Summary
Wir beschreiben Protokolle für unseren Maus Transplantat arteriosclerois (GA)-Modelle, die unter Zwischenschaltung einer Maus Gefäßsegmentes beinhalten in einen Empfänger des gleichen Inzuchtstammes. Durch Rückkreuzen zusätzliche genetische Veränderungen in den Behälter Spender kann das Modell beurteilen die Wirkung bestimmter Gene auf GA.
Abstract
Graft arteriosclerois (GA), auch genannt Transplantatvaskulopathie, ist eine pathologische Läsion, die über Monate bis Jahre in transplantierten Organen durch diffuse, umlaufende Stenose des gesamten Transplantat Gefäßbaum dadurch entwickelt. Die wichtigste Komponente ist die Pathogenese GA Proliferation von glatten Muskelzellen-ähnlichen Zellen in der Intima. Wenn ein menschlicher Koronararterien-Segment in die infra-renale Aorta von immundefizienten Mäusen eingefügt ist, könnten die Intimas in Reaktion auf adoptiv übertragen humanen T-Zellen allogen der Arterie Spender oder exogenen humanen IFN-γ in Abwesenheit von humanen T-Zellen. Werden erweitern Zwischenschaltung einer Maus Aorta von einem Stamm in eine andere Maus-Stamm Empfänger als Modell für chronischen Abstoßung bei Menschen beschränkt, da die akute zellvermittelte Abstoßungsreaktion in diesem Mausmodell vollständig eliminiert alle Spender stammenden vaskulären Zellen des Transplantates in zwei bis drei Wochen. Wir haben vor kurzem zwei neue m entwickeltOUSE Modelle, um diese Probleme zu umgehen. Das erste Modell beinhaltet Zwischenschaltung eines Schiffes Segment aus einer männlichen Maus in einen weiblichen Empfänger der gleichen Inzuchtstammes (C57BL/6J). Transplantat-Abstoßung in diesem Fall werden nur gegen Nebenhistokompatibilitätsantigene von dem Y-Chromosom (in der männlichen, nicht aber die weiblich) und der Abstoßungsreaktion dass ausreichend träge spenderabhängig abgeleitet glatten Muskelzellen für mehrere Wochen erhalten erfolgt kodiert ist. Das zweite Modell beinhaltet Anordnen einer Arterie Segment von einer Wildtyp-Maus C57BL/6J Spender in einen Wirt Maus des gleichen Stammes und Geschlechts, die den Rezeptor für fehlt IFN-γ durch Verabreichung gefolgt Maus IFN-γ (geliefert durch Infektion der Maus Leber mit einem adenoviralen Vektor. Es gibt keine Ablehnung in diesem Fall als Spender und Empfänger Mäuse des gleichen Stammes und Geschlecht, sondern Spender glatten Muskelzellen proliferieren als Reaktion auf die Zytokin während host-abgeleiteten Zellen fehlt Rezeptor fürdieses Zytokin, sind nicht mehr reagiert. Durch Rückkreuzung zusätzliche genetische Veränderungen in den Behälter Spender können beide Modelle verwendet werden, um die Wirkung von spezifischen Genen auf GA Verlauf zu beurteilen. Hier beschreiben wir ausführliche Protokolle für unsere Maus GA-Modelle.
Introduction
Graft arteriosclerois (GA), die auch als Transplantatvaskulopathie, eine pathologische Läsion, die über Monate bis Jahre in transplantierten Organen, die durch diffuse umlaufende Stenose der gesamte Pfropfcopolymerisat Gefäßbaumes 7, dadurch entwickelt. Frühe Stadien kann exzentrisch und fokale Stenosen, die mehr offensichtlich sind in den Arterien, also mehr ähnelt Stenosen in konventionellen Atherosklerose gesehen. Das Lumen Verlust der Transplantatgefäße Ergebnisse Intima Ausdehnung durch Infiltration von Wirts-T-Zellen und Makrophagen, insbesondere die Ansammlung von extrazellulärer Matrix und glatte Muskulatur-ähnlichen Zellen stammten aus Transplantat Host oder beide 5, 13, 19, die unzureichend kompensiert wird durch äußere Gefäß Umbau. In Herz-Transplantate sind die meisten klinisch relevanten Veränderungen, die in den epikardialen und intramyokardialen Koronararterien. Letztlich wird GA der Herzkranzgefäße führen ischämischer Herzinsuffizienz. GA ist die Hauptursache für Herz-spät grachtern Verlust. Die Stenosen GA an den Nahtlinien zu stoppen, stark verwickelt den Host als Antwort auf Alloantigene Transplantat in der Pathogenese und uns dazu GA als eine Form der chronischen Abstoßung 3 einzuordnen. Jedoch können auch andere Formen der arteriellen Verletzung erhöhen das Risiko von GA, entweder durch die Erhöhung der Netto-Belastung durch Verletzungen oder durch Intensivierung und / oder Modulation der alloimmune Antwort. Die Endothelzellen (EC) Auskleidung der Arterien Transplantat wird in menschlichen GA erhalten, und die meisten oberflächlichen Regionen der Intima neben dem EG-Futter ist der Standort am stärksten von host-IFN-γ abgeleiteten-produzierende T-Zellen und Makrophagen infiltriert 11; in Einige Patienten GA mit der Entwicklung von Donor-spezifische Alloantikörper, die Transplantat EC 16 aber die Gefäße binden zugeordnete zeigen wenig Beweise für die fibrinoid Nekrose, die charakteristisch für akute Antikörper-vermittelten Abstoßung 11 ist.
