Summary
Мы описываем наши протоколы для мыши трансплантата arteriosclerois (GA) моделей, которые включают вмешательство сегменте судна мышь в получателем же инбредной линии. По обратным скрещиванием дополнительных генетических изменений в сосуд донора, модель может оценить влияние специфических генов в GA.
Abstract
Привитые arteriosclerois (GA), также называемый аллотрансплантата васкулопатию, это патологическое поражение, которое развивается в течение месяцев и даже лет в пересаженных органов характеризуется диффузной, окружные стеноз всего дерева сосудистого трансплантата. Наиболее важным компонентом патогенеза GA является распространение гладких мышц-подобных клеток в интиме. Когда человек сегментов коронарных артерий вставлен в инфра-почечной аорты иммунодефицитных мышей, интим может расширяться в ответ на восприимчиво переданы Т-клетки человека аллогенной к донорской артерии или экзогенный человеческого IFN-γ в отсутствие Т-клетках человека. Взаиморасположение мышь аорты от одного штамма в другой штамма-реципиента мышь ограничена в качестве модели хронического отторжения в организме человека, так как острый клеточный ответ об отклонении в этой модели мыши полностью устраняет все доноров полученные клетки сосудов из привитого течение двух-трех недель. Недавно мы разработали два новых мУз модели, чтобы обойти эти проблемы. Первая модель предполагает вмешательство судна сегмент от самца мыши в женский получателем же инбредной линии (C57BL/6J). Отторжения трансплантата в этом случае направлено только против минорных антигенов гистосовместимости, кодируемый хромосомой Y (в настоящее время в мужской, но не женщин) и реакции отторжения, который наступает достаточно ленивы, чтобы сохранить доноров полученные клетки гладких мышц в течение нескольких недель. Вторая модель включает в себя промежуточные артерии сегмент от дикого типа донор мыши C57BL/6J в хозяина мыши той же самой линии и пол, который испытывает недостаток рецептора IFN-γ с последующим введением мышь IFN-γ (доставляется через заражение мышей печень с аденовирусной вектора. Там нет отказа в этом случае, как донора и реципиента мышей той же линии и пола, но донором гладкомышечных клеток размножаться в ответ на цитокины хозяина в то время как клетки, полученные, не имея рецепторовэтого цитокина, не реагируют. По обратным скрещиванием дополнительных генетических изменений в сосуд доноров, обе модели могут быть использованы для оценки влияния специфических генов на прогрессирование ГА. Здесь мы описываем подробные протоколы для наших мышиных моделях GA.
Introduction
Привитые arteriosclerois (GA), также называемый аллотрансплантата васкулопатию, это патологическое поражение, которое развивается в течение месяцев и даже лет в пересаженных органов характеризуется диффузной, окружные стеноз всего дерева сосудистого трансплантата 7. На ранних стадиях может привести к эксцентричным и координационных стеноза, которые являются более очевидными в артериях, таким образом, более напоминающий стеноза видели в обычных атеросклероза. Просвет потери трансплантата результаты сосуды от интимных расширение за счет инфильтрации хост Т-клеток и макрофагов и особенно накопление внеклеточного матрикса и гладкие мышцы-подобных клеток происходит от трансплантата, хоста или оба 5, 13, 19, которые неадекватно компенсироваться по внешнему ремоделирования сосудов. В сердечных трансплантатов, наиболее клинически значимыми поражениями являются те, в эпикардиальной интрамиокардиальной и коронарных артерий. В конечном счете, GA коронарных артерий вызывает ишемические сердечной недостаточности. ГА является основной причиной сердечных конце грКормовая потерь. Стенозами GA остановиться на линии шва, сильно причастности хозяина на трансплантат аллоантигенам в патогенезе и ведущих нам классифицировать GA как форма хронического отторжения 3. Тем не менее, другие формы повреждения артерий может увеличить риск Г.А., либо за счет увеличения чистого бремя травм или усилением и / или модулирования аллоимунный ответа. Эндотелиальных клеток (ЭК) подкладка артерий трансплантата сохраняется в человеческой GA и самый поверхностный регионах, прилегающих к интиму подкладка ЕС является местом наиболее сильно проникли хозяина полученных IFN-γ-производители Т-клеток и макрофагов, 11, в некоторых пациентов GA связан с развитием конкретных доноров аллоантитела, которые связываются с трансплантат EC 16, но сосуды не наблюдается заметных признаков фибриноидный некроз, характерный острый антитело-опосредованной отказ 11.
