Summary
Skivekulturer lette manipulationen af embryo udvikling ved gen og farmakologiske forstyrrelser. Dog skal dyrkningsbetingelser sikre, at normal udvikling kan fortsætte inden for det reducerede miljø skive. Vi illustrerer en protokol, der letter normal rygmarv udvikling kan fortsætte i mindst 24 timer.
Abstract
Skivekulturer kan lette manipulation af embryo udvikling både farmakologisk og gennem gen manipulationer. I denne reduceret system kan potentielle letale bivirkninger som følge af systemisk lægemiddel ansøgninger overvindes. Dog skal dyrkningsbetingelser sikre, at normale udvikling fortsætter i den reducerede miljø i skive. Vi har fokuseret på udviklingen af rygmarven, og herunder af spinale motoriske neuroner. Vi varieres systematisk dyrkningsbetingelser for kyllingeembryofibroblaster skiver fra det punkt, hvor de fleste spinale motorneuroner var blevet født. Vi analyserede antallet og typen af motorneuroner, der overlevede i dyrkningsperioden og positionen af disse motorneuroner sammenlignet med in vivo. Vi fandt, at serum-type og neurotrofiske faktorer blev påkrævet under dyrkningsperioden og kunne holde motorneuroner i live i mindst 24 timer og tillade disse motorneuroner at migrere til passende positioner irygmarv. Vi præsenterer disse dyrkningsbetingelser og metoder til fremstilling af embryo skivekulturer hjælp udtaget kyllingeembryoner indlejret i agarose og skåret med en vibratome.
Introduction
Under normal embryo udvikling, er mange forskellige celletyper genereret som skal migrere fra deres udgangspunkt, hvor de i sidste ende vil fungere i den modne organisme. Inden for den udviklende rygmarv, der progenitorceller placeret i den ventrikulære zone ved midterlinjen og generere mange undertyper af postmitotiske neuroner og gliaceller, der skal migrere til at integrere i funktionelle neuronale kredsløb er nødvendige for sensorisk forarbejdning og motorudgange 1. Spinal motoriske neuroner, der styrer kontraktion af lemmer muskler er blevet grundigt undersøgt, og meget er kendt af molekylerne og mekanismer, der driver dannelsen af deres forskellige underklasser. Imidlertid er langt mindre kendt af de mekanismer, der motorneuroner vandrer, adskille og modtage synaptiske input.
Motor neuron subtype identitet er erhvervet under udvikling i en hierarkisk måde. Motorneuron subtyper kan groft klassificeres inFor adskilte søjler, divisioner og puljer, som er defineret ved deres axon fremskrivninger. Motor kolonner projektet axoner til enten aksiale, viscerale eller lemmer muskler. Motor divisioner underinddele lemmet fremspringende motoriske neuroner i den laterale motor kolonne (LMC) i dem rager til ventrale eller dorsale muskler 2. Inden for de divisioner, kaldet klynger af motorneuroner motor puljer projekt til enkelte muskler i benet 2, 3. Limb-udragende motorneuroner er defineret ved deres ekspression af transkriptionsfaktor Foxp1 4, 5, medens udskilte identitet er kendetegnet ved ekspressionen af homeodomænet transkriptionsfaktorer Islet-1 (ventralt ragende) eller Lhx-1 (dorsalt ragende) 6. Faktisk er Lhx-1-ekspression krævet for den pågældende dorsale fremskrivninger af motorneuroner 7. Hver af disse undertyper indtager distinkte positioner i rygmarven, ventrale fremspringende motorneuroner kommer til at opholde sig medialt for dorsalt projecting motorneuroner. Dette resulterer i LMC blive opdelt i såkaldte LMCmedial (LMCm) og LMClateral (LMCl) divisioner. Divisional og motor pool organisation er erhvervet i to faser 8. I den første fase, der er divisionsdirektør adskillelse opnås via en migration af motoriske neuroner i en karakteristisk medialt for laterale mode. De LMCl celler genereres efter LMCm celler og så LMCl migrerer gennem LMCm at nå sin endelige bundfældning position. Den anden fase tager motorneuroner i en division og klynger dem i motorneuroner puljer, formentlig via en dorsal-ventral sortering af de motoriske neuroner. Medlemmer af catenin-afhængige klassiske cadherin familien har vist sig at være afgørende for begge faser af motorneuroner organisation 8-10. Men hvordan cadherin styrer cellebevægelse dårligt forstået.
