Summary
Scheibe Kulturen ermöglichen die Manipulation der Embryonalentwicklung durch Gen-und pharmakologische Störungen. Allerdings müssen Kulturbedingungen sicherzustellen, dass eine normale Entwicklung innerhalb der reduzierten Umfeld der Scheibe gehen. Wir stellen ein Protokoll, das normale Entwicklung Rückenmarks erleichtert, um für wenigstens 24 Stunden fort.
Abstract
Slice-Kulturen erleichtern kann die Manipulation der Entwicklung des Embryos sowohl pharmakologisch und durch Gen-Manipulationen. In dieser reduzierten System können potenzielle tödliche Nebenwirkungen durch systemische Medikament Anwendungen überwunden werden. Allerdings muss Kulturbedingungen garantiert den normalen Entwicklung verläuft innerhalb des reduzierten Umgebung der Scheibe. Wir haben bei der Entwicklung des Rückenmarks fokussiert, insbesondere der Wirbelsäule Motoneuronen. Wir systematisch Kulturbedingungen Hühnerembryo Scheiben von dem Punkt, an dem die meisten spinalen motorischen Neuronen geboren worden war vielfältig. Wir untersucht die Anzahl und Art der Motoneuronen, die während der Züchtungsperiode und der Position jener Motoneuronen Vergleich zu der in vivo überlebt. Wir fanden, dass das Serum Art und neurotrophen Faktoren wurden während der Anzucht benötigt und konnten zu halten Motoneuronen Leben für mindestens 24 Stunden und lassen diese Motoneuronen zu entsprechenden Positionen in der MigrationRückenmark. Wir präsentieren diese Kulturbedingungen und die Methodik der Erstellung des Embryos Slice-Kulturen mit ausgeweideten Hühnerembryonen in Agarose eingebettet und geschnitten mit einem Vibratom.
Introduction
Während der normalen Embryonalentwicklung werden viele verschiedene Zelltypen erzeugt, muss von ihrem Ursprungsort, wo sie schließlich im reifen Organismus funktionieren zu migrieren. Innerhalb des sich entwickelnden Rückenmarks sind Vorläuferzellen im ventrikulären Zone an der Mittellinie angeordnet und erzeugen viele Subtypen postmitotischen Neuronen und Gliazellen, die migrieren, um in funktionelle neuronale Schaltungen zur Verarbeitung sensorischer und Motorleistungen 1 erforderlich integrieren muss. Spinalen motorischen Neuronen, die die Kontraktion des Körpers Muskeln kontrollieren wurden ausgiebig untersucht und es wird viel der Moleküle und Mechanismen, die die Bildung ihrer verschiedenen Unterklassen fahren bekannt. Allerdings ist viel weniger der Mechanismen, durch die Motoneuronen zu migrieren, zu trennen und zu empfangen synaptischen Eingängen bekannt.
Motoneuronen Subtyp Identität während der Entwicklung in einer hierarchischen Weise erworben. Motor Neuron Subtypen können grob klassifiziert werden into unterschiedlichen Spalten, Abteilungen und Pools, die durch ihre Axon definiert sind. Motor Säulen Projekt Axone entweder axial, viszerale Leib oder Muskeln. Motor Abteilungen unterteilen den Schenkel vorsteht Motoneuronen des Motors seitliche Spalte (LMC) vorsteht, um in diejenigen ventralen oder dorsalen Muskeln 2. Innerhalb der Divisionen, genannt Cluster von Motoneuronen Fuhrparks Projekt einzelnen Muskeln in den Gliedmaßen 2, 3. Schenkel ragenden Motoneuronen sich durch ihre Expression des Transkriptionsfaktors FOXP1 4, 5 definiert, während Teilanmeldung Identität durch die Expression der Homöodomäne Transkriptionsfaktoren Islet-1 (ventral vorspringende) oder LHX-1 (dorsal vorspringende) 6 gekennzeichnet ist. Tatsächlich ist LHX-1-Expression für die entsprechenden dorsalen Projektionen der Motoneuronen 7 erforderlich. Jeder dieser unterschiedlichen Positionen besetzen Subtypen innerhalb des Rückenmarks; ventralen vorspringenden Motoneuronen kommen aufzuhalten medial dorsal projecting Motoneuronen. Daraus ergibt sich die LMC ist in sogenannte LMCmedial (LMCM) und LMClateral (LMCl) Divisionen getrennt. Bereichs-und Fuhrpark Organisation ist in zwei Phasen 8 erworben. In der ersten Phase wird über eine Teilanmeldung Segregation Migration von Motoneuronen in einer charakteristischen medial nach lateral Weise erreicht. Die LMCl Zellen werden nach den LMCM Zellen und so LMCl wandert durch die LMCM zu seiner endgültigen Beilegung Position zu erreichen erzeugt. Die zweite Phase dauert Motoneuronen innerhalb einer Abteilung und Clustern sie in Motoneuronen Pools, vermutlich über einen dorsal-ventral Sortierung der Motoneuronen. Mitglieder der Catenin-abhängigen klassischen Cadherin Familie erwiesen sich als entscheidend für beide Phasen der Motoneuronen Organisation 8-10. Allerdings ist, wie Cadherin-Funktion Zellbewegung steuert schlecht verstanden.
