00 עמדות בשני הצדדים של שתל ראשית, וanastomose שני הקצוות לחתוך בתפרי 3-4 בין שני תפרים להישאר בכל צד של שתל.
- שחרר את מהדק דיסטלי כדי לאפשר את הזרימה מדרדר לתוך שתל, לזהות את האתרים המדממים ולעשות תפרים נוספים תוך 3 דקות.
- לאחר בירור hemostasis משביע רצון, לשחרר את המהדק הפרוקסימלי.
- לאשר את patency השתל על ידי נוכחות של פעימה נמרצת בשתל ובמגזר הצמוד הפרוקסימלי של אב העורקים בבטן האם, בפרט במגזר הצמוד הדיסטלי של אב העורקים בבטן ועורק mesenteric נחות. שקול פקקת באתרי anastomotic אם הפעימה לצמצם תוך כמה לאחר השיקום של זרימת דם דקות.
- להחזיר את המעיים לתוך חלל הבטן.
- תפר לסגור את דופן הבטן באמצעות תפר ניילון 5-0 בשכבת שריר ושכבת עור, בהתאמה.
- מניחים את עכברי הנמען לכלוב נקי בחלק העליון של כרית חימום, ולהמתין 1-2 שעות לעכברים להחזיר לעצמו את ההכרה ולהתאושש מהרדמה. זה חשוב כדי לשמור על חום מתאים בעלי החיים במהלך התאוששות. שמור על העכברים בכלוב החם ויבש לפני שבעקבות בעלי החיים מן ההרדמה.
- להעריך את התפקוד המוטורי של גפיים אחוריות אחרי עכברי התאוששות, ושוב ביום השני. ניתוח השתלה מוצלחת יאושרF לא חוסר תפקוד של גפיים אחוריות נצפה בעכברי נמען ביום השני.
- לנהל את עכברי נמען עם Ketoprofen במי שתייה (5 מ"ג / ק"ג / ד = 27 UG / מ"ל במי שתייה) עבור 48 שעות. אם כל עכברי נמען סובלים מכאבים בלתי פוסקים במשככי כאבים לאחר הניתוח על ידי כפי שמעידים על ידי אובדן של ניידות, אי חתן, נורמלי התכווץ יציבה, וכו ', הם יהיו מורדמים. בעלי החיים יהיו בסופו של דבר מורדמים נקודות מוגדרות מראש לאחר 1-60 ימים.
ניתוח שתל
שתלי עורק בשתל שהשיגו ב 4 שבועות ושתלים במודל שתל syngeneic היו 6 שבועות לאחר הניתוח (5 שבועות לאחר זיהום ויראלי) ונותחו על ידי טכניקות היסטולוגית סטנדרטיות עבור מכתים Elastica ואן Gieson (EVG), hematoxylin ו eosin (HE) מכתים ומכתים immunofluorescence. תמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ מערכת immunofluorescence (Zeiss). ספירת תאים של גרעינים מוקפות immunostaining החיובי הייתה לבצעאד בהגדלה גבוהה ועמדו בממוצע בין 5 חתכים לכל שתל. את המדידות באזור השתל של לומן (בתוך האנדותל), אינטימה (בין lamina אלסטי האנדותל והפנימי, IEL), התקשורת (בין IEL וlamina אלסטי החיצוני, צלופח), עובי קיר (בין lamina אלסטי האנדותל והחיצוני) וכל כלי (בתוך את הצלופח) חושבו מתוך 5 חתכים סדרתיים, 150 מיקרומטר בנפרד עבור כל שתל, תוך שימוש בניתוח תמונה ממוחשב וNIH תמונה 1.60 (http://rsbweb.nih.gov/nih-image).