Købet af kolonneformat, divisions-og pool identiteter kræver ekstrinsiske signaler, mønster intrinsic ekspression af transkriptionsfaktorer 11. Derudover har omkring 50% af alle motoriske neuroner dør via apoptose under normal udvikling i en proces, der kræver ekstrinsiske signaler fra lem, i vid udstrækning gennem neurotrof støtte til motor neuron overlevelse. Således motor neuron udvikling kræver det rette miljø kan opretholdes over en relativt lang tidsforløbet. Derfor kræver de praktiske forhold ved frembringelse rygmarven skivekulturer at opretholde motor neuron overlevelse belysning af passende dyrkningsbetingelser. Tidligere embryo skivekulturer er blevet anvendt til at følge adfærd extrinsically tilsat oprenset neuronpopulationer 12-14. Imidlertid har vores viden dyrkningsbetingelser, der letter in situ motor neuron overlevelse og migration inden for skive sig selv ikke er blevet offentliggjort. Vi modificeret en standardkultur tilstand, der letter overlevelse af oprenset, til dissocierede kraniale motorneuroner lette mOTOR neuron udvikling inden for et foster skive kultursystem. Vi har også overvåget positioneringen af de overlevende motoriske nerver og viser, at stort set normale positioner for motor neuron-område er opnået under dyrkningsperioden.
Protocol
1. Gør Krævede Solutions
- 1 M phosphatbuffer:. Afvejes 109,4 g Na 2 HPO 4 og 32 g NaH 2 PO 4 H 2 0, blandes og opløses i vand til samlet rumfang på 1 liter.
- Phosphatbufret saltvand (PBS): Der laves 0,1 M phosphatpuffer, 0,15 M NaCl. 100 ml PBS skulle være tilstrækkeligt til behandling af skiver fra 10 embryoner.
- Agarose: Heat PBS-opløsning til omkring 70 ° C, og der tilsættes fast lavtsmeltende agarose langsomt under omrøring kontinuerligt. Gøre opløsningen til en slutkoncentration på 4% (w / v) agarose. Lav en bestand af 50 ml af denne opløsning. Lad denne opløsning i vandbad holdt ved 48 ° C indtil brug. Enhver agaroseopløsning ubrugt efter forsøget kan opbevares ved 4 ° C i adskillige uger.
- Antistof blok: Tilsæt føtalt kalveserum og triton X-100 til en endelig concentrtion på 1% (vol / vol) føtalt kalveserum, 0,1% (volumen / volumen) Triton X-100 i PBS. 10 ml blok opløsning være tilstrækkelig til immunfarvning af 5 lysbilleder af cryostatsnit.
- Fikseringsvæske: Forbered 0,75 mm NaOH, 4% (vægt / volumen) paraformaldehyd (PAS). Til fremstilling fiksativ varme nødvendig mængde vand til 70 ° C tilsættes koncentreret NaOH til den ønskede slutkoncentration, tilsættes fast paraformaldehyd og bland indtil opløsning. Cool på is til 4 ° C. 10 ml af denne opløsning være tilstrækkelig i 20 brønde af embryo skiver.
- Sucroseopløsning: fremstilling af 10 ml af en 30% (vægt / volumen) saccharoseopløsning indeholdende 0,1 M phosphatbuffer. 10 ml af denne opløsning være tilstrækkelig i 10 brønde af embryo skiver.
- 70% (v / v) Ethanol. Fortyndes 70 ml absolut ethanol med 30 ml vand.