Der Erwerb von säulenförmig, Divisions-und Pool-Identitäten erfordert extrinsische Signale, dass Muster eigensicherenc Expression von Transkriptionsfaktoren 11. Zusätzlich sterben etwa 50% aller Motoneuronen über Apoptose während der normalen Entwicklung in einem Prozess, extrinsischen Signale vom Schenkel erfordert, weitgehend durch neurotrophen Unterstützung der Motoneuronen das Überleben. Somit erfordert Motoneuronen Entwicklung geeigneter Rahmenbedingungen über einen relativ langen Zeitverlauf aufrechterhalten werden. Aus diesem Grund erfordern die Durchführbarkeit des Erzeugens Rückenmarks Schnittkulturen um Motoneuronen das Überleben Aufrechterhaltung der Aufklärung von geeigneten Kulturbedingungen. Zurück Embryo Schnittkulturen sind verwendet worden, um das Verhalten von extrinsisch zugegeben gereinigt neuronale Populationen 12-14 folgen. Allerdings haben unsere Wissenskultur Bedingungen, die in situ Motoneuronen Überleben und Migration zu erleichtern innerhalb der Scheibe selbst nicht veröffentlicht worden. Wir modifizierten ein Standard-Kulturbedingungen, die das Überleben von gereinigtem erleichtert, zu dissoziierten kranialen Motoneuronen zu erleichtern motor Neuron Entwicklung innerhalb eines Embryos Kokultur-System. Auch überwacht die Positionierung der überlebenden Motoneuronen und zeigen, dass weitgehend normalen Positionen der Motoneuronen Divisionen während der Anzucht wird erworben.
Protocol
Ein. Machen Erforderliche Lösungen
- 1 M Phosphatpuffer:. Abwiegen 109,4 g Na 2 HPO 4 und 32 g NaH 2 PO 4 H 2 0, mischen und lösen sich in Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 1 Liter.
- Phosphate Buffered Saline (PBS): Bereiten 0,1 M Phosphatpuffer, 0,15 M NaCl. 100 ml PBS sollte für die Verarbeitung von Scheiben von 10 Embryonen ausreichen.
- Agarose: Heat PBS-Lösung auf etwa 70 ° C und fügen Sie feste niedrige Schmelztemperatur Agarose langsam unter ständigem Rühren. Um die Lösung auf eine Endkonzentration von 4% (w / v) Agarose. Machen Sie einen Vorrat von 50 ml dieser Lösung. Lassen Sie diese Lösung in einem Wasserbad bei 48 ° C gehalten, bis sie benötigt. Jede Agaroselösung unbenutzten nach dem Versuch kann bei 4 ° C über mehrere Wochen gelagert werden.
- Antikörper Blocklösung: Hinzufügen fötalem Kälberserum und Triton X-100 zu einem endgültigen Konzentration von 1% (v / v) fötales Kälberserum, 0,1% (v / v) Triton X-100 in PBS. 10 ml Block-Lösung für die Immunfärbung von 5 Dias Kryostatschnitten ausreichen.