ניתוח סטטיסטי
כל הנתונים מבוטאים כממוצע ± SEM. שני זנב-, בדיקות t מזווגות וניתוח ANOVA דו כיוונית בוצעו באמצעות תוכנת פריזמה (תוכנת GraphPad). חילוקי דעות עם P <0.05 נחשבו למצביעות על מובהקות סטטיסטיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מודל טרשת עורקים שתל עכבר (GA): במודל זה, אב העורקים תורם גברי הושתלו נשי נמען, כך שהמארח גורם לתגובות alloimmune מתווכות תאי T alloreactive נגד האנטיגן Y קטין (HY אנטיגן histocompatibility קטין זכר הספציפי) הביע על 12 שתל, והוא בתור תא T-IFN-γ מיוצר כונני VSMC התפשטות 20 כפי שנצפה במודלים של השתלת שתל אחרים 2, 6, 8-10, 14. קטע של אב העורקים החזי מזכר תורם התערב בניתוח לתוך אב העורקים בבטן של נמען נשי, וaortas נקצרו ב4 שבועות לאחר ההשתלה (איור 1 א). ניתוח היסטולוגית של שתלי עורקים בוצע על ידי ואן Elastica Gieson (EVG), H & E וimmunostaining עם SMA סמן VSMC וסמן הפאן יקוציט CD45. אין דחיית שתל נצפתה בין עכברי זכרי C57BL/6J בהשתלת האאורטה. זכר לנקבה transplantatיון המושרה GA, המתאפיין בחדירה של לויקוציטים והיווצרות neointima עם הצטברות של VSMC (איור 1). כדי לקבוע את תפקידו של IFN-γ האיתות בGA, aortas מעכברי WT או IFN-γR-KO הושתלו לנקבה נמען WT. מחיקה של IFN-γR בשתלים תורמים הציגה חדירה מופחתת של כדוריות דם לבנות והיווצרות neointima עם ירידות של תאי SMA חיוביים בהשוואה לWT (לא מוצג). תוצאות אלו תומכות תפקיד קריטי לIFN-γ איתות בהתקדמות GA כפי שנצפה בעבר בעכבר אנושי xenograft השתלה 4 מודל, 15, 17, 18.
טרשת עורקים שתל-Induced γ IFN: זה כבר נקבע, כי IFN-γalone די בכך כדי לגרום להיווצרות neointima בעכבר אנושי GA 15, מודל 17. כאן הקמנו מודל שתל syngeneic עכבר IFN-γ בתיווך טרשת עורקים. במודל זה, aortas הגברים WT הושתלולעכברים נמען IFN-γR מחסר אחרי הזרקה לוריד של כפול המחסר אדנווירוס קידוד עכבר IFN-γ transgene (Ad-IFN-γ) או שליטת LacZ הגן (Ad-LacZ) (איור 2 א). דלקת כבד וכבד ביטוי transgene של Ad-LacZ אומת על ידי צביעת X-gal בקבוצת Ad-LacZ אבל לא AD-IFN-γ קבוצות כפי שתוארו לעיל 17. ביטוי מערכתי של IFN-γ בסרום זוהה ברמה של 120-150 ng / ml ביום 3 ונשמר עד 5 שבועות בAd-IFN-γ, אך לא בקבוצת LacZ. Aortas נקצרו ב5 שבועות לאחר ההזרקה של אדנווירוס לניתוח היסטולוגית והערכת morphometric של עורק השתל אינטימה, מדיה, לום ואזור כלי שיט. ביטוי של IFN-γ, אבל לא LacZ שליטה, היווצרות neointimal מושרה. אין חדירה ברורה של לויקוציטים זוהתה בהשוואה למודל השתל (איור 2). נתונים אלה עולים בקנה אחד עם הקודמתתצפיות במודל עכבר האנושי של xenograft כי IFN-γ בלבד מספיק כדי לגרום להיווצרות neointima 15, 17.