Die wichtigste Komponente ist die GA PathogeneseProliferation von glatten Muskelzellen, wie Zellen in der Intima, wenn dieser Prozess arretiert werden kann, ist unwahrscheinlich, GA voran. Frühere Arbeiten aus unserer Gruppe hatten gezeigt, dass Intimas der menschlichen koronaren Segmente in der Infrarot-renalen Aorten von immungeschwächten Mäusen in Reaktion auf adoptiv übertragen humanen T-Zellen allogene der Arterie Spender und dass dieser Prozess erweitern zwischengeschaltet könnte durch Neutralisieren menschlichen gehemmt werden IFN- γ 18. Weiterhin exogenen humanen IFN-γ könnte Intima (und medial) glatten Gefäßmuskelzellen (VSMC)-Proliferation in diesen arteriellen Grafts in Abwesenheit von humanen T-Zellen 15, 17. (Es ist wichtig zu beachten, dass Mensch und Maus IFN-γ nicht überqueren Spezies auszuschließen indirekte Auswirkungen auf die Mäusewirt in diesem experimentellen System.) Diese humanisierten Mausmodellen haben den Vorteil, rekapituliert humanen T-Zell / vaskuläre Zell-Interaktionen und die Intima Läsionen weitgehend von menschlichen (zB Transplantat-derived) Zellen,wie in klinischen Proben beobachtet, aber nicht vollständig zusammenzufassen die klinische Situation, weil sie die Rolle der Host Makrophagen und möglicherweise anderen Zelltypen in organspenderelevante Läsionen beteiligt ignorieren. Eine herkömmliche Maus-Modell des Prozesses könnte theoretisch dieses Problem anzugehen, ergänzen die Grenzen des humanisierten Modell für einen vollständigen Immunsystem des Wirts und die Bereitstellung der zusätzliche Vorteil, dass die Kraft der Maus genetische Methoden angewendet werden, um Ga. Die beiden am häufigsten verwendeten Mausmodelle beinhalten heterotope Herztransplantation und orthotopen Transplantation 1 Arterie. Die Läsionen, die in den Arterien heterotoper Herztransplantate entwickeln werden weitgehend von Wirtszellen, wahrscheinlich von Knochenmark Ursprungs, während Intimazellen der Arterien im menschlichen Herzen Transplantate überwiegend von Transplantat Ursprung 5, 13, 19. Dies ist ein wesentlicher Unterschied, der führte uns zu alternativen Mausmodelle entwickeln hat. Zwischenschaltungeine Maus Aorta von einem Stamm in eine andere Maus-Stamm Empfänger ist noch geringer als Modell für chronischen Abstoßung bei Menschen, da das Zell-vermittelten akuten Abstoßungsreaktion in diesem Mausmodell vollständig eliminiert alle Spender stammenden vaskulären Zellen des Transplantates in zwei bis drei 19 Wochen. Demzufolge sind die nachfolgenden Änderungen in der dazwischen Gefäßsegment gesehen nur eine Antwort von Wirtszellen, die das Gefäß dezellularisierte Gerüst neu besiedelt haben, wodurch eine sehr artifactual Situation von begrenzter Bedeutung als Modell für die Veränderungen im Transplantat Schiffe, die in der Klinik auftreten. Wir haben vor kurzem zwei neue Mausmodelle entwickelt, um diese Probleme zu umgehen 21. Das erste Modell beinhaltet Zwischenschaltung eines Schiffes Segment aus einer männlichen Maus in einen weiblichen Empfänger der gleichen Inzuchtstammes (C57BL/6J). Das zweite Modell beinhaltet Zwischenschaltung einer Arterie Ausschnitt aus einem Wildtyp C57BL/6J Maus Spender in einem Host-Maus des gleichen Stammes und Geschlechts, die rec fehlteptor für IFN-γ (IFN-&ggr; R-KO) durch die Verabreichung von Maus gefolgt IFN-γ (geliefert über Infektion der Leber der Maus mit einem adenoviralen Vektor. Hier beschreiben wir detaillierte Protokolle und die Vorteile unserer Maus GA-Modelle.