- Fixative: Bereiten 0,75 mm NaOH, 4% (w / v) Paraformaldehyd (VORSICHT). Um Fixiermittelpartikel Wärme benötigte Menge an Wasser auf 70 ° C herzustellen, fügen konzentrierter NaOH auf gewünschte Endkonzentration, fügen festem Paraformaldehyd und gemischt, bis es gelöst. Kühlen auf Eis auf 4 ° C 10 ml dieser Lösung wird für 20 Vertiefungen von Embryos Scheiben ausreicht.
- Saccharose-Lösung: Planen 10 ml einer 30% (w / v) Saccharose-Lösung mit 0,1 M Phosphat-Puffer. 10 ml dieser Lösung wird für 10 Vertiefungen von Embryos Scheiben ausreicht.
- 70% (v / v) Ethanol. Verdünnen 70 ml absolutem Ethanol mit 30 ml Wasser.
- Kultur Medium: Bereiten Sie eine Lösung aus 1% Hühnerembryo-Extrakt, 1% Penicillin / Streptomycin, 0,35% L-Glutamin, 0,1% 2-mercaptoethnol, 4% Huhn Serum, 2% B27 Ergänzung und 100 ng / ml ciliaryneurotrophic growth factor (CNTF) alle in Neurobasalmedium verdünnt; auf Eis hergestellt und am selben Tag. 10 ml Kulturmedium für 20 Vertiefungen von Embryos Scheiben erforderlich.
2. Küken Embryo Vorbereitung
- Ort befruchteten Hühnereiern mit der längsten Seite horizontal in einer Druckgebläse Brutschrank bei 38 ° C, bis sie an 15 24 Bühne entwickeln. Dies erfordert in der Regel etwa 4 Tagen Inkubation.
- Am zweiten Tag der Inkubation, sterilisieren die Eierschale durch Abwischen mit einem Papiertuch in 70% Ethanol getränkt. Vorsichtig durchbohren das flache Ende der Eierschale mit einer 21-Gauge-Nadel an einer 5-ml-Spritze und entfernen Sie 5 ml Albumin. Dies senkt den Embryo weg von der Schale, so dass die Embryos nicht beschädigt wird, wenn die Hülle geöffnet ist. Bringen Sie die Eier in den Inkubator und inkubieren sie für weitere 2 Tage.
- Mit abgestumpften dumont Nr. 5 Zangen ct ein sorgfältig durchbohren die oben in der Mitte der Schale und entfernen Sie etwa 9 cm 2 von Shell. Cut um den Embryo und heben Sie den Embryo und in HBSS beim Präparieren. Die Embryonen sollte nach Hamburger und Hamilton (1992) 15 ausgetragen. Alle Embryonen verwendet werden, sollten in der Nähe von Stufe 24 sein. Alle Embryonen, die keine Anzeichen von Anomalien zeigen, sollten verworfen werden.
- Entfernen Sie die Amnionmembran, Chorion-Allantois-Membran, den Kopf, und der Allantois mit zwei dumont Nr. 5 Zange. Ausweiden des Embryos, um alle inneren Organe zu entfernen. Um dies zu tun, schnitt den ventralen Mittellinie des Embryos mit Mikro Präparierscheren, halten den Embryo um die rostral Rumpfbereich mit einer Pinzette, greifen die rostralen Teil des Darms und des Herzens und ziehen kaudal. Es ist wichtig, dass diese glatt gemacht wird. Sie sollten in der Lage sein zu sehen, der Embryo Somiten deutlich. Schneiden Sie den Embryo in der Mitte, quer zwischen der oberen und unteren Extremität buds.Now trimmen Thorax KörperWand mit Mikrodissektion Schere.
3. Embryo Scheibe Vorbereitung
- Entfernen Sie die Agarose-Lösung aus dem Wasserbad. Cut 5 cm von der Unterseite eines Einweg 3 ml Kunststoffbecher Pasteurpipette.
- Entfernen Sie vorsichtig die Lendenwirbelsäule Hälfte des seziert Embryo mit zwei Zangen to cradle den Embryo aus der Dissektion Lösung und in einer trockenen Petrischale. Verwendung der Pasteurpipette von ca. 2 ml von Agarose zu entfernen, etwa 0,5 ml Pipette auf die Oberseite des Embryos und dann saugen den Embryo scheibe in die Pipette. Übertragen des Embryos und Agarose zu einer Schale weg Kunststoff-Formenbau darauf achten, dass keine Luftblasen in der Agarose einzuführen. Senken des Embryos in dem Boden der Agarose in der Kunststoffform mit der thorakalen Abschnitt nach unten zeigt. Der Embryo sollten so positioniert werden gerade mit Hilfe eines 21-Gauge-Nadel werden. Die Scheiben enthält auch ein Teil des sich entwickelnden Gliedmaßen und es ist wichtig, dass die Ausrichtung des Embryos im Agarose wird dies erlauben. Das Boot auf Eis, um die Agarose gesetzt. Achten Sie darauf, dass der Embryo nicht ändern Orientierung während dieser Zeit (ca. 2 min).