- Dyrkningsmedium: Der fremstilles en opløsning af 1% kyllingefoster ekstrakt, 1% penicillin / streptomycin, 0,35% L-glutamin, 0,1% 2-mercaptoethanol, 4% chicken serum, 2% B27 supplement og 100 ng / ml ciliaryneurotrophic vækst faktor (CNTF) alle fortyndet i Neurobasal medium, fremstillet på is og anvendes den samme dag. 10 ml dyrkningsmedium kræves i 20 brønde af embryo skiver.
2. Hønseembryo Preparation
- Sted befrugtede hønseæg med den længste side vandret i en blæser inkubator ved 38 ° C, indtil de udvikler til trin 15 24. Dette kræver sædvanligvis cirka 4 dages inkubation.
- På den anden dag med inkubation, steriliseres æggeskallen ved aftørring med en serviet vædet med 70% ethanol. Omhyggeligt gennembore den flade ende af æggeskallen ved anvendelse af en 21 gauge nål fastgjort til en 5 ml sprøjte og fjern 5 ml albumin. Dette sænker embryo væk fra skallen, så embryonet ikke beskadiges, når tanken er åbnet. Returnér æg til rugemaskine og inkubere dem i yderligere 2 dage.
- Brug stump DuMont # 5 pincet carefully gennembore den øverste midten af skallen og fjerne omkring 9 cm 2 i skallen. Skær rundt om embryo og forsigtigt løfte ud embryonet og sted i HBSS under dissektion. Disse embryoner skal iscenesættes i henhold til Hamburger og Hamilton (1992) 15. Alle anvendte embryoner bør være tæt på stadium 24. Eventuelle embryoner, der viser tegn på abnormitet skal kasseres.
- Fjern amnion membran, chorio-allantoiske membran, hovedet, og allantois med to DuMont # 5 pincet. Eviscerate embryonet at fjerne alle indre organer. For at gøre dette, skar ventrale midterlinjen af foster med mikro dissekere saks, skal du holde fosteret omkring rostrale bagagerum region med et par pincet, tag fat i rostrum del af tarmen og hjertet og træk caudalt. Det er vigtigt, at dette sker rent. Du bør være i stand til at se fosteret somitter tydeligt. Skær embryo på midten på tværs mellem de øvre og nedre lemmer buds.Now trimme thorax organvæggen ved hjælp af mikrodissektions saks.
3. Embryo Slice Forberedelse
- Fjern agaroseopløsningen af vandbadet. Skær 5 cm fra bunden af en engangs 3 ml plastik Pasteur pipette.
- Fjern forsigtigt lumbar halvdel af det dissekerede embryo ved hjælp af to pincet til vugge kimen ud af dissektion løsning og sted i en tør petriskål. Ved hjælp af Pasteur-pipette, omkring 2 ml agarose fjerne, pipette cirka 0,5 ml oven af embryonet og derefter opsuge embryoet skive ind i pipetten. Overfør embryo og agarose til en skræl væk plast skimmel passe på ikke at indføre bobler i agarose. Sænk forsigtigt embryonet til bunden af agarose i plast skimmel med den thorakale sektion nedad. Embryonet skal placeres at være lige under anvendelse af en 21 gauge nål. Skiverne vil også indeholde en del af det udviklende lem, og det er vigtigt, at orienteringen af embryoet i agarenOSE vil tillade dette. Anbring båden på is for at indstille agarose. Pas på, at embryonet ikke ændrer retning i denne periode (ca. 2 min).
- Leica VT1000S vibratome (Speed 3, Frekvens 4, 400 um tykke skiver) bør oprettes med udskæring kammer fyldt med HBSS og omgivet af iskoldt vand. Den agarose blokken derefter fast på vibratome platform med superlim. The agarose blokken trimmet med et barberblad til at forlade embryo stykke med 1-3 mm af agarose omkring den. Skiverne, der omfatter lem-knop sektioner med en klar apical ectodermal rigde udvælges og disse skiver anbringes derefter i HBSS. Generelt er der kun 1-2 egnede skiver pr embryo. Forsigtigt fjerne agarosen omkring vævssnit ved brug af to nåle. Det er vigtigt, at dette sker grundigt og omhyggeligt.