Наиболее важным компонентом патогенеза ГАпролиферации гладких мышц-подобных клеток в интиме, если этот процесс можно остановить, Джорджия вряд ли будет прогрессировать. Предыдущая работа из нашей группы показал, что из человека интим сегментов коронарных артерий вмешался в инфра-почечная аорты иммунодефицитных мышей расширяться в ответ на восприимчиво переданы Т-клетках человека аллогенной к артерии донора и что этот процесс может быть запрещена путем нейтрализации человеческого IFN- γ 18. Кроме того экзогенный человеческого IFN-γ может привести интимных (и медиальной) клеток гладких мышц сосудов (VSMC) пролиферации этих артериальных трансплантатов в отсутствие Т-клетки человека 15, 17. (Важно отметить, что человека и мыши IFN-γ не пересекают видов, исключая косвенное воздействие на мышей хозяин в этой экспериментальной системе.) Эти гуманизированными мышиные модели имеют преимущество сводный Т-клеток человека / сосудистые взаимодействия клеток и интимную поражения в основном состоит из человеческих (т.е. трансплантат производных), клеткикак было отмечено в клинических образцах, но они полностью не повторять от клинической ситуации, потому что они игнорируют роль хоста макрофагов и, возможно, другие типы клеток, участвующих в клинических поражений трансплантации. Традиционной модели мыши этого процесса теоретически может решить эту проблему, в дополнение к ограничениям гуманизированного модель с привлечением полной иммунной системы хозяина и предоставление дополнительных преимущество, что позволяет сила мыши генетические подходы должны применяться к GA. Два наиболее широко используемых моделей мыши включать гетеротопической трансплантации сердца и трансплантации ортотопический артерии 1. Поражений, которые развиваются в артериях гетеротопической трансплантатов сердца в значительной степени состоят из клеток хозяина, вероятно костномозгового происхождения, в то время интимной клетки артерий в человеческих трансплантатов сердца преимущественно привитых происхождения 5, 13, 19. Это значительное различие, которое привело нас к разработке альтернативных моделей мыши. Взаиморасположениемышь аорты от одного штамма в другой штамма-реципиента мышь еще более ограничен в качестве модели хронического отторжения в организме человека, так как острый клеточный ответ об отклонении в этой модели мыши полностью устраняет все донор полученные клетки сосудов из привитого течение двух-трех 19 недель. Следовательно, последующие изменения заметны и в сегменте вмешался судно исключительно ответа клеток-хозяев, которые заселили decellularized судна эшафот, создавая очень искусственной ситуации ограниченное значение в качестве модели для изменения в сосудах трансплантата, которые происходят в клинике. Недавно мы разработали две новые модели мыши, чтобы обойти эти проблемы 21. Первая модель предполагает вмешательство судна сегмент от самца мыши в женский получателем же инбредной линии (C57BL/6J). Вторая модель включает в себя промежуточные артерии сегмента от дикого типа донора мыши C57BL/6J в хозяина мыши той же линии, что и пол не хватает RECeptor для IFN-γ (IFN-Гд-KO) с последующим введением мышь IFN-γ (поставляются инфекция печени мышей с аденовирусной вектора. Здесь мы описываем подробные протоколы и преимущества наших моделей мышей GA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Мыши и аллотрансплантата сингенную модели трансплантации трансплантат
Все исследования на животных были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета из Йельского университета. Для аллотрансплантата модели сегментов грудной аорты от самцов 4-5 недельных WT (C57BL/6J) или IFN-Гд-KO мышей вставлены в брюшную аорту женского получатель, 8-12 недельных WT использованием конца в конец микрохирургической техники анастомоза (см. следующий право). Для сингенных модель трансплантата сегментов грудной аорты от мужских, 4-5 недельных мышей WT были вставлены в брюшную аорту мужского, 8-12 недельных IFN-γR1-KO использованием конец-в-конец микрохирургического анастомоза техники. Через 1 неделю после операции животных инокулировали внутривенно Ad5.CMV-мышь IFN-γ или Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) в концентрации 1 × 10 9 PFU. Сыворотки мышей IFN-γ уровни были измерены с помощью ELISA (eBioscience) на 1 и 5 недель после аденовирус управления. Некоторые животные получали BrdU(Sigma-Aldrich) в дозе 100 мг / кг подкожно за 2 недели до жертвы.
Впритык микрохирургической техники анастомоза (Видео будут приняты для этой части):
1. Процедура Донор
- Обезболить донора мышей с внутрибрюшинной инъекции кетамина (50 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг).