- Die Leica VT1000S Vibratom (Speed 3, Frequenz 4, 400 um dicke Scheiben) sollte mit dem Schneiden Kammer mit HBSS gefüllt eingestellt werden und ist umgeben von eiskaltem Wasser. Die Agarose-Block wird dann an den Vibratom Plattform mit Sekundenkleber verklebt. Die Agarose-Block wird mit einer Rasierklinge, um den Embryo Stück mit 1-3 mm von Agarose umgibt verlassen getrimmt. Die Scheiben, die Gliedmaßenknospe Abschnitte enthalten eine klare apikalen ektodermalen rigde ausgewählt und diese Scheiben werden dann in HBSS platziert. Generell gibt es nur ein bis zwei geeignete Scheiben pro Embryo. Entfernen Sie vorsichtig die Agarose um die Gewebeschnitte mit zwei Nadeln. Es ist wichtig, dass diese gründlich und sorgfältig durchgeführt wird.
4. Kultivierung Embryo Slices
- 500 ml Nährlösung (wie oben beschrieben) auf die required Anzahl von Wells einer 24-Well ultraniedriger Befestigung behandelt Gewebekulturplatte. Übertragen Sie die Scheiben vorsichtig aus der HBSS-Lösung in den Brunnen. In der Regel versuchen wir, zwei bis drei Scheiben in jede Vertiefung haben. Platzieren Sie die 24-Well-Platte in der Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 24 Stunden.
5. Durchtrennen der Slices für Immunfärbung
- Nach der Anzucht, 500 ul unbuffered fix zu jeder Vertiefung der Embryo Scheiben und lassen auf Eis für 20 min. Die Gesamtlösung wird dann vorsichtig entfernt und drei PBS Wäschen sind, mit 5-Minuten-Intervallen durchgeführt. Die Scheiben werden dann in Saccharose-Lösung bei 4 ° C gelassen, bis die Scheiben Spüle, ca. 6 h, kann aber für längere (zB über Nacht) belassen werden.
- Entfernen Sie die Scheiben und abtupfen zusätzliche Saccharose-Lösung und äquilibrieren in etwa 1 ml Oktober für rund 5 min bei 20 ° C. Montieren Sie jede Scheibe Wohnung in einem OCT-gefüllte Schale weg Kunststoff-Formenbau.Nach der Montage stellen die Formen vertikal auf Trockeneis zu verfestigen.
- Montieren Sie die Oktober-Blöcke in den Kryostaten und äquilibrieren die Blöcke bei -24 ° C für ca. 20 min. Schneiden Sie die einzelnen Scheibe mit 15 mm Abschnitte auf Superfrost-Plus Objektträger aufgebracht. Dias können bei -80 ° C gelagert werden, bis sie benötigt werden.
6. Immunfluoreszenz
- Pipette 1-2 ml PBS über die Horizontal-Schieber in einer befeuchteten Kammer mit den Folien aus dem Boden der Kammer (wir verwenden 1 oder 2 ml Autoklaven Kunststoffpipetten mit Klebeband fixiert) angehoben gehalten wird. Inkubiere die Abschnitte in PBS für 5 min bei 20 ° C zur Entfernung von überschüssigem Oktober entfernen PBS-Lösung von der Rutsche und 500 ml Blocklösung über die Abschnitte, Inkubation 30 min bei 20 ° C. Entfernen Sie den Block-Lösung und sofort 500 ml verdünnte primäre Antikörper hinzugefügt, um die Dias, Inkubation bei 4 ° C für 18-22 Std.