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Protocol
Maus und allogenen Transplantats syngene Transplantationsmodell
Alle Tierversuche wurden von der institutionellen Pflege der Tiere und die Verwendung Ausschüsse der Yale-Universität genehmigt. Für Allograft Modell wurden Segmente der Aorta von männlichen, 4-5 Wochen alten WT (C57BL/6J) oder IFN-&ggr; R-KO-Mäusen in der Bauchaorta der weiblichen Empfänger, 8-12 Wochen alten WT zwischengeschaltet mit eine End-to -Ende mikrochirurgischen Anastomosentechnik (siehe nächste für Details). Für syngene Transplantat Modell Segmente der Brust-Aorten von männlichen, 4-5 Wochen alten WT-Mäusen in die Bauchhöhle Aorten von männlichen eingefügt wurden, 8-12 Wochen alte IFN-γR1-KO mit einer End-to-End-mikrochirurgischen Anastomosentechnik. Nach 1 Woche postoperativ wurden die Tiere mit iv Ad5.CMV-Maus-IFN-γ oder Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) geimpft bei 1 x 10 9 PFU. Serum Maus-IFN-γ wurden durch ELISA (eBioscience) gemessen bei 1 und 5 Wochen nach Adenovirus-Verabreichung. Bestimmte Tiere erhielten BrdU(Sigma-Aldrich) bei 100 mg / kg sc für 2 Wochen vor der Tötung.
End-to-End-mikrochirurgischen Anastomosentechnik (Video wird für diesen Teil genommen werden):
1. Donor Vorgehensweise
- Anesthetize der Donor-Mäusen mit intraperitonealen Injektionen von Ketamin (50 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg).
- Nachdem sichergestellt wurde, eine adäquate Anästhesie, legen Sie die Donormäusen unter dem Operationsmikroskop an X8-30 Vergrößerung auf einem Tablett in Rückenlage, und verwenden Jod Prep Pad und Alcohol Prep Pad für Brustwand Vorbereitung.
- Inzision der vorderen Brustwand über den Rippen und der Membran, um das Herz freizulegen.
- Öffne das rechte Atrium injizieren 10 ml heparinisiertes (100 U / ml) Kochsalzlösung in die linke Herzkammer, um die Mäuse mit einer 10-ml-Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel zu spülen.
- Resezieren das Herz und die Lungen über die gesamte Länge der Aorta freizulegen.
- Präparieren Sie die Aorta sorgfältig, um die direkte Gewalteinwirkung, whil minimierene identifizieren, abzubinden und teilen die Holz Äste mit 11-0 Naht in der Nähe der Aorta.
- Sobald der Aorta ist frei von umgebenden Gewebe, Verbrauchsteuern die ganze Aorta zur Transplantation.
- Spülen Sie das abgeschnittene Ende des Spenders Aorta mit Heparin (100 U / ml) Kochsalzlösung, und bewahren Sie sie in der gleichen Lösung auf Eis (bis 6 Stunden) bis zur Transplantation.
2. Empfänger Vorgehensweise
- Injizieren Sie den Empfänger Mäuse mit ip Ketoprofen (5 mg / kg) zur Analgesie und thenanesthetize die Mäuse ip mit Ketamin (50 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). Die Empfänger-Mäuse sind tief narkotisierten innerhalb von 10 Minuten für eine Dauer von 60-90 min. Während der Operation wird der Pegel der Anästhesie alle 15 min durch Einklemmen des vorderen Bauchwand oder Fuß mit einer Pinzette beurteilt. Wenn das Tier reagiert auf die Schmerzreize jederzeit während der Operation, wird eine zusätzliche Dosis von Ketamin und Xylazin (1/4 oder 1/3 ursprünglichen Dosis) von sc oder im verabreicht werden
- Nachdem sichergestellt wurde, eine adäquate Anästhesie, abrasieren das Fell in der vorderen Bauchwand mit einem elektrischen Rasierer, reinigen Sie die Haut mit Jod Prep Pad und Alkohol Prep Pad, decken Sie die Augen mit Augensalbe. Während der Operation werden die folgenden aseptische Techniken für die Operationen, einschließlich der Reinigung des OP-Tisch mit 10% Bleichmittel, sterile Handschuhe und mit sterilisierten Instrumente Mikrochirurgie (Dampf-sterilisierten Instrumente für den Beginn der Operation, dann heiß Glasperle sterilisiert werden Instrumente zwischen mehreren Operationen, etc.).