- После обеспечения адекватной анестезии, поместите доноров мышам под операционным микроскопом в режиме x8-30 увеличение на подносе в положении лежа на спине, а также использовать йод Prep Pad Pad Алкоголь и подготовки к груди подготовки стен.
- Надрезать переднюю грудную стенку через ребра и диафрагмы, чтобы открыть сердце.
- Открытие правое предсердие, вводят 10 мл гепаринизированной (100 ед / мл), солевым раствором в левый желудочек, чтобы смыть мышей с использованием 10-мл шприц с 25-иглы.
- Резекцию сердце и легкие, чтобы разоблачить всю длину грудной аорты.
- Рассеките грудной аорты тщательно, чтобы свести к минимуму прямой травмы, Whilэлектронной выявления, перевязывать и разделить пиломатериалов веток с помощью 11-0 шва рядом с аортой.
- Как только грудной аорты является свободным от окружающих тканей, акциз всей грудной аорты для трансплантации.
- Промыть срез доноров аорты с гепарином (100 ЕД / мл) солевой раствор, и сохранить его в том же растворе на льду (до 6 ч) до трансплантации.
2. Получатель процедуры
- Введите мышей-реципиентов с ф кетопрофен (5 мг / кг) для обезболивания и thenanesthetize мышей внутрибрюшинно кетамина (50 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг). Получателем мыши глубокой анестезии в течение 10 минут с продолжительностью 60-90 мин. Во время операции, уровень анестезии оценивается каждые 15 мин, зажимая передней брюшной стенки или ноги с помощью щипцов. Если животное реагирует на вредные стимулы в любое время во время операции, дополнительную дозу кетамина и ксилазина (1/4 или 1/3 первоначальной дозы) будет вводиться подкожно или внутримышечно
- После обеспечения адекватной анестезии, сбрить мех в передней брюшной стенке с помощью электрической бритвы, очистите кожу с помощью йода Prep Pad и алкоголь Prep Pad, закрывала глаза использовании глазной мази. Во время операции, следующие асептических методов будет использоваться для операций, включая очистку операционный стол с 10% отбеливатель, носить стерильные перчатки с использованием стерильных микрохирургических инструментов (стерилизовали паром приборы для начала операции, а затем горячей стеклянных шариков стерилизованные инструментов между несколькими операции и т.д.).
- Поместите мышей-реципиентов под операционным микроскопом при увеличении в X8-30 на подносе в положении лежа на спине.
- Надрезать брюшной стенки по срединной линии от xyphoid к лобку, и распространять брюшную стенку друг от друга с помощью микро-втягивающим, чтобы разоблачить брюшной полости.
- Уберите кишечник сверху и оберните марлей смоченной физиологическим раствором. Мышей-реципиентов становятся охлаждается потери за слухT через кишечник вовне. Важно поддерживать животное тепло. Тем не менее, отопительной панели не используется во время операции, как скромные гипотермии приносит пользу в предотвращении травмы позвоночника во время окклюзии аортального кровотока, а также существует неэффективно теплообмена с отсутствием притока крови к нижней половине тела мышей.
- Переместить репродуктивных органов книзу, оберните области живота мышей-реципиентов с солевым раствором смоченную марлю, и использовать его, чтобы втянуть прямую кишку, чтобы правая сторона брюшной полости. Облученных тканей орошаются периодически с физиологическим раствором при пересадке.
- Рассеките прямо сегмент инфраренального аорты между почечный сосуд проксимально и дистально бифуркации аорты и отделить от нижней полой вены (НПВ) тщательно.
- Выявление и перевязывать все мелкие ветви, происходящих из данного сегмента брюшной аорты использованием 11-0 Полиамид мононить шва.
- Крест-зажим изолированный сегментbdominal аорты с помощью двух зажимов сосудистой примерно 5 мм друг от друга, по одному на каждом конце.
- Разрез брюшной аорты между зажимами острыми микро-ножницы для создания анастомоза сайтов.
- Резекцию небольшой сегмент брюшной аорты (до 0,4 мм в длину) из одного отрезанного конца пересеченной аорты получателя для размещения трансплантата аорты донора.
- Промойте сегментов аорты между зажимами использованием гепаринизированной солевой раствор для удаления остатков крови. Аорты сегментов между зажимами и донор трансплантата аорты орошают периодически с гепарином (100 ед / мл), солевым раствором (до 40 мл / кг) в течение анастомоза.