- Entfernen primärer Antikörper-Lösung und war soforth die Objektträger mit 1 ml PBS für 5 min, dreimal bei 20 ° C, um überschüssiges Primärantikörper-Lösung zu entfernen. Fügen Sie 500 ml der verdünnten sekundären Antikörper in den Sektionen. Die Objektträger werden dann bei 20 ° C für 30 min belassen. Der sekundäre Antikörper-Lösung wird dann entfernt und der Schieber wäscht 3 mal 5 min in PBS bei 20 ° C.
- Nach dieser Waschungen, entfernen Sie den letzten PBS waschen, abtupfen Rand der Folie, um überschüssiges PBS zu entfernen, geben Sie zwei Tropfen Vectashield auf den Folien und legen Sie ihn vorsichtig ein Deckglas über die Abschnitte, die Vermeidung Blasenbildung. Entfernen überschüssigen Vectashield durch Blotten von der Kante der Folien vor der Bildgebung.
7. Imaging
- Bild der immungefärbten Abschnitte. Wir verwenden eine Nikon Eclipse E80i Fluoreszenzmikroskop mit einem Hamammatsu ORCA ER Digitalkamera und 10 X, 20X und 40 X Objektiven ausgestattet.
Representative Results
Die Verwendung von kultivierten Scheiben um die Entwicklung von Neuronen und Projektion Interneuron folgen war, voran unser Verständnis der Erzeugung Organisation innerhalb der Hirnrinde 16 Einfluss. Im Rückenmark, Motoneuronen hat Entwicklung wurde unter Verwendung von Kulturen gefolgt von ganzen Zebrafischembryonen 17. Jedoch ist spinalen Motoneuronen Organisation im Zebrafisch relativ einfachen (aufgrund des Fehlens von großen Schenkel Muskeln in Fisch). Die molekularen Mechanismen, die eine Hierarchie von spinalen Motoneuronen Organisation zu fahren während der Entwicklung der höheren Wirbeltiere sind derzeit nur unzureichend verstanden. Kultur Bedingungen, die das Überleben von Neuronen und Zellkörper Migration in Embryos Slice-Kulturen der höheren Wirbeltiere zu erleichtern somit erforderlich. Derzeit Rückenmarks Schnittkulturen der höheren Wirbeltiere zur Saatgut dissoziierte Neuronen wurden auf die Oberseite der Scheiben 12 bis 14 verwendet wird, zu untersuchen fluoreszenzmarkierten Axone in der Peripherie der Scheibe18, oder von Vorläuferzellen Zellverhalten Anfang Rückenmarks Entwicklung 19. Scheibe Kulturbedingungen für später Rückenmark, insbesondere solche, Motoneuronen Entwicklung werden derzeit fehlen aufrechtzuerhalten.
Um zu versuchen, Rückenmark neuronale Entwicklung folgen, insbesondere der spinalen motorischen Neuronen, haben wir verschiedene Kulturbedingungen, die Motoneuronen Überleben und den Erwerb von Erstbestellung im Motorsport Organisation durch seitliche Migration der Neuronen fördern könnte untersucht. Erste Versuche mit der Bühne von 18 bis 20 Hühnerembryo Rückenmarks Scheiben inszenieren fruchtlos erwiesen, wir waren nicht in der Lage zu halten Motoneuronen lebt länger als ein paar Stunden und konnten die Erzeugung einer großen Zahl von LMCl Zellen über die Kultur Zeitraum (Daten zeigen, nicht gezeigt). Wir untersuchten daher Slice-Kulturen der Stufe 24 Embryonen, ein Zeitpunkt, wenn die Mehrheit der LMCl und LMCM Neuronen erzeugt wurden, aber wenn LMCl Neuron Migration ist immer noch in den infancy (Abbildung 1a-c). Diese seitliche Migration LMCl Neuronen ist weitgehend abgeschlossen Stufe 27, um 24 bis 36 Stunden später (Abbildung 1 df). Unserem Assay könnte somit in der Lage zu halten, die Neuronen lebendig und ihre Migration in die seitlich erleichtern Vorderhorn vereinfacht werden. Wir begannen unseren Experimenten mit relativ einfachen Kulturbedingungen mit nur ausgeglichene Hank-Salzlösung mit oder ohne Huhn Serum oder Hühnerembryo-Extrakt. In allen Fällen, auch wenn wir in der Lage, LMC Neuronen in der Scheibe zu halten waren, fanden wir kaum Hinweise LMCl Neuronen gepflegt (zumindest durch Expression LHX-1). Weiterhin fanden wir unangemessene Expression von Genen wie HB9 im dorsalen Rückenmark, eine Situation, die niemals in vivo (Daten nicht gezeigt). Somit sind diese einfache Kulturbedingungen nicht geeignet für die Untersuchung des Erwerbs der Motoneuronen Organisation.
