Summary
Slice culturen vergemakkelijken de manipulatie van embryo-ontwikkeling van gen-en farmacologische verstoringen. Wel moet kweekomstandigheden ervoor te zorgen dat de normale ontwikkeling kan gaan binnen de verminderde omgeving van de plak. We tonen een protocol dat normale ontwikkeling ruggenmerg vergemakkelijkt men gedurende ten minste 24 uur.
Abstract
Slice culturen kan zijn voor de manipulatie van embryo-ontwikkeling zowel farmacologisch en door middel van genetische manipulaties. In dit systeem verlaagd kunnen potentiële dodelijke bijwerkingen van systemische geneesmiddel toepassingen worden overwonnen. Wel moet kweekomstandigheden ervoor te zorgen dat de normale ontwikkeling opbrengst binnen de gereduceerde omgeving van de plak. We hebben gericht op de ontwikkeling van het ruggenmerg, in het bijzonder die van spinale motorische neuronen. We systematisch gevarieerd kweekomstandigheden van kippenembryo plakjes vanaf het punt waarop de meeste spinale motorische neuronen was geboren. We getest het aantal en type van motorneuronen dat tijdens de kweekperiode en de positie van de motorneuronen in vergelijking met die overleefden in vivo. We vonden dat serum type en neurotrofe factoren vereist tijdens de kweekperiode en konden motorneuronen levend gedurende ten minste 24 uur en de motorneuronen migreren naar gewenste posities in de toeruggenmerg. We presenteren deze kweekomstandigheden en de methodologie van de voorbereiding van de embryo slice culturen met behulp van de ingewanden ontdane kippenembryo's ingebed in agarose en gesneden met behulp van een vibratome.
Introduction
Tijdens normale embryonale ontwikkeling, worden vele verschillende celtypen die gegenereerd moeten migreren hun oorsprong waar ze uiteindelijk functioneren in het volwassen organisme. Binnen de ontwikkeling ruggenmerg, zijn progenitorcellen in de ventriculaire zone aan de middellijn en genereert vele subtypen van postmitotische neuronen en gliacellen die moeten migreren te integreren in functionele neuronale circuits nodig voor sensorische en motorische uitgangen 1. Spinale motorische neuronen die de samentrekking van ledematen spieren te controleren zijn uitgebreid bestudeerd en veel bekend van de moleculen en mechanismen die de vorming van hun verschillende subklassen rijden. Er is echter veel minder bekend over de mechanismen waarmee de motorneuronen migreren, scheiden en te ontvangen synaptische input.
Motorneuron subtype identiteit wordt verworven tijdens de ontwikkeling in een hiërarchische manier. Motorneuron subtypes kan grofweg worden ingedeeld into verschillende kolommen, divisies en zwembaden die worden gedefinieerd door hun axon projecties. Motor kolommen project axonen om ofwel axiale, viscerale of ledematen spieren. Motor divisies onder te verdelen het ledemaat projecteren motorische neuronen van de laterale motor kolom (LMC) in die projecteren naar ventrale of dorsale spieren 2. Binnen de divisies, clusters van motorische neuronen genoemd motor zwembaden project aan de individuele spieren in het been 2, 3. Limb-projecterende neuronen worden gedefinieerd door hun expressie van de transcriptiefactor FOXP1 4, 5, terwijl afgesplitste identiteit wordt gekenmerkt door de expressie van het homeodomein transcriptiefactoren Islet-1 (ventraal uitstekende) of LHX-1 (dorsaal uitstekende) 6. Inderdaad, LHX-1 expressie vereist voor de betreffende dorsale projecties van de motorneuronen 7. Elk van deze subtypes verschillende posities innemen in het ruggenmerg ventrale uitstekende motorneuronen komen verblijven, dorsaal mediale projecting motorneuronen. Dit resulteert in de LMC worden gescheiden in zogenaamde LMCmedial (LMCm) en LMClateral (LMCL) divisies. Divisional en motor poolorganisatie wordt verworven in twee fasen 8. In de eerste fase wordt bereikt door segregatie afgesplitste een migratie van motorneuronen in een karakteristiek mediaal naar lateraal mode. De LMCL cellen worden gegenereerd nadat de LMCm cellen en zo LMCL verplaatsing door de LMCm te bereiken zijn definitieve afwikkeling positie. De tweede fase duurt motorische neuronen binnen een divisie en clusters ze in motor neuron zwembaden, vermoedelijk via een dorsale-ventrale sorteren van de motorneuronen. Leden van de catenine afhankelijke klassieke cadherine familie bleken cruciaal voor beide fasen van motor neuron organisatie 8-10. Echter, hoe cadherine functie cel beweging controleert slecht begrepen.