4. Dyrkning af Embryo Slices
- 500 ml kulturopløsning (beskrevet ovenfor) til required antal brønde af en 24-brønds ultralav binding behandlet vævskulturplade. Overfør skiver forsigtigt fra HBSS opløsning ind i brønden. Generelt forsøger vi at have to til tre skiver i hver brønd. Placer 24-brønds plade i vævskultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 i 24 timer.
5. Sektionering af Slices for Immunfarvning
- Efter dyrkningsperioden, 500 pi upufret fix tilsættes til hver brønd i embryo skiver og lad på is i 20 minutter. Den samlede opløsning fjernes derefter forsigtigt og tre PBS-vaskninger gennemføres, med 5-minutters intervaller. Skiverne er derefter efterlades i saccharose-opløsning ved 4 ° C, indtil skiverne sink, omkring 6 timer, men kan stå i længere tid (eksempelvis om natten).
- Fjern skiver og Dup ekstra sucroseopløsning og ligevægt i omkring 1 ml OLT omkring 5 minutter ved 20 ° C. Monter hver skive flad i et OLT-fyldt skræl væk plast skimmel.Efter montering, skal du placere formene lodret på tøris til at størkne.
- Montere oktober blokke i kryostaten og ækvilibrere blokkene ved -24 ° C i omkring 20 min. Skær hver skive med 15 mm sektioner monteret på SuperFrost-Plus dias. Objektglassene kan opbevares ved -80 ° C indtil de skal bruges.
6. Immunofluorescens
- Pipette 1-2 ml PBS på de horisontale objektglas opbevares i et fugtigt kammer med objektglassene rejst fra bunden af kammeret (vi bruger 1 eller 2 ml plast-pipetter fikseret med autoklav tape). Inkubér sektionerne i PBS i 5 minutter ved 20 ° C for at fjerne overskydende oktober Fjern PBS-opløsningen fra objektglasset, og 500 ml blokopløsning over sektioner, inkuberes i 30 minutter ved 20 ° C. Fjerne blokken opløsningen og straks tilsættes 500 ml fortyndet primært antistof tilsat til objektglas, inkuber ved 4 ° C i 18-22 timer.
- Fjern primær antistofopløsning og straks blevh objektglassene med 1 ml PBS i 5 minutter, tre gange ved 20 ° C til fjernelse af overskydende primær antistofopløsning. 500 ml fortyndet, sekundært antistof over sektioner. Objektglassene hvorefter den henstod ved 20 ° C i 30 minutter. Det sekundære antistof Opløsningen fjernes derefter, og objektglasset blev vasket 3 gange 5 minutter i PBS ved 20 ° C.
- Efter disse vaske den endelige PBS vask, ising kanten af slæden for at fjerne overskydende PBS fjerne, tilføje to dråber Vectashield på diasene og forsigtigt lægge et dækglas over de sektioner, så man undgår bobledannelse. Fjern overskydende Vectashield ved at duppe fra kanten af dias før billeddannelse.
7. Imaging
- Billede af immunofarvede sektioner. Vi bruger et Nikon Eclipse E80i fluorescensmikroskop udstyret med en Hamammatsu ORCA ER digitalkamera og 10 X, 20x og 40 X objektive linser.
Representative Results
Brugen af dyrkede skiver til at følge udviklingen i interneuron og projektion neuroner har været indflydelsesrige i forløber vores forståelse af den generation af organisation inden for cortex 16. I rygmarven, har motor neuron udvikling blevet fulgt ved hjælp af kulturer af hele zebrafisk embryoner 17. Imidlertid spinal motor neuron organisation i zebrafisk er forholdsvis enkel (på grund af manglen på store led muskler i fisk). De molekylære mekanismer, der driver et hierarki af spinal motor neuron organisation under udviklingen af højere hvirveldyr er i øjeblikket dårligt forstået. Dyrkningsbetingelser der letter neuron overlevelse og celle krop migration i embryo skivekulturer af højere hvirveldyr er således påkrævet. I øjeblikket har rygmarven skivekulturer af højere hvirveldyr blevet anvendt til frø dissocierede neuroner oven på skiverne 12-14, undersøge fluorescensmærkede axoner i periferien af skiven18 eller progenitorcelle adfærd i begyndelsen rygmarv udvikling 19.. Skær dyrkningsbetingelser for senere rygmarv, især dem, der opretholder motor neuron udvikling i øjeblikket mangler.