Damit haben wir suchten komplexer conditions und als Basis eine Formulierung, die veröffentlicht worden ist, um das Überleben von dissoziierten embryonalen Hühner kranialen Motoneuronen zu erleichtern. Diese Bedingung 20 (1% Hühnchenembryoextrakt, 1% Pen Strep, 0,35% L-Glutamin, 0,1% 2-Mercaptoethanol, 2% Pferdeserum, 2% B27 Supplement und 50 ng / ml ciliaryneurotrophic Wachstumsfaktor (CNTF) in Neurobasalmedium (hier als Guthrie medium) hat immer mehr motorische Neuronen lebendiger als die einfacheren Medien. Darüber hinaus ist es nicht in falsche Expression von Transkriptionsfaktoren in der dorsalen Rückenmarks führen. Allerdings war das Überleben der Neuronen LMCl Armen (Abbildung 1 gi, p). Deshalb variiert, was wir Schlüsselfaktoren bei der Guthrie Medium, nämlich den tierischen Ursprungs des Serums, die Konzentration des Serums und der Konzentration des im Medium CNTF betrachteten. Wir fanden, dass das Ändern des Serums von Pferdeserum im Chick Serum und einer Zunahme der Konzentration von CNTF von 50 ng / ml bis 100 ng / ml deutlich erhöht ter Überleben der LMCl und LMCM Zellen und auch ihre Migration in den ventralen Horn über den 24 Stunden von den Kulturbedingungen (Abbildung 1 jl, p) erlaubt. Die Gesamtzahl der Motoneuronen, wobei das Verhältnis zu LMCM LMCl und zwar erschien der Migration der Zellen in die LMCl Vorderhorn sehr ähnlich Abschnitten von Embryonen, die erlaubt worden war, in ovo anstatt in der Kokultur entwickeln (Abbildung 1 ko, p). So glauben wir, dass auf der Grundlage Transkriptionsfaktor Ausdruck, Zelle Anzahl und Position der Motoneuronen, rekapitulieren wir slice Kulturbedingungen normalen spinalen motorischen Neurons Entwicklung zumindest über einen 24-Stunden-Zeitraum.
Abbildung 1. a - c. Status Generation von LMC (FOXP1 Färbung inb) und LMCl (LHX-1-Färbung in einem) auf Stufe 24. c ist eine Zusammenführung der beiden Kanäle. Die Mittellinie als eine gestrichelte Linie in a und D dargestellt ist, zeigt, V die Ausrichtung des dorsoventralen (D, V) Achse des Rückenmarks d -. F. . Status LMC (FOXP1 Färbung in d) und LMCl (LHX-1-Färbung in e) Organisation auf Stufe 27 f ist eine Zusammenführung der beiden Kanäle g -. I. Lhx-1 (g) und FOXP1 (h) Expression in Abschnitte einer Scheibe in einem Medium, das kraniale Motoneuronen das Überleben der Zellen unterstützt (Guthrie Medium, unsere "anfängliche Medium" siehe Referenz 20) kultiviert. Lhx-1 nicht mehr im motorischen Neuronen exprimiert, obwohl es einige Überleben der Zellen durch LMC FOXP1 Expression nachgewiesen. D, V in (g) zeigt die Orientierung der dorsoventralen (D, V) Achse des Rückenmarks. ML zeigt die Orientierung der mediolateralen (M, L)-Achse des sPinal Netzkabel j - l. LMCl Zellen (LHX-1 im ventralen Horn in j) und die LMC allgemein (FOXP1 im k) können in Scheiben in Medium mit 4% Küken Serum und 100 ng / ml kultiviert CNTF beobachtet werden. Beachte, dass einige LMCl Zellen in einer seitlichen Position, in der ventralen Horn zu finden sind. Der Pfeil in (j) zeigt die seitliche Position einiger der den LMCl Zellen. (L) ist eine Zusammenführung der beiden Kanäle m -. O. Der Status Expression LHX-1 (m) und FOXP1 (n) in den Feldern eines Embryos in ovo während der Slice Kultur der Embryos in j gezeigt gehalten - l. (O) ist eine Zusammenführung der beiden Kanäle. P. Quantifizierung des Prozentsatzes LMCl (FOXP1 + ve / Lhx1 + ve) Zellen gegenüber LMC (FOXP1 + ve / Lhx1-ve) Krebszellen im Schnittkulturen unter verschiedenen Bedingungen gefunden cm Vergleich zu Embryonen in ovo (das entspricht 100%) gehalten steuern. Student-t-Test *** steht für p <0,01. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Discussion