De overname van zuilvormig, divisie-en zwembad identiteiten vereist extrinsieke signalen dat patroon intrinsiekc expressie van transcriptiefactoren 11. Bovendien, ongeveer 50% van alle motorneuronen sterven via apoptose tijdens de normale ontwikkeling in een proces dat extrinsieke signalen van de ledematen vereist, grotendeels door neurotrofe ondersteuning van motor neuron overleven. Zo motorneuron ontwikkeling vereist geschikte omgeving worden gehandhaafd op een relatief lange tijdsverloop. Daarom de praktische genereren ruggenmerg slice culturen motor neuron overleving handhaven vereist de opheldering van geschikte kweekomstandigheden. Previous embryo slice culturen werden gebruikt om het gedrag van extrinsiek toegevoegd gezuiverd neuronale populaties 12-14 volgen. Er zijn echter aan onze kennis kweekomstandigheden die in situ motor neuron overleving en migratie te vergemakkelijken binnen de plak zelf niet gepubliceerd. We pasten een standaard cultuur voorwaarde dat het voortbestaan van gezuiverd vergemakkelijkt, om los craniale motorneuronen te vergemakkelijken motor neuron ontwikkeling binnen een embryo slice kweeksysteem. We controleerden tevens de positionering van de overlevende motorneuronen en aantonen dat grotendeels normaal posities van de motor neuron schotten is tijdens de kweekperiode.
Protocol
1. Breng de gewenste oplossingen
- 1 M fosfaatbuffer:. Weeg 109,4 g Na 2 HPO 4 en 32 g NaH 2 PO 4 H 2 0, mengen en oplossen in water tot het totale volume van 1 liter.
- Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS): Bereid 0,1 M fosfaatbuffer, 0,15 M NaCl. 100 ml PBS voldoende is om de verwerking van segmenten van 10 embryo's.
- Agarose: Heat PBS oplossing tot ongeveer 70 ° C en voeg vaste lage smelttemperatuur agarose langzaam roeren continu. Om de oplossing tot een eindconcentratie van 4% (w / v) agarose. Een voorraad van 50 ml van deze oplossing. Laat deze oplossing in een waterbad gehouden op 48 ° C tot nodig. Elke agarose oplossing ongebruikte na het experiment kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende enkele weken.
- Antilichaam blokkeeroplossing: Voeg foetaal kalfsserum en triton X-100 tot een uiteindelijke concentratie van 1% (v / v) foetaal kalfserum, 0,1% (v / v) Triton X-100 in PBS. 10 ml blokkeeroplossing voldoende voor de immunokleuring van 5 dia's cryostaatsecties.
- Vast: Bereid 0,75 mm NaOH, 4% (w / v) paraformaldehyde (LET). Om fixeermiddel benodigde warmte hoeveelheid water te bereiden tot 70 ° C, geconcentreerd NaOH aan gewenste eindconcentratie vaste paraformaldehyde en meng tot opgelost voegen. Afkoelen op ijs tot 4 ° C. 10 ml van deze oplossing voldoende voor 20 putjes van embryo plakken.
- Sucroseoplossing: Bereid 10 ml van een 30% (w / v) sucrose oplossing die 0,1 M fosfaatbuffer. 10 ml van deze oplossing voldoende voor 10 putjes van embryo plakken.
- 70% (v / v) ethanol. Verdun 70 ml absolute ethanol met 30 ml water.