- Legen Sie die Empfänger-Mäusen unter dem Operationsmikroskop bei einer Vergrößerung von X8-30 auf einem Tablett in Rückenlage.
- Inzision der Bauchdecke an der Mittellinie von Xyphoid auf Schambein, und die Ausbreitung der Bauchdecke auseinander mit einem Mikro-Retraktor die Bauchhöhle aussetzen.
- Klappen Sie den Darm superior und wickeln mit Gaze angefeuchtet mit Kochsalzlösung. Die Empfängermäuse geworden durch den Verlust von hea gekühltt durch ausgelagerten Darm. Es ist wichtig, tierischen Wärme aufrechtzuerhalten. Allerdings ist die Heizplatte nicht während der Operation verwendet als bescheiden Hypothermie ist der Vorteil bei der Verhinderung von Rückenmarksverletzungen beim Verschluss von Aorten Blutfluss wie dort ist ineffizient Wärmeübertragung mit fehlender Durchblutung der unteren Hälfte der Mäuse Körper.
- Bewegen Sie die Fortpflanzungsorgane inferior, wickeln Sie die Bauch Bereichen Empfängermäuse mit Kochsalzlösung-Lösung befeuchteten Gaze, und es verwenden, um das Rektum zu rechten Seite des Bauches zurückzuziehen. Die freiliegenden Gewebe werden in regelmäßigen Abständen mit einer Salzlösung während der Transplantation bewässert.
- Dissect unverblümt ein Segment infrarenalen Aorta zwischen der renalen Gefäß proximal und distal Aortenbifurkation und getrennt von der unteren Hohlvene (IVC) sorgfältig.
- Identifizieren und abzubinden all der kleinen Zweige, die aus diesem Segment der Bauchaorta mit 11-0 Polyamid Monofilamentnahtmaterial.
- Kreuzklemme das isolierte Segment einbdominal Aorta mit zwei Gefäßklemmen ungefähr 5 mm auseinander, einer an jedem Ende.
- Transekt die Bauchaorta zwischen den Klemmen mit scharfen Mikro-Schere, um die Anastomosen erstellen.
- Resezieren ein kleines Segment der Aorta abdominalis (bis zu 0,4 mm in der Länge) von einem abgeschnittenen Ende der durchtrennten Aorta Empfänger, den Spender Aortentransplantat unterzubringen.
- Spülen Sie die Aortasegmente zwischen den Klemmen mit Heparin Kochsalzlösung, um das restliche Blut zu entfernen. Die Aortasegmente zwischen den Klemmen und dem Spender Aortentransplantat periodisch mit Heparin (100 U / ml) Kochsalzlösung (bis zu 40 ml / kg) während Anastomose bewässert.
- Durchschneiden beide Seiten Spender Aorta mit scharfen Mikro-Schere, um ein Segment Transplantat von 2,5 mm in der Länge für die Transplantation zu erstellen.
- Platzieren des Spenders Aortentransplantat in der orthotopic Position anastomose des Spenders Transplantats proximalen und distalen Ende an den Empfänger der proximalen und distalen Schnittfläche der abdominalen Aorta, die jeweils mit einem Ende-to-End-Muster mit 11-0 Polyamid Monofilamentnahtmaterial.
- Für die kontinuierliche Nähte, legen Sie die Nähte Aufenthalt bei 3 und 9 Uhr-Position zunächst. Zwischen zwei Haltefäden an jeder Seite des Transplantats, binden anastomose beide Schnittkanten in 3-4 Stiche mit den fortlaufenden Nähten, und die laufenden Nähte Nähte mit einem doppelten Knoten bleiben. Da beide Schichten des Verschlusses kontinuierlich sind, wird die Dehiszenzrisiko erhöht. Der Spender Aortentransplantat sollte in geeigneter Länge sein, dem Empfänger proximalen und distalen abgeschnittene Ende Bauchaorta verbinden.
- Für die Knopfnähte konstruieren vier Anastomose bei 3 und 9 Uhr-Position an beiden Seiten des Transplantats einerseits und anastomosieren beide Schnittkanten in 3-4 Stiche zwischen zwei Haltefäden an jeder Seite des Transplantats.
- Lassen Sie den Haken, um den distalen retrograden Fluss in Transplantats ermöglichen, identifizieren die blutenden Stellen und zusätzliche Stiche innerhalb von 3 Minuten.
- Nach der Feststellung zufrieden Hämostase, lassen Sie die proximalen Klemme.