- Разрез обе стороны доноров аорты с острыми микро-ножницы, чтобы создать сегмент трансплантата 2,5 мм в длину для трансплантации.
- Поместите донор трансплантата аорты в ортотопической положение, анастомозирующих донор трансплантата проксимальный и дистальный конец проксимальный и дистальный конец сокращения получателя брюшной аорты, соответственно, на конец тO-конца узора с помощью 11-0 Полиамид мононить шва.
- Для непрерывного швов, место пребывания швов на 3 и 9 часов позиции первых. Между двумя пребывания швы с каждой стороны трансплантата, анастомозируют как кромки в 3-4 строчек с использованием работает швы, и свяжите работает швы, чтобы остаться швы с двойной узел. Поскольку оба слоя закрытие непрерывны, риск расхождение увеличивается. Донор трансплантата аорты должна быть соответствующей длины для подключения проксимальный и дистальный конец сокращения получателя из брюшной аорты.
- Для узловыми швами, построить четыре анастомоза на 3 и 9 часов позиции в обе стороны трансплантата во-первых, и анастомозируют как кромки в 3-4 стежками между двумя пребывания швы с каждой стороны трансплантата.
- Отпустите зажим дистальных чтобы ретроградный кровоток в трансплантат, определить кровотечения сайтов и сделать дополнительные стежки в течение 3 минут.
- Убедившись удовлетворительное гемостаза, отпустите зажим проксимальных.
- Подтверждение шунта наличием энергичном пульсации трансплантата и проксимальный соседним сегментом родной брюшной аорты, в частности в дистальном смежный сегмент брюшной аорты и нижней брыжеечной артерии. Рассмотрим тромбоза анастомоза сайтов, если пульсации уменьшаются в течение нескольких минут после восстановления кровотока.
- Возврат кишечника в брюшную полость.
- Шовный закрыть брюшную стенку использованием 5-0 нейлоновой ниткой в мышечный слой и слой кожи, соответственно.
- Поместите мышей-реципиентов в чистую клетку на вершине грелку, и подождать 1-2 ч в течение мышей в сознание и восстановления после анестезии. Это важно для поддержания адекватного тепло животного во время восстановления. Держите мышей в теплой и сухой клетке перед животным пробуждение от наркоза.
- Оценка двигательной функции задних конечностей после выздоровления мышей, и снова на второй день. Успешная операция по трансплантации будет подтверждена ЯF не дисфункцию задних конечностей не наблюдается мышей-реципиентов на второй день.
- Администрирование мышей-реципиентов с кетопрофен в питьевой воде (5 мг / кг / сут = 27 мкг / мл в питьевой воде) в течение 48 часов. Если получатель мышей страдают от боли необлегченный по послеоперационном анальгетики, о чем свидетельствует потере подвижности, неспособность ухаживать, аномальный пучки положение, и т.д., они будут умерщвлены. Животные будут умерщвлены в предопределенные конечные точки после 1-60 дней.
Привитые анализа
Артерии трансплантатов аллотрансплантата были закуплены в течение 4 недель и трансплантатов у сингенных модель трансплантата были 6 недель после операции (5 недель после вирусной инфекции) и анализировали стандартными гистологическими методами Elastica-ван Гизон (EVG) окрашивания гематоксилином и эозином (HE) окрашивания и иммунофлюоресценции окрашивания. Снимки выполнены при помощи иммунофлюоресценции системы микроскопа (Zeiss). Сотовые подсчета ядер, окруженных положительными Иммуноокрашивание выполнятьЭд под большим увеличением и в среднем от 5 сечений для каждого трансплантата. Привитые измерения площади просвета (в эндотелий), интимы (между эндотелием и внутренней упругой пластинки, IEL), носитель (между IEL и внешней эластичной оболочкой, EEL), толщина стенки (между эндотелием и внешней эластичной оболочкой) и всего судна (в пределах угорь) были рассчитаны из 5 последовательных сечений, 150 мкм друг от друга для каждого трансплантата с использованием компьютерного анализа изображений и NIH Image 1.60 ( http://rsbweb.nih.gov/nih-image ).