- Kweekmedium: Bereid een oplossing van 1% kippenembryo extract, 1% penicilline / streptomycine, 0,35% L-Glutamine, 0,1% 2-mercaptoethanol, 4% kip serum, 2% B27 supplement en 100 ng / ml ciliaryneurotrophic groeifactor (CNTF) alle verdund in neurobasal medium; voorbereid op ijs en gebruikt dezelfde dag. 10 ml kweekmedium vereist voor 20 putjes van embryo plakken.
2. Chick Embryo Voorbereiding
- Place bevruchte kippen eieren met de langste zijde horizontaal in een luchtstroom incubator bij 38 ° C totdat zij ontwikkelen 15 24 fase. Dit vereist gewoonlijk ongeveer 4 dagen incubatie.
- Op de tweede dag van de incubatie, steriliseren de eischaal schoon met een papieren zakdoekje gedrenkt in 70% ethanol. Voorzichtig doorboren het platte uiteinde van de eierschaal met behulp van een 21 gauge naald bevestigd aan een 5 ml spuit en verwijder 5 ml albumine. Dit verlaagt de embryo weg van het reservoir zodat het embryo niet beschadigd wanneer het reservoir wordt geopend. Zet de eieren in de incubator en incubeer ze nog 2 dagen.
- Met stompe dumont # 5 forceps carefully doorboren de top midden van de schaal en verwijder ongeveer 9 cm 2 van shell. Snijd rond het embryo en til het embryo en de plaats in HBSS tijdens dissectie. De embryo's worden opgevoerd volgens Hamburger en Hamilton (1992) 15. Alle gebruikte's moeten op bijna trap 24. Elk embryo's die geen tekenen van abnormaliteit vertonen moet worden weggegooid.
- Verwijder de amnion membraan, chorio-allantoïsche membraan, het hoofd, en allantois met behulp van twee dumont # 5 pincet. Eviscerate het embryo om alle interne organen te verwijderen. Om dit te doen, opengesneden het ventrale middellijn van het embryo met micro ontleden schaar, houdt u de embryo rond de rostrale stam regio met een pincet, pak de rostrale deel van de darm en het hart en trek caudaal. Het is belangrijk dat deze netjes gedaan. U moet in staat zijn om te zien het embryo somieten duidelijk. Snijd de embryo in half, dwars tussen de bovenste en onderste ledematen buds.Now trimmen de borst lichaamwand met microdissectie schaar.
3. Embryo Slice Voorbereiding
- Verwijder de agarose oplossing uit het waterbad. Knip 5 cm van de bodem van een wegwerp 3 ml plastic Pasteur pipet.
- Verwijder voorzichtig de lumbale helft van de ontleed embryo met behulp van twee tangen to cradle het embryo uit de dissectie oplossing in een droge petrischaal. Met de Pasteur pipet verwijderd ongeveer 2 ml agarose, pipet ongeveer 0,5 ml bovenop het embryo en het embryo zuigen segment in de pipet. Breng de embryo en agarose een pellen plastic mal zorgen dat er geen luchtbellen te introduceren in de agarose. Voorzichtig de embryo naar de bodem van de agarose in de plastic mal met de thoracale deel naar beneden. Het embryo moet worden geplaatst om recht worden met behulp van een 21 gauge naald. De schijfjes bevat ook een deel van de zich ontwikkelende onderdeel en het is belangrijk dat de oriëntatie van het embryo in de agarose dit toestaan. Plaats de boot op het ijs om de agarose in te stellen. Zorg ervoor dat het embryo niet oriëntatie veranderen tijdens deze periode (ongeveer 2 minuten).
- De Leica VT1000S vibratome (Speed 3, Frequentie 4, 400 um dikke plakken) moet worden opgezet met het snijden kamer gevuld met HBSS en omringd door ijskoud water. De agarose blok wordt dan vast aan de vibratome platform met superlijm. De agarose blok wordt afgezet met een scheermesje om de embryo stuk reactie met 1-3 mm van agarose omringt. De segmenten die ledematen deel omvat met een duidelijke apicale ectodermale Rigde worden geselecteerd en deze schijfjes worden vervolgens in HBSS. Algemeen zijn er een tot twee geschikte segmenten per embryo. Verwijder voorzichtig de agarose rond de weefselcoupes met twee naalden. Het is essentieel dat dit grondig en zorgvuldig.