- Bestätigen Durchgängigkeit des Transplantats durch das Vorhandensein von starkem Pulsation in dem Transplantat und dem proximalen benachbarten Segment des nativen Bauchaorta, insbesondere im distalen benachbarten Segment der Aorta und A. mesenterica inferior. Betrachten Thrombose in Anastomosen wenn das Pulsieren innerhalb von wenigen Minuten nach der Wiederherstellung des Blutflusses zu verringern.
- Zurück in den Darm in die Bauchhöhle.
- Naht schließen Sie die Bauchdecke mit 5-0 Nylon Naht in Muskulatur und die Haut Schicht, beziehungsweise.
- Legen Sie die Empfänger-Mäuse in einem sauberen Käfig auf der Spitze eines Heizkissen, und warten Sie 1-2 Stunden für die Mäuse wieder zu Bewusstsein und erholen sich von der Narkose. Es ist wichtig, Tier ausreichend Wärme während der Wiederherstellung erhalten. Halten Sie die Mäuse in der warmen und trockenen Käfig vor tierischen Gefolge aus der Narkose.
- Bewerten Sie die motorische Funktion der Hinterbeine nach Mäusen Erholung, und wieder am zweiten Tag. Eine erfolgreiche Transplantation Chirurgie bestätigt werden if keine Funktionsstörung Hinterbeine in Empfängermäuse am zweiten Tag beobachtet.
- Verwalten Sie die Empfänger-Mäusen mit Ketoprofen in Trinkwasser (5 mg / kg / d = 27 ug / ml im Trinkwasser) für 48 Stunden. Falls Empfängermäuse von Schmerzen unrelieved leiden durch die postoperative Analgetika wie durch den Verlust der Mobilität, das Versagen der Bräutigam, abnorme Körperhaltung gebündelt, etc belegt, werden sie eingeschläfert werden. Die Tiere werden in vordefinierten Endpunkte nach 1-60 Tagen eingeschläfert werden.
Graft-Analyse
Artery Transplantate in Allograft wurden bei 4 Wochen und Transplantate in syngene Transplantat Modell beschafft waren 6 Wochen postoperativ (5 Wochen nach der viralen Infektion) und mittels Standard histologische Techniken für Elastica-van Gieson (EVG)-Färbung, Hämatoxylin und Eosin (HE) Färbung und Immunofluoreszenzfärbung. Bilder wurden mit einer Immunfluoreszenzmikroskop System (Zeiss). Zellzählung der Kerne durch positive Immunfärbung umgeben war durchführened bei starker Vergrößerung und gemittelt aus 5 Querschnitte für jedes Transplantat. Die Graft-Bereich Messungen des Lumen (im Endothel), Intima (zwischen Endothel und innere elastische Lamina, IEL), Medien (zwischen IEL und externen elastischen Lamina, EEL), Wandstärke (zwischen Endothel und externen elastischen Lamina) und ganze Gefäß (im AAL) wurden von 5 seriellen Querschnitte, 150 um voneinander für jedes Transplantat berechnet Hilfe computergestützter Bildanalyse und NIH Bild 1.60 ( http://rsbweb.nih.gov/nih-image ).
Statistische Analyse
Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Two-tailed wurden gepaarte t-Tests und ein Zwei-Wege-ANOVA-Analyse unter Verwendung der Prism Software (GraphPad Software). Unterschiede mit p <0,05 wurden als statistisch signifikant anzuzeigen.
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Representative Results
Maus Allotransplantat Arteriosklerose (GA) ein: In diesem Modell wird ein männlichen Spenders Aorta in weibliche Empfänger transplantiert, so dass die Host-alloreaktive T-Zell-vermittelte Reaktionen induziert alloimmune gegen eine kleinere Y-Antigen (die männlich-spezifische Antigen Nebenhistokompatibilitäts HY) ausgedrückt auf das Transplantat 12 und wiederum T IFN-γ Antriebe VSMC Proliferation 20, wie in anderen Allografttransplantation Modelle 2 beobachtet, 6, 8-10 und 14 Zellen erzeugt. Ein Segment der Aorta von einem Spender Männchen wurde chirurgisch in eine Aorta eines weiblichen Empfänger eingefügt ist, und Aorten wurden 4 Wochen nach der Transplantation (1A) geerntet. Die histologische Analyse der Arterie Transplantate wurde von Elastica-van Gieson (EVG), H & E durchgeführt und Immunfärbung mit VSMC Marker SMA und pan-Leukozyten-Marker CD45. Keine Abstoßung wurde zwischen C57BL/6J männlichen Mäusen in der Aorta der Transplantation beobachtet. Männlich zu weiblich Transplantationeninduzierte GA, durch die Infiltration von Leukozyten und Neointima-Bildung mit der Akkumulation von VSMC (1B) aufweist. Um die Rolle von IFN-γ-Signalisierung in GA, Aorten von WT oder IFN-&ggr; R-KO-Mäusen zu bestimmen, wurden zu WT weiblichen Empfänger transplantiert. Löschung von IFN-&ggr; R in Spendertransplantate zeigten eine reduzierte Infiltration von Leukozyten und Neointima-Bildung mit einer Abnahme von SMA-positiven Zellen im Vergleich zu WT (nicht gezeigt). Diese Ergebnisse unterstützen eine entscheidende Rolle für die IFN-γ-Signalisierung in GA Progression wie zuvor in humanisierten Maus Xenograft Transplantation Modell 4, 15, 17, 18 beobachtet.