איור 1. איור וערכה של מודל עורק שתל עכבר השתלה. א איור של הליך השתלת השתל. קטע של אב העורקים החזי זכר תורם התערב בניתוח לתוך אב העורקים בבטן בנקבת נמען. Aortas נקצרו ב4 שבועות לאחר השתלה. כמו שליטה, קטע של אב העורקים החזי תורם הגברי היה התערב בניתוח לתוך אב העורקים בבטן בנמען גברי. ב '. ניתוח היסטולוגית של שתלי עורק על ידי Elastica ואן Gieson (EVG), H & E וimmunostaining עם אנטי-SMA ואנטי CD45. Photomicrographs הנציג מוצג. ראשי החץ לסמן lamina אלסטי הפנימי להתוות אינטימה מתקשורת. סולםבר: 50 מ"מ. לא טרשת עורקים שתל נצפתה בזכר לקבוצת גברים.
איור 2. מודל IFN-γ-Induced עכבר syngeneic עורק השתלה. א 'ערכה של מודל syngeneic עכבר IFN-γ-המושרה. עורק חזה תורם זכר היה גזור והושתל אב העורקים בבטן בעכברי נמען גברי IFN-γR קו. ניתוח שלאחר שבוע אחד, 1x10 9 pfu Ad-mIFN-γ או Ad-LacZ הוזרק לעכברים נמען באמצעות וריד הצוואר. הסרום נאסף ב -3 ביום, 7 ו -35 לאחר ההזרקה של וירוסים לIFN-γ מדידה. שתלי נקצרו 6 שבועות להערכת morphometric. ב '. ניתוח היסטולוגית של שתלי עורק על ידי immunostaining עם אנטי-SMA ואנטי CD45. Photomicrographs הנציג מוצג. ראשי החץ לסמן lamina אלסטי הפנימי להתוות אינטימה מתקשורת. היקף בAR: 50 מ"מ. לא טרשת עורקים שתל נצפתה בקבוצת LacZ.
| שלב | בעיה | סיבה אפשרית | פתרון |
| 2.17 | דימום חמור | הפער (מרחק בין שני תפרים) הוא גדול מדי, במיוחד של תפרים. | המרחק בין כל שני תפרים צריך להיות אחיד במהלך השקה. הוסף תפר אחד בדימום אתר. |
| רק adventitia הוא תפור. | זיהוי ותופר את כל קיר אב העורקים | ||
| ענפי עצי unligated | Ligating ענפי העצים | ||
| שימוש רב מדי הפרין | באמצעות עד 40 מ"ל / ק"ג heparinized (100 U / מ"ל) תמיסת מלח כדי להשקות את שדה הניתוח בזמן ההשקה. | ||
| 2.19 | פקקת | לומן הוא צר מדי באתר anastomotic, בפרט של תפרים רציפים. | הימנע anastomosing מדי קיר אב העורקים בכל תפר. גודל אב העורקים של עכבר הוא קטן מאוד. לתפר קיר אב העורקים רבים מדי במהלך ההשקה יגרום ללום צר ופקק, עם זאת, לתפר קיר מדי פחות אב העורקים יגרום לדימום חמור. |
| לעבור התפר דרך קיר אב העורקים בצד הנגדי. | זיהוי קיר אב העורקים ולאחר מכן ביצוע תפרים. אם זה קרה, המפעיל צריך לנתק את קשר התפר ותפר מחדש באתר זה. | ||
| תאי האנדותל נפגעו במהלך השקה. | שימוש בתפרים להישאר להשקה. אל תחזיק / לסחוט את הקיר כולו על ידי לaroticCeps להשקה. | ||