4. Het kweken van embryo Slices
- 500 ml kweekoplossing (hierboven beschreven) aan de required aantal putjes van een 24-wells ultra lage gehechtheid behandeld weefselkweek plaat. Zorgvuldig Breng de plakjes uit de HBSS oplossing in de put. In het algemeen proberen we twee tot drie sneetjes in elk putje hebben. Plaats de 24-well plaat in de weefselcultuurincubator bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 24 uur.
5. Snijden de Slices voor Immunokleuring
- Na de kweekperiode voeg 500 ul ongebufferde oplossing aan elk putje van embryo plakken en laat op ijs gedurende 20 minuten. De totale oplossing wordt vervolgens zorgvuldig verwijderd en drie PBS wassingen uitgevoerd met 5-min intervallen. Vervolgens worden de schijfjes nog in sucrose oplossing bij 4 ° C, totdat de plakjes sink, ongeveer 6 uur, maar kan ze langer (bijvoorbeeld 's nachts).
- Verwijder de plakjes en dep eenmalige extra sucroseoplossing en evenwicht gemaakt bij 1 ml LGO voor ongeveer 5 min bij 20 ° C. Monteer elke plak plat in een LGO-gevulde afpellen plastic mal.Na de montage verticaal plaatsen van de mallen op droog ijs te stollen.
- Monteer de LGO blokken in de cryostaat en evenwicht de blokken bij -24 ° C voor ongeveer 20 minuten. Snijd elk sneetje met 15 mm secties gemonteerd op Superfrost-Plus dia's. Dia's kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C totdat ze nodig.
6. Immunofluorescentie
- Pipetteer 1-2 ml PBS op de horizontale dia gehouden in een bevochtigde kamer met de dia opgewekt uit de bodem van de kamer (we 1 of 2 ml plastic pipetten bevestigd met autoclaaf tape). Incubeer de secties in PBS gedurende 5 minuten bij 20 ° C om overtollig oktober de PBS-oplossing verwijderen de dia en voeg 500 ml blokkeeroplossing over de secties, incubeer 30 min bij 20 ° C. Verwijder de blokkering oplossing en onmiddellijk 500 ml verdunde primaire antilichaam toegevoegd aan de dia geïncubeerd bij 4 ° C gedurende 18-22 uur.
- Verwijder primair antilichaam oplossing en werd onmiddellijkh de slides met 1 ml PBS gedurende 5 minuten, drie keer bij 20 ° C om overmaat oplossing te verwijderen primaire antilichaam. Voeg 500 ml van het verdunde secundaire antilichaam over de secties. De slides worden daarna bij 20 ° C gedurende 30 minuten. Het secundaire antilichaam oplossing wordt vervolgens verwijderd en de slede 3 keer gewassen in PBS 5 min bij 20 ° C.
- Na deze wasbeurten, het uiteindelijke PBS wassen, dep de rand van de dia om het overtollige PBS verwijderen te verwijderen, voeg twee druppels van Vectashield op de dia's en voorzichtig een glas dekglaasje lag over de secties, het vermijden van de vorming van luchtbellen. Overtollig Vectashield door deppen van de rand van de dia voor imaging.
7. Imaging
- Beeld de immuun-secties. We maken gebruik van een Nikon Eclipse E80i fluorescentiemicroscoop uitgerust met een Hamammatsu ORCA ER digitale camera en 10 X, 20X en 40 X objectief lenzen.
Representative Results
Het gebruik van gekweekte plakjes aan de ontwikkeling van interneuron en projectie neuronen te volgen is invloedrijk in de voortgang van ons begrip van de generatie van organisatie binnen de cortex 16. In het ruggenmerg is motorneuron ontwikkeling gevolgd met culturen van geheel zebravisembryo's 17. Echter spinale motorische neuron organisatie zebravis is relatief eenvoudig (door het ontbreken van grote reguleert in vissen). De moleculaire mechanismen die een hiërarchie van spinale motorische neuron organisatie te rijden tijdens de ontwikkeling van hogere gewervelde dieren zijn momenteel slecht begrepen. Kweekomstandigheden die neuron overleving en cellichaam migratie in embryo slice culturen van hogere gewervelde dieren te vergemakkelijken zijn dus vereist. Momenteel ruggenmerg slice culturen van hogere vertebraten zijn gebruikt om zaad gedissocieerde neuronen bovenop de segmenten 12-14, onderzoeken fluorescent gelabelde axons in de periferie van de slice18, of van progenitor cel gedrag in de vroege ruggenmerg ontwikkeling 19. Snijd kweekomstandigheden voor later ruggenmerg, met name degenen die behouden motorneuron ontwikkeling op dit moment ontbreekt.