Статистический анализ
Все данные представлены как среднее ± SEM. Двусторонними, парные т тесты и двусторонней ANOVA анализ проводили с помощью программы Prism программное обеспечение (GraphPad Software). Различия с Р <0,05 считались указывают статистическую значимость.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мышь аллотрансплантата атеросклероза (GA) модель: В этой модели мужской аорты донора пересаживается в женский род получателя, так что хозяин аллореактивных вызывает опосредованный Т-клетками аллоиммунная ответов в отношении несовершеннолетнего антигена Y (мужской конкретных незначительные HY антиген гистосовместимости) экспрессируется на трансплантата 12 и, в свою очередь Т-клеток производства IFN-γ дисков ГМКС пролиферацию 20, наблюдаемые в других трансплантация аллотрансплантата модели 2, 6, 8-10, 14. Сегмента грудной аорты от донора мужской хирургически вставляются в брюшную аорту женщины-получателя, а аорты собирали через 4 недели после трансплантации (Фиг.1А). Гистологический анализ артерии трансплантатов была выполнена Elastica-ван Гизону (ГО), H & E и иммуноокрашивания VSMC SMA Маркер и пан-лейкоцитов маркер CD45. Нет отторжения трансплантата не наблюдалось между самцов мышей C57BL/6J в аорте трансплантации. Мужчин и женщин трансплантатионами Г.А., характеризуется инфильтрацией лейкоцитов и неоинтимы с накоплением VSMC (рис. 1В). Для определения роли IFN-γ сигнализации в GA, аорты от БТ или IFN-Гд-KO мышам трансплантировали WT женщины-получателя. Удаление IFN-Гд в донор трансплантата имели меньшую инфильтрацию лейкоцитов и образование неоинтимы с уменьшением СМА-позитивных клеток по сравнению с WT (не показан). Эти результаты подтверждают важную роль для IFN-γ сигнализации в прогрессии GA как ранее наблюдалось в гуманизированных ксенотрансплантата мыши модели трансплантации 4, 15, 17, 18.
IFN-γ-индуцированную трансплантат артериосклероз: Было установлено, что IFN-γalone достаточна, чтобы вызвать образование неоинтимы в гуманизированного мышь GA модель 15, 17. Здесь мы установили IFN-γ-опосредованной мыши сингенную трансплантата атеросклероз модели. В этой модели аорты WT мужчин были пересаженыв IFN-Гд-дефицитных мышей-реципиентов последующей инъекции внутривенно репликации аденовирус-дефицитных мышей кодирующего IFN-γ трансген (Ad-IFN-γ) или контрольный ген LacZ (Ad-LacZ) (Фиг.2А). Инфекции печени и выражения печени трансген Ad-LacZ была проверена X-Gal окрашивание в Ad-LacZ группа, но не Ad-IFN-γ группы, как описано выше 17. Системная выражение IFN-γ в сыворотке была обнаружена на уровне 120-150 нг / мл в день 3 и удерживаются до 5 недель в Ad-IFN-γ, но не в группе LacZ. Аорты собирали через 5 недель после инъекции аденовируса для гистологического анализа и оценки морфометрического артерии трансплантата интимы, медиа просвета и сосуд области. Экспрессия IFN-γ, но не LacZ управления, индуцированной неоинтимы. Нет очевидных инфильтрацией лейкоцитов не был обнаружен по сравнению с аллотрансплантата модели (фиг. 2В). Эти данные согласуются с предыдущиминаблюдений в гуманизированными модели ксенотрансплантатом мышь, которая IFN-γ уже достаточно, чтобы вызвать неоинтимы 15, 17.
Рисунок 1. Иллюстрации и схемы мыши аллотрансплантата модели артерии трансплантации. А. иллюстрации аллотрансплантата процедуры трансплантации. Сегмент доноров мужчин грудную аорту хирургически вставляются в брюшную аорту в женском получателя. Аорты собирали через 4 недели после трансплантации. В качестве контроля сегменте мужчины-донора грудную аорту хирургически вставляются в брюшную аорту в мужском получателя. B. Гистологический анализ артерии трансплантатов по Elastica-ван Гизону (ГО), H & E и иммунным с анти-SMA-и анти-CD45. Представитель микрофотографии показаны. Стрелки отмечают внутренней упругой пластинки, чтобы очертить интиме с носителя. Шкалабар: 50 мм. Нет атеросклероза трансплантата не наблюдалось у мужчин и парней.