At forsøge at følge spinal neuronal udvikling, og herunder af spinale motorneuroner, vi undersøgt forskellige dyrkningsbetingelser, der kan fremme motor neuron overlevelse og erhvervelse af første orden i motor organisation gennem lateral migrering af neuronerne. Indledende forsøg med trin 18 til trin 20 hønseembryo rygmarven skiver viste sig frugtesløse, og vi var ikke i stand til at holde motorneuroner i live i længere tid end et par timer og var ude af stand til at påvise dannelsen af et betydeligt antal LMCl celler over kulturen periode (data ikke vist). Vi har derfor undersøgt skivekulturer af trin 24 embryoner, en tidspunkterne, hvor størstedelen af LMCl og LMCm neuroner er blevet genereret, men da LMCl neuron migration er stadig i sin infancy (figur 1a-c). Denne laterale migration af LMCl neuroner er stort set fuldstændig ved trin 27, omkring 24 til 36 timer senere (Figur 1 df). Vores assay kan således forenkles til at kunne holde neuroner i live og lette deres migration sideværts ind i ventrale horn. Vi begyndte vores eksperimenter med relativt enkle dyrkningsbetingelser, der indeholder lige Hanks balancerede saltopløsning med eller uden kylling serum eller kyllingefoster ekstrakt. I alle tilfælde, selv om vi var i stand til at opretholde LMC neuroner i skive fandt vi ingen tegn på LMCl neuroner fastholdes (i det mindste ved ekspression af Lhx-1). Vi har endvidere fundet upassende ekspression af gener, såsom HB9 i den dorsale rygmarv, en situation, der ikke forekommer in vivo (data ikke vist). Således er disse enkle dyrkningsbetingelser er ikke egnet til undersøgelse af købet af motorneuroner organisation.
Vi har således opsøgte mere kompleks conditions og som base anvendes en formulering der er blevet udgivet for at lette overlevelse dissocierede embryonale kylling kraniale motorneuroner. Denne tilstand 20 (1% chick embryo ekstrakt, 1% Pen Strep, 0,35% L-glutamin, 0,1% 2-mercaptoethanol, 2% hesteserum, 2% B27 supplement og 50 ng / ml ciliaryneurotrophic vækst faktor (CNTF) i Neurobasal medium (her kaldet Guthrie medium) gjorde holde flere motorneuroner i live end de mere simple medier. Desuden var det ikke resultere i falsk udtryk for transkriptionsfaktorer i den dorsale rygmarv. Men overlevelse LMCl neuroner var fattige (figur 1 gi, p). Derfor varieres hvad vi anses for at være nøglefaktorer i Guthrie medium, nemlig den animalske oprindelse af serumet, koncentrationen af serum og koncentrationen af CNTF i mediet. Vi fandt, at ændring af serum fra Hesteserum til Chick serum og en stigning i koncentrationen af CNTF fra 50 ng / ml til 100 ng / ml væsentlig forøgelse tHan overlevelse LMCl og LMCm celler og også tilladt deres vandring ind i den ventrale horn over 24 timer af kulturbetingelserne (fig. 1 jl, p). Det totale antal af motorneuroner, forholdet mellem LMCm til LMCl og også migrationen af de LMCl celler i den ventrale horn optrådte meget ligner dele af embryoer, der havde fået lov til at udvikle sig in ovo i stedet for i udsnit kultur (fig. 1 ko, p). Således mener vi, at baseret på transkriptionsfaktor ekspression, celleantal og placering af motorneuroner, rekapitulere vores skive dyrkningsbetingelser normale spinal motor neuron udvikling mindste over en 24 timers periode.