Om te proberen om spinale neuronale ontwikkeling te volgen, in het bijzonder die van de spinale motorische neuronen, wij diverse kweekomstandigheden die motorneuron overleving en de acquisitie van de eerste orde in de motorische organisatie door laterale migratie van de neuronen kunnen bevorderen onderzocht. De eerste proeven met behulp van fase 18 tot 20 kippenembryo ruggenmerg plakjes fase bleek vruchteloos, we waren niet in staat om motorneuronen in leven te houden langer dan een paar uur en waren niet in staat tot het genereren van aanzienlijke aantallen LMCL cellen over de cultuur periode (gegevens tonen aan niet getoond). We hebben daarom onderzocht slice culturen van fase 24 embryo's, een tijdpunt wanneer de meerderheid van de LMCL en LMCm neuronen zijn gegenereerd, maar als LMCL neuron migratie staat nog in de infancy (figuur 1a-c). Deze laterale migratie van LMCL neuronen is grotendeels voltooid stadium 27, rond 24 tot 36 uur later (figuur 1 df). De assay kan derhalve worden vereenvoudigd kunnen om de neuronen in leven en hun migratie zijdelings gemakkelijk in de ventrale hoorn. We hebben onze experimenten begonnen met relatief eenvoudige kweekomstandigheden met slechts gebalanceerde zout Hank's oplossing, met of zonder kip serum of kippenembryo-extract. In alle gevallen, hoewel we konden LMC neuronen in het segment behouden, weinig aanwijzingen voor LMCL neuronen worden gehandhaafd (ten minste expressie van LHX-1). Verder vonden we onjuiste expressie van genen zoals HB9 in de dorsale ruggenmerg, een situatie die nooit voorkomt in vivo (data niet getoond). Aldus deze eenvoudige kweekomstandigheden zijn niet geschikt voor het onderzoek naar de verwerving van motorische neuron organisatie.
Wij hebben dus zocht meer complexe conditions en uitgaan van een formulering die is gepubliceerd voor het voortbestaan van gedissocieerde embryonale kip craniale motorneuronen te vergemakkelijken gebruikt. Deze voorwaarde 20 (1% kippenembryo extract, 1% Pen strep, 0,35% L-Glutamine, 0,1% 2-mercaptoethanol, 2% paardenserum, 2% B27 supplement en 50 ng / ml ciliaryneurotrophic growth factor (CNTF) in medium neurobasal (hier genoemd Guthrie medium) heeft altijd op meer motorneuronen in leven dan de meer eenvoudige media. Daarnaast is het resulteerde niet in valse expressie van transcriptiefactoren in de dorsale ruggemerg. Echter, het overleven van neuronen LMCL was slecht (Figuur 1 gi, p). Daarom varieerde onze mening een sleutelrol spelen in de Guthrie, namelijk via het dier oorsprong van het serum, de concentratie van het serum en de concentratie van CNTF in het medium. We vonden dat een verandering van serum van paardenserum Chick serum en een toename in concentratie van CNTF van 50 ng / ml tot 100 ng / ml aanzienlijk toegenomen thij overleving van de LMCL en LMCm cellen en toegestaan hun migratie in de ventrale hoorn over de 24 uur van de kweek omstandigheden (figuur 1 jl, p). Het totale aantal motorneuronen de verhouding LMCm tot LMCL en zelfs de migratie van de LMCL cellen in het ventrale hoorn leek sterk op delen van embryo's had laten ontwikkelen in ovo plaats in het segment kweek (Figuur 1 ko, p). Zo vinden wij dat gebaseerd op transcriptiefactor expressie, het aantal cellen en positie van motorneuronen, slice onze kweekomstandigheden normale spinale motorische neuron ontwikkeling vatten ten minste gedurende 24 uur periode.