Рисунок 2. IFN-γ-индуцированную сингенных мышей артерии модели трансплантации. А. Схема IFN-γ-индуцированную сингенных мышей модели. Мужчины-донора грудной артерии рассекают и пересадили в брюшную аорту в мужской получатель IFN-Гд мышей KO. Через неделю после операции, 1X10 9 PFU Ad-mIFN-γ или Ad-LacZ вводился в мышей-реципиентов через яремную вену. Сыворотку собирали на 3, 7 и 35 после инъекции вирусов для IFN-γ измерения. Трансплантатов было собрано 6 недель для оценки морфометрических. B. Гистологический анализ артерии трансплантатов иммунным окрашиванием с анти-SMA-и анти-CD45. Представитель микрофотографии показаны. Стрелки отмечают внутренней упругой пластинки, чтобы очертить интиме с носителя. Масштаб BА.Р.: 50 мм. Нет трансплантат артериосклероз не наблюдалось LacZ группы.
| Шаг | Проблема | Возможная причина | Решение |
| 2,17 | Сильное кровотечение | Зазор (расстояние между двумя стежками) является слишком большим, в частности узловыми швами. | Расстояние между каждыми двумя стежками должно быть равномерным во анастомоза. Добавить один стежок на кровоточащий участок. |
| Только адвентиции сшиты. | Выявление и шить всю стену аорты | ||
| Unligated филиалы пиломатериалов | Лигирование пиломатериалов филиалы | ||
| Использование слишком большого количества гепарина | Использование до 40 мл / кг гепарином (100 ЕД / мл) физиологического раствора для орошения операционного поля во время анастомоза. | ||
| 2,19 | Тромбоз | Световой поток слишком узок в месте анастомоза, в частности непрерывного швов. | Избегайте слишком много анастомозирующими стенки аорты на каждой строчке. Аорты размер мышь очень мала. Чтобы стежок слишком много стенки аорты во время анастомоза вызовет узким просветом и тромбоз, однако, чтобы сшить слишком мало стенки аорты приведет к серьезным кровотечением. |
| Шов проходит через стенки аорты на противоположной стороне. | Выявление стенке аорты, а затем сделать швы. Если это случилось, то оператор должен отрезать узел шва и повторно стежка на этом сайте. | ||
| Эндотелиальные клетки ранен во анастомоза. | Использование пребывания швов для анастомоза. Не держите / выжать весь arotic стене длябелые грибы для анастомоза. | ||
| Гепарин не используется во время анастомоза. | Аорты размер мышь очень мала. Это очень легко для формирования тромбозов в трансплантатов после анастомоза. Предоставление гепарина для орошения полевой хирургии очень важно для снижения тромбоза. Успешность сосуд трансплантации у мышей составляет около 50%, без использования гепарина и 95-100% с использованием гепарина. Если тромбоз найден в течение нескольких минут после восстановления кровотока, альтернативный подход к тромбозу удалить это вводить 30-50 ул heparinied солевой раствор (100 ед / мл) через IVC. Не вводить слишком много гепарина только в случае серьезного кровотечения. | ||
| 2,23 | Трансплантация не удалось | Позднее кровотечение и тромбоз или других | Судно трансплантации у мышей очень трудно хирургии аорты размер мышь очень мала. Есть три ключевых POIНТС для успешной операции: 1) Убедитесь, что стенки аорты и принимающих донора анастомозируют друг с другом без зазора, очевидно, только в случае сильного кровотечения, 2) оставляйте достаточно места просвета анастомоза, на всякий случай тромбоза; 3) использование гепарина в правильной дозе в течение анастомоза, на всякий случай тромбоза и сильное кровотечение. После этого протокол, вероятность успеха для автора более 95%. |
Таблица 1. Таблицу неисправностей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанные протоколы ориентированы на мышиных моделях GA. Процедуры могут быть применены к другим трансплантат модели трансплантации. Эти модели включают гуманизированные ксенотрансплантата (т.е. человеку сегментов коронарных артерий вставлены в инфра-почечной аорты иммунодефицитных мышей) и острое отторжение мышь GA модель (например, мышь аорты от одного генетического рода в другую генетическую штамма-реципиента). Наши описанных моделях мышей больше, чтобы закрыть поражений у человека, GA. Первая модель предполагает вмешательство судна сегмент от самца мыши в женский получателем же инбредной линии (C57BL/6J). Отторжение трансплантата в этом случае направлены только против минорных антигенов гистосовместимости, кодируемый хромосомой Y (присутствует в мужчин, но не женщин) и отказ ответ, который наступает достаточно ленивым сохранить доноров полученные клетки гладких мышц в течение нескольких недель 2, 6 , 8-10, 12, 14. Вторая модель включает в себя промежуточные артерии segmeнт от дикого типа C57BL/6J мыши донора в организм хозяина мыши той же самой линии и пол, который испытывает недостаток рецептора IFN-γ (IFN-Гд-KO) с последующим введением мышь IFN-γ (доставляется через заражение мышей печень с аденовирусной вектора.) Там не бывает случаев отказа в этом случае, как донора и реципиента мышей той же линии и пола, но донором гладкомышечных клеток размножаться в ответ на цитокины в то время как хозяин клеток, полученных, не имея рецепторов для этого цитокина, 21 не реагируют. Кроме того, обратным скрещиванием дополнительных генетических изменений в сосуд доноров, обе модели могут быть использованы для оценки влияния специфических генов на IFN-γ управляемой пролиферации клеток гладких мышц и GA прогрессии.