IFN-γ-induzierte Graft Arteriosklerose: Es wurde festgestellt, dass IFN-γalone ausreicht, um Neointimabildung in einer humanisierten Maus GA Modell 15, 17 induzieren. Hier gründeten wir eine IFN-γ-vermittelte Maus syngene Graft Arteriosklerose Modell. In diesem Modell wurden WT männlich Aorten transplantiertIFN-&ggr; R in-defizienten Mäusen durch Empfänger intravenös Injektion von Adenovirus-Replikation Codieren der IFN-γ Maus Transgen (Ad-IFN-γ) oder die Steuerung LacZ-Gen (Ad-LacZ) (Abbildung 2A). gefolgt Leber-Infektion und Leber Transgenexpression von Ad-LacZ wurde von X-gal-Färbung in der Ad-LacZ-Gruppe bestätigt, nicht aber die Ad-IFN-γ-Gruppen, wie zuvor beschrieben 17. Systemische Expression von IFN-γ im Serum wurde in einer Menge von 120-150 ng / ml an Tag 3 erkannt und behielt bis zu 5 Wochen in der Ad-IFN-γ, aber nicht in der LacZ-Gruppe. Aorten wurden bei 5 Wochen nach der Injektion von Adenovirus für die histologische Analyse und morphometrische Beurteilung der Arterie Transplantat Intima, Media, Lumen und Gefäß Gebiet geerntet. Expression von IFN-γ, aber nicht LacZ Kontrolle induzierte neointimale Bildung. Keine offensichtliche Infiltration von Leukozyten im Vergleich zu der Allotransplantat-Modell (2B) erfasst wird. Diese Daten sind konsistent mit der vorherigenBeobachtungen in humanisierten Maus Xenograft-Modell, dass IFN-γ allein ausreicht, um Neointimabildung 15, 17 induzieren.
Abbildung 1. Illustration und die Systematik der Maus allogenen Transplantation Arterie Modell. A. Eine Abbildung des Allografttransplantation Verfahren. Ein Segment des Spenders männlich Aorta wurde chirurgisch in Bauchaorta in einer weiblichen Empfänger zwischengeschaltet. Aorten wurden bei 4 Wochen nach der Transplantation geerntet. Als Kontrolle wurde ein Segment des männlichen Spenders Aorta operativ in einer abdominalen Aorta in einem männlichen Empfänger angeordnet. B. Histologische Analyse der Arterie Transplantate von Elastica-van Gieson (EVG), H & E und Immunfärbung mit anti-a-SMA-und Anti-CD45. Repräsentative Aufnahmen gezeigt. Pfeilspitzen markieren die interne elastische Lamina, die Intima von Medien abzugrenzen. Maßstabbar: 50 mm. Kein Transplantat Arteriosklerose wurde zum Mann-Gruppe beobachtet.
Abbildung 2. IFN-γ-induzierten Maus syngene Arterie Transplantation Modell. A. Ein Schema der IFN-γ-induzierten Maus syngene Modell. Männlich Spender Brustwandarterie wurde präpariert und umgepflanzt in Bauchaorta bei männlichen Empfänger IFN-&ggr; R KO Mäusen. Eine Woche nach der Operation wurde 1X10 9 pfu Ad-mIFN-γ oder Ad-LacZ in Empfängermäuse über Halsschlagader injiziert. Serum wurde am Tag 3, 7 und 35 nach der Injektion von Viren für IFN-γ-Messung gesammelt. Die Transplantate wurden morphometrische 6 Wochen Beurteilung geerntet. B. Histologische Analyse der Arterie Transplantate durch Immunfärbung mit Anti-a-SMA-und Anti-CD45. Repräsentative Aufnahmen gezeigt. Pfeilspitzen markieren die interne elastische Lamina, die Intima von Medien abzugrenzen. Maßstab bar: 50 mm. Kein Transplantat Arteriosklerose wurde in LacZ-Gruppe beobachtet.