Figuur 1. a - c. Status van generatie LMC (FOXP1 kleuring inb) en LMCL (LHX-1 kleuring in a) in stap 24. c is een samenvoeging van de twee kanalen. De middellijn wordt weergegeven als een stippellijn in een en D, V toont de oriëntatie van de dorsoventrale (D, V) as van het ruggenmerg d -. F. . Status van LMC (FOXP1 kleuring in d), en LMCL (LHX-1 kleuring in e) organisatie in de eerste fase 27 f is een samenvoeging van de twee kanalen g -. I. LHX-1 (g) en FOXP1 (h) expressie in secties van een slice gekweekt in een medium dat craniale motor neuron celoverleving ondersteunt (Guthrie medium, onze "eerste medium" zie referentie 20). LHX-1 niet meer uitgedrukt in motorneuronen, hoewel er enige overleving van cellen LMC blijkt uit FOXP1 expressie. D, V in (g) toont de oriëntatie van de dorsoventrale (D, V) as van het ruggenmerg. ML toont de oriëntatie van de mediolaterale (M, L) as van de sPinal koord j - l. LMCL cellen (LHX-1 in de ventrale hoorn j) en LMC in het algemeen (in FOXP1 k) worden waargenomen in plakjes gekweekt in medium dat 4% chick serum en 100 ng / ml CNTF. Merk op dat sommige LMCL cellen worden aangetroffen in een laterale positie in de ventrale hoorn. De pijl in (j) toont de laterale positie van sommige LMCL de cellen. (L) is een samenvoeging van de twee kanalen m. -. O.. Status van expressie van LHX-1 (m) en FOXP1 (n) in delen van een embryo in ovo gehouden tijdens de slice cultuur van de embryo getoond in j - l. (O) is een samenvoeging van de twee kanalen. P. Kwantificering van het percentage van LMCL (FOXP1 + ve / Lhx1 + ve) cellen versus LMC (FOXP1 + ve / Lhx1-ve) cellen in slice culturen in verschillende omstandigheden compared om embryo's in ovo (overeenkomende met 100%) te controleren. Student's t-test *** vertegenwoordigt p <0,01. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Discussion
De hier beschreven protocol kan een kippenembryo slice worden gedurende meer dan een dag met behoud motorneuronen levend blijven migreren tijdens de kweekperiode. In het ophelderen van de voorwaarden om motorneuronen in leven, hebben we identificeerden verschillende vereiste belangrijke functies. Het lijkt erop dat maximaal 4% chick serum is cruciaal voor de overleving van motorneuronen en wordt vervangen door serum van een andere soort wordt niet getolereerd. Interessant we gevonden dat de aanwezigheid van hogere concentraties serum nadelig waren voor de plakjes die woekering van het weefsel leidt tot grove vertekeningen in het segment vorm bevorderd. Belangrijker, de aanwezigheid van cilliary neurotrofe factor bleek ook kritisch. Het blijft een mogelijkheid dat de plakjes kan kunnen worden gekweekt aanzienlijk langer dan 24 uur, zelfs waardoor de visualisatie van sensorische afferente input naar het ruggenmerg. Bovendien, de cultuur voorwaarden hier kan het nuttig blijken om culturen van de ontwikkelingslanden hersenstam en middenhersenen / cerebellum snijden.
Misschien wel de grootste potentiële voordeel in het gebruik van deze slice kweekomstandigheden is dat de mogelijkheid voor farmacologische manipulatie van eiwitfunctie met een minimale kans op bijwerkingen op de rest van de embryo, zoals het hart te bevorderen. Een groot aantal remmers en agonisten van verschillende signaalwegen kan worden gebruikt om de migratie van verschillende subtypes spinale neuronen en mogelijk het effect van de vorming van lokale spinale circuits in te beoordelen. Bovendien hebben sommige genetische verstoringen van eiwitexpressie, zoals die gebruik van siRNA's en morfolino oligonucleotiden maken, hebben als nadeel dat ze alleen vroeg in de ontwikkeling worden ingevoerd (door beperkingen in in ovo elektroporatie procedures) en de effecten slechts voor een korte periode van time (meestal een dag). Onze slice cultuur wordt gestart in een later stadium en biedt de mogelijkheid om deze technologie te gebruiken later in ontwikkeling bij het snijden podium om hun effecten te bekijken tijdens de periode van de cultuur van het segment.