| הפרין לא נעשה שימוש במהלך השקה. | גודל אב העורקים של עכבר הוא קטן מאוד. זה קל מאוד להיווצרות פקקת בשתלים לאחר השקה. מתן הפרין להשקות את שדה הניתוח הוא חשוב מאוד לצמצום פקקת. שיעור ההצלחה של השתלת כלי בעכברים הוא סביב 50% ללא שימוש בפרין ו95-100% בשימוש בפרין. אם פקקת נמצא בתוך כמה דקות לאחר השיקום של זרימת דם, גישה חלופית להסרת פקקת הוא להזריק תמיסת מלח 30-50 ul heparinied (100 U / ml) באמצעות חברת המחקר IVC. אין להזריק יותר מדי הפרין רק במקרה של דימום חמור. | ||
| 2.23 | ההשתלה נכשלה | דימום מתעכב ופקק, או לאחרים | השתלת הכלי בעכברים היא ניתוח קשה מאוד לאב העורקים בגודל של עכבר הוא קטן מאוד. ישנם שלוש פוי מפתחNTS לניתוח המוצלח: 1) לוודא שקירות אבי העורקים של מארח ותורם הם anastomosed יחד ללא ספק פער, רק במקרה של דימום חמור, 2) לשמור על מרחב לומן מספיק באתר anastomotic, רק במקרה של פקקת; 3) להשתמש הפרין במינון נכון בזמן ההשקה, רק במקרה של פקקת ודימום חמור. בעקבות פרוטוקול זה, שיעור ההצלחה של המחבר הוא יותר מ -95%. |
טבלת מס '1. פתרון בעיות שולחן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקולים שתוארו מתמקדים בדגמי GA עכבר. ניתן ליישם את הנהלים לדגמי השתלת שתל אחרים. מודלים אלה כוללים xenograft האנושי (מקטעי עורקים הכליליים כלומר אדם התערב לaortae אינפרא הכליה של עכברי immunodeficient), ודגם GA עכבר דחייה חריף (כלומר אב העורקים עכבר מזן גנטי אחד לנמען אחר זן גנטי). המודלים העכבר שתוארו שלנו הם יותר כדי לסגור נגעי GA אדם. המודל הראשון כולל חציצה של קטע כלי מעכבר זכר לנקבת נמען של אותו הזן המולד (C57BL/6J). דחיית שתל במקרה זה מופנה רק נגד אנטיגנים histocompatibility קלים המקודדים על ידי כרומוזום Y (בהווה בזכר אך לא נקבה) ותגובת הדחייה שמתפתחת הוא עצל במידה מספקת כדי לשמר הנגזרות תורמות תאי שריר חלק למספר 2 שבועות, 6 , 8-10, 12, 14. המודל השני כולל חציצת segme עורקNT מתורם עכבר C57BL/6J סוג בר לעכבר שורה של אותו הזן ומין שחסר את הקולטן לIFN-γ (IFN-γR-KO) ואחריו ממשל של עכבר IFN-γ (מועבר באמצעות זיהום של העכבר כבד עם וקטור adenoviral.) אין דחייה במקרה זה כמו גם תורם ועכברי נמען הם מאותו הזן והמין, אך תאי שריר חלק תורם להתרבות בתגובה לציטוקינים ואילו מארח שמקורם בתאים, חסרי קולטן לציטוקין זה, לא מגיבים 21. יתר על כן, על ידי backcrossing שינויים גנטיים נוספים לתורם הכלי, ניתן להשתמש בשני המודלים כדי להעריך את ההשפעה של גנים ספציפיים על התפשטות IFN-γ מונע חלקה תא שריר והתקדמות GA.