| Schritt | Problem | Möglicher Grund | Lösung |
| 2.17 | Schwere Blutungen | Der Spalt (Abstand zwischen zwei Maschen) zu groß ist, insbesondere Knopfnähte. | Der Abstand zwischen je zwei Maschen sollte gleichmäßig während Anastomose. Fügen Sie einen Stich an Blutungen Website. |
| Nur der Adventitia genäht. | Identifizieren und Nähen die ganze Aortenwand | ||
| Unligierten Holz Zweige | Ligation des Holz Zweige | ||
| Mit zu viel Heparin | Mit bis zu 40 ml / kg Heparin (100 U / ml) Kochsalzlösung, die Operation Feld während der Anastomose zu bewässern. | ||
| 2,19 | Thrombose | Lumen ist zu schmal Anastomose, insbesondere kontinuierlicher Nähte. | Vermeiden Sie zu viele anastomosierenden Aortenwand bei jedem Stich. Die Aorta Größe der Maus ist sehr klein. Um Stich zu viele Aortenwand während Anastomose verursacht Lumen schmal und Thrombose, jedoch Stiche zu weniger Aortenwand führt zu schweren Blutungen führen. |
| Der Faden durchlaufen Aortenwand an der gegenüberliegenden Seite. | Die Ermittlung der Aortenwand und dann machen Stiche. Wenn es passiert ist, sollte der Betreiber abgeschnitten Nahtknotens und Re-Stich auf dieser Website. | ||
| Endothelzellen werden während Anastomose verletzt. | Mit den Aufenthalt Nähte für Anastomose. Halten Sie nicht / Squeeze die ganze arotic Wand fürSteinpilze für Anastomose. | ||
| Heparin wird während der Anastomose verwendet. | Die Aorta Größe der Maus ist sehr klein. Es ist sehr einfach für Thrombosen in den Transplantaten nach Anastomose. Geben Heparin, um die Operation Feld bewässern ist sehr wichtig zur Verminderung der Thrombose. Die Erfolgsrate der Behälter Transplantation in Mäuse etwa 50% ohne Verwendung von Heparin und 95-100% bei Verwendung von Heparin. Wenn die Thrombose innerhalb weniger Minuten gefunden wird nach der Wiederherstellung des Blutflusses, ein alternativer Ansatz, um die Thrombose zu entfernen, ist 30-50 ul heparinied Kochsalzlösung (100 U / ml) durch IVC injizieren. Injizieren Sie nicht zu viel Heparin nur im Falle von schweren Blutungen. | ||
| 2,23 | Transplantation fehlgeschlagen | Verzögerte Blutungen und Thrombosen oder andere | Das Gefäß Transplantation in Mäuse sehr schwierige Operation für die Aorta eine Größe von Maus sehr klein. Es gibt drei wichtige poingen für die erfolgreiche Operation: 1) sicherstellen, dass die Wände der Aorta von Wirt und Spender zusammen, ohne offensichtlich Lücke anastomisiert, nur im Falle von schweren Blutungen, 2) halten genug Lumenraum bei Anastomosenstelle, nur für den Fall von Thrombose, 3) verwenden Heparin in einer richtigen Dosis während Anastomose, nur für den Fall von Thrombose und schwere Blutungen. Nach diesem Protokoll ist die Erfolgsquote für den Autor mehr als 95%. |
Tabelle 1. Fehlerbehebung Tisch.
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Discussion
Die beschriebenen Protokolle werden auf der Maus GA-Modelle konzentriert. Die Verfahren können zu anderen Transplantat Transplantation Modelle herangezogen werden. Diese Modelle sind mit humanisierten Xenograft (dh menschlichen koronaren Segmente in der Infrarot-renalen Aorten von immungeschwächten Mäusen eingefügt) und akute Abstoßung Maus GA-Modell (dh eine Maus Aorta aus einer genetischen Belastung in eine andere genetische Belastung Empfänger). Unsere Maus beschriebenen Modelle sind für die menschliche GA Läsionen schließen. Das erste Modell beinhaltet Zwischenschaltung eines Schiffes Segment aus einer männlichen Maus in einen weiblichen Empfänger der gleichen Inzuchtstammes (C57BL/6J). Transplantat-Abstoßung in diesem Fall werden nur gegen Nebenhistokompatibilitätsantigene von dem Y-Chromosom (in der männlichen, nicht aber die weiblich) und der Abstoßungsreaktion dass ausreichend träge spenderabhängig abgeleitet glatten Muskelzellen mehrere Wochen 2, 6 zu erhalten erfolgt kodiert ist , 8-10, 12, 14. Das zweite Modell beinhaltet Zwischenschaltung einer Arterie segment von einem Wildtyp C57BL/6J Maus Spender in einem Host-Maus des gleichen Stammes und Geschlechts, die den Rezeptor für IFN-γ (IFN-&ggr; R-KO) fehlt durch die Verabreichung von Maus gefolgt IFN-γ (geliefert über Infektion der Maus Leber mit einem adenoviralen Vektor.) Es gibt keine Ablehnung in diesem Fall als Spender und Empfänger Mäusen des gleichen Stammes und Geschlecht sind aber Donor glatten Muskelzellen proliferieren als Reaktion auf die Zytokin während host-abgeleiteten Zellen fehlen Rezeptoren für dieses Zytokin, reagieren nicht 21. Weiterhin kann durch Rückkreuzung zusätzliche genetische Veränderungen in den Behälter Spender können beide Modelle verwendet werden, um die Wirkung von spezifischen Genen auf IFN-γ-angetriebene Proliferation von glatten Muskelzellen und GA Verlauf zu beurteilen.