De slice cultuur-protocol kan ook toestaan dat de visualisatie van zowel spinale motorische neuron en dorsale interneuron migratie in real time via time-lapse video microscopie. Dit kan worden bereikt met fasecontrastmicroscopie onder wit licht of door het gebruik van fluorescentie beeldvorming. Indien deze techniek zou dan gebruikt de introductie van fluorescerende labels nodig. Dit kan worden bereikt door het inbrengen van fluorescerende kleurstoffen zoals DiI of DIO via ofwel retrograde labeling van de tak of anterograde labeling van de ventrikel of in ovo elektroporatie van constructen fluorescerende eiwitten rijden in een subset van neuronen.
Disclosures
Geen van de auteurs hebben concurrerende belangen of belangenconflicten.
Acknowledgments
We willen Sharon Boast bedanken voor vele inzichtelijke discussies en B. Novitch voor het soort geschenk van de antilichamen tegen FOXP1. Dit werk als gefinancierd door een studententijd van de Wellcome Trust KCT en een projectsubsidie van de Wellcome Trust SRP (Grant referentienummer 094399/B/10/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Henry Stewart Farms, UK | Fertilised Brown Bovan Gold Hen's eggs (Henry Stewart Farms, UK), stored at 14 °C until incubation | |
| 21 Gauge needle | BD-Microlance-3 | 304432 | |
| 5 ml syringe | BD Plastipak | 302187 | |
| #5 Dumont forceps | Roboz | RS 5045 | |
| Micro Dissecting scissors | Roboz | RS 5910SC | (3.5 in straight) |
| Embryo embedding moulds: Peel away moulds | Agar Scientific | G3764 | Pyramidal shaped 22 mm to 12 mm |
| Super glue | Power Flex, Loctite | ||
| Ethanol | SIGMA | 32221 | |
| Sodium di-hydrogen Phosphate, mono-hydrate | BDH | 102454R | |
| Di Sodium mono-hydrogen Phosphate | VWR/ BDH | 102494C | |
| Sodium Chloride | VWR/BDH | 27810.295 | |
| Low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10500-064 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| Sodium Hydroxide | FLUKA | 71689 | |
| Paraformaldehyde | VWR/BDH | 28794.295 | |
| Plastic disposable pasteur pipettes | ElKay Precision laboratory consumables | 127-P503-000 | Liquipette 3 ml volume |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170 | |
| Sucrose | SIGMA | S0389 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | SIGMA | S5761 | |
| Chicken Embryo Extract | Seralabs | CE650-J | |
| Penicillin/ Streptomycin solution | Gibco | 15070 | |
| L-Glutamine solution | Gibco | 25030 | |
| 2-mercapt–thanol | Gibco | 21985 | |
| Horse serum | Southern Group Labs | 9028B | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Neurobasal medium | Gibco | Cat ~ 2103 | |
| CilliaryNeurotrophic factor (CNTF) | R and D Systems | 557-NT-010 | |
| Chick Serum | SIGMA | C5405 | |
| Primary antibodies | were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank, with the exception of anti-foxP1 antibodies, which were a kind gift from Bennett Novitch of UCLA. Primary antibodies dilutions were Rabbit anti-FoxP1 (1/32000), Mouse anti-Lhx1/2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FoxP1 (1/1000). All antibodies were stored at 4 °C. |
||
| Secondary antibodies | Donkey anti-Guinea Pig (cy3) (1:1000) purchased from Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-Rabbit (Alexa Fluor 594) (1:1000) purchased from Invitrogen All antibodies were stored at 4 °C. |
||
| 24-well plate | Corning COSTAR | 3473 | ultralow attachment 24-well plate |
| O.C.T. | Tissue Tek, Sakura | 4583 | Optimum Cutting Temperature |
| Vectashield | Vector Labs | H1000 | Vectashield fluorescent mounting medium |
| Slides | Thermo Scientific | Superfrost-Plus positively-charged slides, 25 x 75 x 1.0 mm | |
| Cover Glass | VWR International | 631-0167 | 25x60 mm |
| Forced draft incubator: | Lyon Electric Company | kept humid by ensuring water levels always sufficient, maintained at 38 °C | |
| Cryostat | Brite, Huntingdon, UK | -36 °C | |
| Tissue Culture Incubator | DH Autoflow | Nuaire 38 °C, 5% CO2 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT1000-S | |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse E80i fluorescence microscope | |
| Digital Camera | Nikon | Nikon DS5M and Hamammatsu ORCA ER |
References
- Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: Inductive signals and transcriptional codes. Nature Reviews Genetics. 1 (1), 20-29 (2000).