Роль IFN-γ в мышиных моделях GA не была хорошо известна. Наши две модели мышей проверили роль IFN-γ в GA мыши. В первой модели, мужской аорты донора пересаживается в женский род получателятак, что хозяин аллореактивных вызывает опосредованный Т-клетками аллоиммунная ответ против конкретного мужчины незначительные HY антиген гистосовместимости экспрессируются на трансплантаты 12. Действительно, WT (C57BL/6J) мужчин и женщин C57BL/6J трансплантация индуцированных Г.А., характеризуется инфильтрацией лейкоцитов и неоинтимы с VSMC накопления. В отличие от мужчины к мужчине трансплантации аорты не вызывает GA. Мы определили роль IFN-γ сигнализации в клетках сосудов с помощью IFN-Гд-KO в качестве донора пересаживают трансплантат WT женщины-получателя. Удаление IFN-Гд в донорских трансплантатов притупляются лейкоцитарной инфильтрации и VSMC накопления в неоинтима. Таким образом, роль IFN-γ в текущей модели мыши согласуется с гуманизированным модели ксенотрансплантата мыши трансплантации, где IFN-γ сигнализации в трансплантат является критическим для GA прогрессии 4, 15, 17, 18. Мы определили, если IFN-γ уже достаточно, чтобы вызвать образование неоинтимы путем создания IFN-γ-медицинскиеated мыши сингенную трансплантата атеросклероз модели. В этой модели мужской аорты пересаживают в мужской IFN-Гд-KO животного-реципиента, в котором мышь IFN-γ затем системно выраженные внутривенно инъекции репликации аденовирус-дефицитных мышей кодирующего IFN-γ трансген (Ad-IFN-γ ). Мы наблюдали, что экспрессия IFN-γ, но не LacZ управления, индуцированный неоинтимы. В этой модели нет очевидных инфильтрацией лейкоцитов не обнаружено сравнению с аллотрансплантата модели, в соответствии с предыдущими наблюдениями в человеческом артерии-SCID модель трансплантации мыши, в котором сосудистых IFN-γ сигнализации уже достаточно, чтобы вызвать образование неоинтимы в отсутствие лейкоцитов 15, 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами NIH R01 HL109420 для WM и AHA 9320033N к LY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks) |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml) |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml) |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml) |
| Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride) | CareFusion | AL4109 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | To prepare the anesthetic |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Microscope | Leica | MZ95 | |
| Micro Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5693 | |
| Spring Scissors | F.S.T | 15009-08 | To transect the aorta of donor or recipient |
| Extra Narrow Scissors | F.S.T | 14088-10 | |
| Needle Holder/Forceps | MICRINS | MI1542 | To hold the needle |
| Fine Forceps | F.S.T | 11254-20 | |
| Forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Forceps | F.S.T | 13011-12 | |
| LANCASTER Eye Speculum | Zepf Medical Instruments | 42-1209-07 | |
| Micro Vascular Clip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6472 | |
| Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5440 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture | AROSurgical Instruments Corporation | Cat #T4A10Q07 | 10-0 suture, Needle=70 microns |
| Black Monofilament Nylon Suture | Syneture (Covidien) |
SN-1956 | 6-0 suture |
| Non-Woven Songes | McKesson Corp. | Reorder No. 94442000 | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | REF 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 18G 1 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305196 | |
| 25G 7/8, Hypodermic Needle | BD | REF 305124 | |
| 27G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305109 | |
| 30G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305106 | |
| Hearting Pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
- George, J. F., Pinderski, L. J., Litovsky, S., Kirklin, J. K. Of mice and men: mouse models and the molecular mechanisms of post-transplant coronary artery disease. J. Heart Lung Transplant. 24, 2003-2014 (2005).