Die Rolle von IFN-γ in Maus-Modellen GA wurde nicht gut etabliert. Unsere beiden Mausmodellen haben die Rolle von IFN-γ in Maus GA überprüft. Im ersten Modell wird eine männlichen Spenders Aorta in weibliche Empfänger transplantiertso dass der Host induziert alloreaktive T-Zell-vermittelte Reaktionen alloimmune gegen die männlich-spezifische Antigen Nebenhistokompatibilitäts HY auf der Transplantate 12 ausgedrückt. In der Tat, WT (C57BL/6J) männlichen zu weiblichen C57BL/6J Transplantation induzierte GA, durch Infiltration von Leukozyten und Neointimabildung mit VSMC Akkumulation gekennzeichnet. Im Gegensatz dazu ist zum Mann Aorta Transplantation nicht induzieren GA. Wir sind entschlossen, die Rolle von IFN-γ-Signalisierung in vaskulären Zellen mit IFN-&ggr; R-KO als Spendertransplantat transplantiert WT weibliche Empfänger. Löschung von IFN-&ggr; R in Spendertransplantate abgestumpft Leukozyteninfiltration und VSMC Akkumulation in der Neointima. Daher ist die Rolle von IFN-γ in aktuellen Maus-Modell im Einklang mit dem humanisierten Maus Xenograft Transplantationsmodell IFN-γ, wo Signalisierung im Transplantat ist entscheidend für GA Progression 4, 15, 17, 18. Wir haben festgestellt, wenn IFN-γ allein genügt, um Neointimabildung durch die Schaffung eines IFN-γ-medi induzierenATED Maus syngene Graft Arteriosklerose Modell. In diesem Modell wird ein männlicher Aorta in einem männlichen IFN-&ggr; R-KO Empfängertier transplantiert, in dem Maus-IFN-γ ist dann systemisch durch intravenöse Injektion von replikationsdefizienten Adenovirus codiert, das Maus-IFN-γ-Transgen (Ad-IFN-γ ausgedrückt ). Wir haben beobachtet, dass die Expression von IFN-γ, aber nicht LacZ Kontrolle induziert neointimale Bildung. In diesem Modell wird keine offensichtliche Infiltration von Leukozyten im Vergleich zu dem Allotransplantat Modell erfasst wird, die mit den bisherigen Beobachtungen in einem menschlichen Arteria-SCID Maus Modell Transplantation in dem vaskulären IFN-γ-Signalisierung allein ausreicht, um Neointima-Bildung in Abwesenheit von Leukozyten zu induzieren 15, 17.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse R01 HL109420 zu WM und AHA 9320033N zu LY unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks) |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml) |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml) |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml) |
| Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride) | CareFusion | AL4109 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | To prepare the anesthetic |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Microscope | Leica | MZ95 | |
| Micro Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5693 | |
| Spring Scissors | F.S.T | 15009-08 | To transect the aorta of donor or recipient |
| Extra Narrow Scissors | F.S.T | 14088-10 | |
| Needle Holder/Forceps | MICRINS | MI1542 | To hold the needle |
| Fine Forceps | F.S.T | 11254-20 | |
| Forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Forceps | F.S.T | 13011-12 | |
| LANCASTER Eye Speculum | Zepf Medical Instruments | 42-1209-07 | |
| Micro Vascular Clip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6472 | |
| Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5440 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture | AROSurgical Instruments Corporation | Cat #T4A10Q07 | 10-0 suture, Needle=70 microns |
| Black Monofilament Nylon Suture | Syneture (Covidien) |
SN-1956 | 6-0 suture |
| Non-Woven Songes | McKesson Corp. | Reorder No. 94442000 | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | REF 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 18G 1 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305196 | |
| 25G 7/8, Hypodermic Needle | BD | REF 305124 | |
| 27G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305109 | |
| 30G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305106 | |
| Hearting Pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
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