- Landmesser, L. Distribution Of Motoneurons Supplying Chick Hind Limb Muscles. Journal of Physiology-London. 284, 371-389 (1978).
- Romanes, G. J. The motor pools of the spinal cord. Progress in Brain Research. 11, 93-119 (1964).
- Dasen, J. S., De Camilli, A., Wang, B., Tucker, P. W., Jessell, T. M. Hox repertoires for motor neuron diversity and connectivity gated by a single accessory factor, FoxP1. Cell. 134 (2), 304-316 (2008).
- Rousso, D. L., Gaber, Z. B., Wellik, D., Morrisey, E. E., Novitch, B. G. Coordinated actions of the forkhead protein Foxp1 and Hox proteins in the columnar organization of spinal motor neurons. Neuron. 59 (2), 226-240 (2008).
- Tsuchida, T., Ensini, M., et al. Topographic organization of embryonic motor-neurons defined by expression of limhomeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
- Kania, A., Johnson, R. L., Jessell, T. M. Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb. Cell. 102 (2), 161-173 (2000).
- Price, S. R., Garcia, N. V. D., Ranscht, B., Jessell, T. M. Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins. Cell. 109 (2), 205-216 (2002).
- Demireva, E. Y., Shapiro, L. S., Jessell, T. M., Zampieri, N. Motor Neuron Position and Topographic Order Imposed by β- and γ-Catenin Activities. Cell. 147 (3), 641-652 (2011).
- Bello, S. M., Millo, H., Rajebhosale, M., Price, S. R. Catenin-Dependent Cadherin Function Drives Divisional Segregation of Spinal Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (2), 490-505 (2012).
- Haase, G., Dessaud, E., et al. GDNF acts through PEA3 to regulate cell body positioning and muscle innervation of specific motor neuron pools. Neuron. 35 (5), 893-905 (2002).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods in Cell Biology. 51 (51), 109-124 (1996).
- Hotary, K. B., Tosney, K. W. Cellular interactions that guide sensory and motor neurites identified in an embryo slice preparation. Developmental Biology. 176 (1), 22-35 (1996).
- Krull, C. E., Tosney, K. Embryo slices and strips: Guidance and adhesion assays in the avian embryo. Methods in Cell Biology: New Methods in Avian Embryology. Bronner-Fraser, M. 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. San Diego. 97-113 (2008).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. (Reprinted From Journal Of Morphology, Vol. 88, 1951). Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Rakic, P. A century of progress in corticoneurogenesis: From silver impregnation to genetic engineering. Cerebral Cortex. 16, I3-I17 (2006).
- Bingham, S. M., Sittaramane, V., Mapp, O., Patil, S., Prince, V. E., Chandrasekhar, A. Multiple mechanisms mediate motor neuron migration in the zebrafish hindbrain. Dev. Neurobiol. 70 (2), 87-99 (2010).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Developmental Dynamics. 236 (12), 3514-3523 (2007).
- Das, R. M., Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium. J. Vis. Exp. (62), e3920 (2012).
- Barnes, S. H., Price, S. R., Wentzel, C., Guthrie, S. C. Cadherin-7 and cadherin-6B differentially regulate the growth, branching and guidance of cranial motor axons. Development. 137 (5), 805-814 (2010).