- Koulack, J., McAlister, V. C., MacAulay, M. A., Bitter-Suermann, H., MacDonald, A. S., Lee, T. D. Importance of minor histocompatibility antigens in the development of allograft arteriosclerosis. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 273-277 (1996).
- Libby, P., Pober, J. S.
- Lorber, M. I., Wilson, J. H., Robert, M. E., Schechner, J. S., Kirkiles, N., Qian, H. Y., Askenase, P. W., Tellides, G., Pober, J. S. Human allogeneic vascular rejection after arterial transplantation and peripheral lymphoid reconstitution in severe combined immunodeficient mice. Transplantation. 67, 897-903 (1999).
- Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
- Mitchell, R. N.
- Mitchell, R. N. Graft vascular disease: immune response meets the vessel wall. Annu Rev Pathol. 4, 19-47 (2009).
- Nagano, H., Libby, P., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Stinn, J. L., Becker, G., Tilney, N. L., Mitchell, R. N. Coronary arteriosclerosis after T-cell-mediated injury in transplanted mouse hearts: role of interferon-gamma. Am. J. Pathol. 152, 1187-1197 (1998).
- Nagano, H., Mitchell, R. N., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Tilney, N. L., Libby, P. Interferon-gamma deficiency prevents coronary arteriosclerosis but not myocardial rejection in transplanted mouse hearts. J. Clin. Invest. 100, 550-557 (1997).
- Raisanen-Sokolowski, A., Glysing-Jensen, T., Koglin, J., Russell, M. E. Reduced transplant arteriosclerosis in murine cardiac allografts placed in interferon-gamma knockout recipients. Am. J. Pathol. 152, 359-365 (1998).
- Salomon, R. N., Hughes, C. C. W., Schoen, F. J., Payne, D. D., Pober, J. S., Libby, P. Human Coronary Transplantation-Associated Arteriosclerosis - Evidence for a Chronic Immune Reaction to Activated Graft Endothelial Cells. Am. J. Pathol. 138, 791-798 (1991).
- Scott, D. M., Ehrmann, I. E., Ellis, P. S., Chandler, P. R., Simpson, E. Why do some females reject males? The molecular basis for male-specific graft rejection. J. Mol. Med. 75, 103-114 (1997).
- Shimizu, K., Sugiyama, S., Aikawa, M., Fukumoto, Y., Rabkin, E., Libby, P., Mitchell, R. N. Host bone-marrow cells are a source of donor intimal smooth- muscle-like cells in murine aortic transplant arteriopathy. Nat. Med. 7, 738-741 (2001).
- Tellides, G., Pober, J. S.
- Tellides, G., Tereb, D. A., Kirkiles-Smith, N. C., Kim, R. W., Wilson, J. H., Schechner, J. S., Lorber, M. I., Pober, J. S. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
- Vassalli, G., Gallino, A., Weis, M., von Scheidt, W., Kappenberger, L., von Segesser, L. K., Goy, J. J. Alloimmunity and nonimmunologic risk factors in cardiac allograft vasculopathy. Eur. Heart J. 24, 1180-1188 (2003).
- Wang, Y., Bai, Y., Qin, L., Zhang, P., Yi, T., Teesdale, S. A., Zhao, L., Pober, J. S., Tellides, G. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ. Res. 101, 560-569 (2007).
- Wang, Y., Burns, W. R., Tang, P. C., Yi, T., Schechner, J. S., Zerwes, H. G., Sessa, W. C., Lorber, M. I., Pober, J. S., Tellides, G. Interferon-gamma plays a nonredundant role in mediating T cell-dependent outward vascular remodeling of allogeneic human coronary arteries. Faseb J. 18, 606-608 (2004).
- Yacoub-Youssef, H., Marcheix, B., Calise, D., Thiers, J. C., Benoist, H., Blaes, N., Segui, B., Dambrin, C., Thomsen, M. Chronic vascular rejection: histologic comparison between two murine experimental models. Transplant. Proc. 37, 2886-2887 (2005).
- Yokota, T., Shimokado, K., Kosaka, C., Sasaguri, T., Masuda, J., Ogata, J. Mitogenic activity of interferon gamma on growth-arrested human vascular smooth muscle cells. Arterioscler. Thromb. 12, 1393-1401 (1992).
- Yu, L., Qin, L., Zhang, H., He, Y., Chen, H., Pober, J., Tellides, G., Min, W. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting IFN-γ-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Cir. Res. 109, 418-427 (2011).