Figur 1. a - c. Status for generering af LMC (Foxp1 farvning ib) og LMCl (Lhx-1-farvning i en) i første etape 24. c er en sammenfletning af de to kanaler. Midterlinjen er vist som en stiplet linie i en og D, V viser orienteringen af dorsoventral (D, V) akse rygmarven d -. F.. . Status for LMC (Foxp1 farvning i d) og LMCl (Lhx-1-farvning i e) organisation på trin 27 f er en sammenskrivning af de to kanaler g -. Jeg. Lhx-1 (g) og Foxp1 (h) ekspression i sektioner af en skive dyrkes i et medium, der understøtter kraniel motorneuroner celleoverlevelse (Guthrie medium, vores "første medium" se reference 20). Lhx-1 ikke udtrykkes i motorneuroner, selvom der er nogen overlevelse af LMC-celler fremgår af Foxp1 ekspression. D, V (g) viser retningen af den dorsoventral (D, V) akse rygmarven. ML viser orienteringen af mediolateral (M, L) akse sPinal ledning j - l. LMCl celler (Lhx-1 i den ventrale horn i j) og LMC generelt (Foxp1 i k) kan observeres i skiver dyrket i medium indeholdende 4% chick serum og 100 ng / ml CNTF. Bemærk, at nogle LMCl celler findes i en sideværts stilling i det ventrale horn. Pilen i (j) viser den laterale stilling af nogle af de LMCl celler. (L) er en sammenfletning af de to kanaler m -. O.. Status for ekspression af Lhx-1 (m) og Foxp1 (n) i sektioner af et embryo holdes in ovo i løbet af skive dyrkning af embryonet vist i j - l. (O) er en sammenfletning af de to kanaler. P. Kvantificering af procentdelen af LMCl (Foxp1 + ve / Lhx1 + ve)-celler versus LMC (Foxp1 + ve / Lhx1-ve) celler findes i skivekulturer i forskellige betingelser compared til kontrol embryoer, der holdes i ovo (som repræsenterer 100%). Students t-test *** repræsenterer p <0,01. Klik her for at se større figur .
Discussion
Protokollen beskrevet her tillader en kyllingefoster skive, der skal inkuberes i mere end en dag og samtidig holde motoriske neuroner i live og fortsætter med at migrere under dyrkningsperioden. I udredningen af betingelserne for at holde motorneuroner i live, har vi identificeret flere vigtige nødvendige funktioner. Det forekommer, at op til 4% chick serum er kritisk for overlevelsen af motorneuroner og afløst med serum fra en anden art ikke tolereres. Interessant nok fandt vi, at tilstedeværelsen af højere koncentrationer af serum var skadelige for skiverne som de fremmede overvækst af væv, der fører til grove forvridninger i udsnit form. Hvad vigtigere er, tilstedeværelsen af cilliary neurotrofisk faktor også vist sig kritisk. Det er en klar mulighed, at skiverne kan være i stand til at blive dyrket i betydeligt længere perioder end 24 timer, måske endda tillader visualisering af sensorisk afferent input til rygmarven. Derudover cultidige forhold her kan også være nyttigt at skære kulturer i udviklingslandene hjernestammen og midthjernen / cerebellum.
Måske den største potentiel fordel ved anvendelsen af disse skive kulturbetingelser er, at de letter mulighed for farmakologisk manipulering af proteinfunktion samtidig minimere potentialet for skadelige virkninger på resten af embryonet, såsom hjertet. Et stort antal inhibitorer og agonister af forskellige signalveje kan anvendes til at vurdere migrationen af forskellige spinale neuron undertyper og eventuelt deres virkning af dannelsen af lokale spinal kredsløb under udviklingen. Derudover nogle genetiske forstyrrelser af proteinekspression, såsom dem, der gør brug af siRNAs og morpholinogrupper oligonukleotider, lider under, at de kun kan indføres tidligt i udviklingen (på grund af begrænsninger i in ovo elektroporation procedurer) og virkningerne kun vare en kort periode time (typisk en dag). Vores skive kultur er startet på et senere tidspunkt, og giver mulighed for at bruge denne teknologi senere under udvikling på udskæring stadium for at se deres virkninger i den periode, kultur skive.