התפקיד של IFN-γ בדגמי GA עכבר לא הוכח היטב. שני המודלים העכבר שלנו אימתו את התפקיד של IFN-γ בעכבר GA. במודל הראשון, אב העורקים תורם גברי הושתלו נשי נמעןכך המארח גורם לתגובות alloimmune מתווכות תאי T alloreactive כנגד אנטיגן HY histocompatibility קטין זכר הספציפי הביע על השתלים 12. ואכן, זכר (C57BL/6J) WT לC57BL/6J הנשי ההשתלה המושרית GA, המתאפיין בחדירה של לויקוציטים והיווצרות neointima עם הצטברות VSMC. לעומת זאת, זכר להשתלת אב העורקים גברי לא לגרום GA. אנחנו נקבע את התפקיד של IFN-γ איתות בתאי כלי דם באמצעות IFN-γR-KO כתורם הושתל שתל לנקבה נמען WT. מחיקה של IFN-γR בשתלים תורמים הקהתה חדירת יקוציט וצבירת VSMC בneointima. לכן, תפקידה של IFN-γ במודל העכבר הנוכחי עולה בקנה אחד עם מודל העכבר האנושי של השתלת xenograft בי IFN-γ איתות בשתל היא קריטית להתקדמות GA 4, 15, 17, 18. אנחנו נקבע אם IFN-γ בלבד מספיק כדי לגרום להיווצרות neointima על ידי יצירת IFN-γ-Mediמודל ated עכבר syngeneic שתל טרשת עורקים. במודל זה, אב העורקים גבריים הושתלו חיה IFN-γR-KO נמען גברית שבו עכבר IFN-γ לאחר מכן הביע מערכתי בזריקה לוריד של אדנווירוס הכפול מחסר קידוד עכבר IFN-γ transgene (Ad-IFN-γ ). הבחנו שביטוי של IFN-γ, אבל לא LacZ שליטה, היווצרות neointimal מושרה. במודל זה, אין חדירה ברורה של לויקוציטים הוא זוהה בהשוואה למודל השתל, עולה בקנה אחד עם התצפיות הקודמות במודל עכבר השתלת עורק-SCID אנושי שבה כלי דם IFN-γ האיתות בלבד מספיקה כדי לגרום להיווצרות neointima בהיעדרו של לויקוציטים 15, 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לנו מה למסור.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקי R01 HL109420 לWM וAHA 9320033N לLY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks) |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml) |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml) |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml) |
| Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride) | CareFusion | AL4109 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | To prepare the anesthetic |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Microscope | Leica | MZ95 | |
| Micro Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5693 | |
| Spring Scissors | F.S.T | 15009-08 | To transect the aorta of donor or recipient |
| Extra Narrow Scissors | F.S.T | 14088-10 | |
| Needle Holder/Forceps | MICRINS | MI1542 | To hold the needle |
| Fine Forceps | F.S.T | 11254-20 | |
| Forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Forceps | F.S.T | 13011-12 | |
| LANCASTER Eye Speculum | Zepf Medical Instruments | 42-1209-07 | |
| Micro Vascular Clip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6472 | |
| Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5440 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture | AROSurgical Instruments Corporation | Cat #T4A10Q07 | 10-0 suture, Needle=70 microns |
| Black Monofilament Nylon Suture | Syneture (Covidien) |
SN-1956 | 6-0 suture |
| Non-Woven Songes | McKesson Corp. | Reorder No. 94442000 | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | REF 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 18G 1 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305196 | |
| 25G 7/8, Hypodermic Needle | BD | REF 305124 | |
| 27G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305109 | |
| 30G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305106 | |
| Hearting Pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
- George, J. F., Pinderski, L. J., Litovsky, S., Kirklin, J. K. Of mice and men: mouse models and the molecular mechanisms of post-transplant coronary artery disease. J. Heart Lung Transplant. 24, 2003-2014 (2005).
- Koulack, J., McAlister, V. C., MacAulay, M. A., Bitter-Suermann, H., MacDonald, A. S., Lee, T. D. Importance of minor histocompatibility antigens in the development of allograft arteriosclerosis. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 273-277 (1996).
- Libby, P., Pober, J. S.
- Lorber, M. I., Wilson, J. H., Robert, M. E., Schechner, J. S., Kirkiles, N., Qian, H. Y., Askenase, P. W., Tellides, G., Pober, J. S. Human allogeneic vascular rejection after arterial transplantation and peripheral lymphoid reconstitution in severe combined immunodeficient mice. Transplantation. 67, 897-903 (1999).
- Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
- Mitchell, R. N.
- Mitchell, R. N. Graft vascular disease: immune response meets the vessel wall. Annu Rev Pathol. 4, 19-47 (2009).
- Nagano, H., Libby, P., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Stinn, J. L., Becker, G., Tilney, N. L., Mitchell, R. N. Coronary arteriosclerosis after T-cell-mediated injury in transplanted mouse hearts: role of interferon-gamma. Am. J. Pathol. 152, 1187-1197 (1998).
- Nagano, H., Mitchell, R. N., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Tilney, N. L., Libby, P. Interferon-gamma deficiency prevents coronary arteriosclerosis but not myocardial rejection in transplanted mouse hearts. J. Clin. Invest. 100, 550-557 (1997).
- Raisanen-Sokolowski, A., Glysing-Jensen, T., Koglin, J., Russell, M. E. Reduced transplant arteriosclerosis in murine cardiac allografts placed in interferon-gamma knockout recipients. Am. J. Pathol. 152, 359-365 (1998).
- Salomon, R. N., Hughes, C. C. W., Schoen, F. J., Payne, D. D., Pober, J. S., Libby, P. Human Coronary Transplantation-Associated Arteriosclerosis - Evidence for a Chronic Immune Reaction to Activated Graft Endothelial Cells. Am. J. Pathol. 138, 791-798 (1991).
- Scott, D. M., Ehrmann, I. E., Ellis, P. S., Chandler, P. R., Simpson, E. Why do some females reject males? The molecular basis for male-specific graft rejection. J. Mol. Med. 75, 103-114 (1997).
- Shimizu, K., Sugiyama, S., Aikawa, M., Fukumoto, Y., Rabkin, E., Libby, P., Mitchell, R. N. Host bone-marrow cells are a source of donor intimal smooth- muscle-like cells in murine aortic transplant arteriopathy. Nat. Med. 7, 738-741 (2001).
- Tellides, G., Pober, J. S.
- Tellides, G., Tereb, D. A., Kirkiles-Smith, N. C., Kim, R. W., Wilson, J. H., Schechner, J. S., Lorber, M. I., Pober, J. S. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
- Vassalli, G., Gallino, A., Weis, M., von Scheidt, W., Kappenberger, L., von Segesser, L. K., Goy, J. J. Alloimmunity and nonimmunologic risk factors in cardiac allograft vasculopathy. Eur. Heart J. 24, 1180-1188 (2003).
- Wang, Y., Bai, Y., Qin, L., Zhang, P., Yi, T., Teesdale, S. A., Zhao, L., Pober, J. S., Tellides, G. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ. Res. 101, 560-569 (2007).
- Wang, Y., Burns, W. R., Tang, P. C., Yi, T., Schechner, J. S., Zerwes, H. G., Sessa, W. C., Lorber, M. I., Pober, J. S., Tellides, G. Interferon-gamma plays a nonredundant role in mediating T cell-dependent outward vascular remodeling of allogeneic human coronary arteries. Faseb J. 18, 606-608 (2004).
- Yacoub-Youssef, H., Marcheix, B., Calise, D., Thiers, J. C., Benoist, H., Blaes, N., Segui, B., Dambrin, C., Thomsen, M. Chronic vascular rejection: histologic comparison between two murine experimental models. Transplant. Proc. 37, 2886-2887 (2005).
- Yokota, T., Shimokado, K., Kosaka, C., Sasaguri, T., Masuda, J., Ogata, J. Mitogenic activity of interferon gamma on growth-arrested human vascular smooth muscle cells. Arterioscler. Thromb. 12, 1393-1401 (1992).
- Yu, L., Qin, L., Zhang, H., He, Y., Chen, H., Pober, J., Tellides, G., Min, W. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting IFN-γ-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Cir. Res. 109, 418-427 (2011).