Den skive kultur protokollen kunne også gøre det muligt visualisering af både spinal motor neuron samt dorsal interneuron migration i realtid via time-lapse video mikroskopi. Dette kan opnås ved hjælp af fasekontrastmikroskopi under hvidt lys eller ved anvendelse af fluorescens-billeddannelse. Hvis den sidstnævnte teknik blev anvendt derefter indførelse af fluorescerende mærker er nødvendig. Dette kan opnås enten ved introduktion af fluorescerende farvestoffer, såsom Dil eller dio via enten retrograd mærkning af lemmet eller anterograd mærkning af ventriklen eller in ovo elektroporation af konstrukter til at drive fluorescerende proteiner i en undergruppe af neuroner.
Disclosures
Ingen af forfatterne har konkurrerende interesser eller interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Sharon prale for mange indsigtsfulde diskussioner og B. Novitch for den slags gave af antistofferne til Foxp1. Dette arbejde, som finansieres af en studentship fra Wellcome Trust til KCT og en projektbevilling fra Wellcome Trust til SRP (Grant referencenummer 094399/B/10/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Henry Stewart Farms, UK | Fertilised Brown Bovan Gold Hen's eggs (Henry Stewart Farms, UK), stored at 14 °C until incubation | |
| 21 Gauge needle | BD-Microlance-3 | 304432 | |
| 5 ml syringe | BD Plastipak | 302187 | |
| #5 Dumont forceps | Roboz | RS 5045 | |
| Micro Dissecting scissors | Roboz | RS 5910SC | (3.5 in straight) |
| Embryo embedding moulds: Peel away moulds | Agar Scientific | G3764 | Pyramidal shaped 22 mm to 12 mm |
| Super glue | Power Flex, Loctite | ||
| Ethanol | SIGMA | 32221 | |
| Sodium di-hydrogen Phosphate, mono-hydrate | BDH | 102454R | |
| Di Sodium mono-hydrogen Phosphate | VWR/ BDH | 102494C | |
| Sodium Chloride | VWR/BDH | 27810.295 | |
| Low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10500-064 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| Sodium Hydroxide | FLUKA | 71689 | |
| Paraformaldehyde | VWR/BDH | 28794.295 | |
| Plastic disposable pasteur pipettes | ElKay Precision laboratory consumables | 127-P503-000 | Liquipette 3 ml volume |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170 | |
| Sucrose | SIGMA | S0389 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | SIGMA | S5761 | |
| Chicken Embryo Extract | Seralabs | CE650-J | |
| Penicillin/ Streptomycin solution | Gibco | 15070 | |
| L-Glutamine solution | Gibco | 25030 | |
| 2-mercapt–thanol | Gibco | 21985 | |
| Horse serum | Southern Group Labs | 9028B | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Neurobasal medium | Gibco | Cat ~ 2103 | |
| CilliaryNeurotrophic factor (CNTF) | R and D Systems | 557-NT-010 | |
| Chick Serum | SIGMA | C5405 | |
| Primary antibodies | were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank, with the exception of anti-foxP1 antibodies, which were a kind gift from Bennett Novitch of UCLA. Primary antibodies dilutions were Rabbit anti-FoxP1 (1/32000), Mouse anti-Lhx1/2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FoxP1 (1/1000). All antibodies were stored at 4 °C. |
||
| Secondary antibodies | Donkey anti-Guinea Pig (cy3) (1:1000) purchased from Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-Rabbit (Alexa Fluor 594) (1:1000) purchased from Invitrogen All antibodies were stored at 4 °C. |
||
| 24-well plate | Corning COSTAR | 3473 | ultralow attachment 24-well plate |
| O.C.T. | Tissue Tek, Sakura | 4583 | Optimum Cutting Temperature |
| Vectashield | Vector Labs | H1000 | Vectashield fluorescent mounting medium |
| Slides | Thermo Scientific | Superfrost-Plus positively-charged slides, 25 x 75 x 1.0 mm | |
| Cover Glass | VWR International | 631-0167 | 25x60 mm |
| Forced draft incubator: | Lyon Electric Company | kept humid by ensuring water levels always sufficient, maintained at 38 °C | |
| Cryostat | Brite, Huntingdon, UK | -36 °C | |
| Tissue Culture Incubator | DH Autoflow | Nuaire 38 °C, 5% CO2 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT1000-S | |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse E80i fluorescence microscope | |
| Digital Camera | Nikon | Nikon DS5M and Hamammatsu ORCA ER |
References
- Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: Inductive signals and transcriptional codes. Nature Reviews Genetics. 1 (1), 20-29 (2000).
- Landmesser, L. Distribution Of Motoneurons Supplying Chick Hind Limb Muscles. Journal of Physiology-London. 284, 371-389 (1978).
- Romanes, G. J. The motor pools of the spinal cord. Progress in Brain Research. 11, 93-119 (1964).
- Dasen, J. S., De Camilli, A., Wang, B., Tucker, P. W., Jessell, T. M. Hox repertoires for motor neuron diversity and connectivity gated by a single accessory factor, FoxP1. Cell. 134 (2), 304-316 (2008).
- Rousso, D. L., Gaber, Z. B., Wellik, D., Morrisey, E. E., Novitch, B. G. Coordinated actions of the forkhead protein Foxp1 and Hox proteins in the columnar organization of spinal motor neurons. Neuron. 59 (2), 226-240 (2008).
- Tsuchida, T., Ensini, M., et al. Topographic organization of embryonic motor-neurons defined by expression of limhomeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
- Kania, A., Johnson, R. L., Jessell, T. M. Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb. Cell. 102 (2), 161-173 (2000).
- Price, S. R., Garcia, N. V. D., Ranscht, B., Jessell, T. M. Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins. Cell. 109 (2), 205-216 (2002).
- Demireva, E. Y., Shapiro, L. S., Jessell, T. M., Zampieri, N. Motor Neuron Position and Topographic Order Imposed by β- and γ-Catenin Activities. Cell. 147 (3), 641-652 (2011).
- Bello, S. M., Millo, H., Rajebhosale, M., Price, S. R. Catenin-Dependent Cadherin Function Drives Divisional Segregation of Spinal Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (2), 490-505 (2012).
- Haase, G., Dessaud, E., et al. GDNF acts through PEA3 to regulate cell body positioning and muscle innervation of specific motor neuron pools. Neuron. 35 (5), 893-905 (2002).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods in Cell Biology. 51 (51), 109-124 (1996).
- Hotary, K. B., Tosney, K. W. Cellular interactions that guide sensory and motor neurites identified in an embryo slice preparation. Developmental Biology. 176 (1), 22-35 (1996).
- Krull, C. E., Tosney, K. Embryo slices and strips: Guidance and adhesion assays in the avian embryo. Methods in Cell Biology: New Methods in Avian Embryology. Bronner-Fraser, M. 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. San Diego. 97-113 (2008).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. (Reprinted From Journal Of Morphology, Vol. 88, 1951). Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Rakic, P. A century of progress in corticoneurogenesis: From silver impregnation to genetic engineering. Cerebral Cortex. 16, I3-I17 (2006).
- Bingham, S. M., Sittaramane, V., Mapp, O., Patil, S., Prince, V. E., Chandrasekhar, A. Multiple mechanisms mediate motor neuron migration in the zebrafish hindbrain. Dev. Neurobiol. 70 (2), 87-99 (2010).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Developmental Dynamics. 236 (12), 3514-3523 (2007).
- Das, R. M., Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium. J. Vis. Exp. (62), e3920 (2012).
- Barnes, S. H., Price, S. R., Wentzel, C., Guthrie, S. C. Cadherin-7 and cadherin-6B differentially regulate the growth, branching and guidance of cranial motor axons. Development. 137 (5), 805-814 (2010).