Die hier beschriebene Protokoll ermöglicht einem Hühnerembryo Slice für mehr als einen Tag unter Beibehaltung Motoneuronen lebendig und weiterhin während der Anzucht migrieren inkubiert werden. In der Aufklärung der Bedingungen zu halten Motoneuronen lebendig, haben wir einige wichtige Funktionen erforderlich identifiziert. Es scheint, dass bis zu 4% chick Serum entscheidend für das Überleben von Motoneuronen und ihre Ersetzung mit Serum aus einer anderen Spezies ist wird nicht toleriert. Interessanterweise zeigte sich, dass die Anwesenheit von höheren Konzentrationen von Serum Nachteil der Scheiben, wie sie Überwachsen des Gewebes, die zu Verzerrungen im grober Form befördert Scheibe waren. Noch wichtiger ist, die Anwesenheit von cilliarer neurotrophic factor auch bewiesen kritisch. Es bleibt durchaus möglich, dass die Scheiben können möglicherweise für längere Zeiträume erheblich als nur 24 Stunden kultiviert werden, vielleicht sogar ermöglicht die Visualisierung von sensorischen afferenten Input zum Rückenmark. Zusätzlich wird die Kulturtur Bedingungen hier kann auch als nützlich erweisen, um Kulturen der Entwicklungsländer Hirnstamm und Mittelhirn / Kleinhirn schneiden.
Vielleicht die größte Potenzial bei der Verwendung dieser Scheibe Kulturbedingungen ist, dass sie die Möglichkeit für pharmakologische Manipulation Proteinfunktion gleichzeitiger Minimierung des Potentials für schädliche Wirkungen auf den Rest des Embryos, wie dem Herzen zu erleichtern. Eine große Anzahl von Inhibitoren und Agonisten der verschiedenen Signalwege verwendet werden, um die Wanderung der verschiedenen Subtypen spinalen Neuronen und möglicherweise auch deren Wirkung der Bildung lokaler spinalen Schaltungen während der Entwicklung beurteilt werden. Zusätzlich leiden einige genetische Störungen der Proteinexpression, wie jene, die die Verwendung von siRNAs und Morpholino Oligonukleotide zu machen, aus der Tatsache, dass sie nur früh in der Entwicklung eingeführt werden (aufgrund von Einschränkungen in der in-ovo-Verfahren Elektroporation) und die Effekte nur noch für eine kurze Periode des time (typischerweise ein Tag). Unsere slice Kultur wird bei späteren Stadien gestartet und bietet die Möglichkeit, diese Technologie später in der Entwicklung verwenden, um das Aufschneiden Bühne, um ihre Auswirkungen innerhalb der Periode der Kultur der Scheibe zu sehen.
Die Kokultur Protokoll könnte auch ermöglichen die Visualisierung sowohl spinale Motoneuronen sowie dorsalen Interneuronen Migration in Echtzeit über Zeitraffer-Video-Mikroskopie. Dies könnte erreicht werden mittels Phasenkontrastmikroskopie unter weißem Licht oder durch den Einsatz von Fluoreszenz-Bildgebung werden. Wenn die letztere Technik wurden dann verwendet werden die Einführung von fluoreszierenden Markierungen benötigt wird. Dies könnte entweder durch Einführung von Fluoreszenzfarbstoffen wie DiI oder DiO erreicht werden entweder über retrograde Markierung aus dem Körper oder anterograde Etikettierung vom Ventrikel oder in ovo Elektroporation von Konstrukten zur fluoreszierenden Proteine in einer Untergruppe von Neuronen anzutreiben.
Disclosures
Keiner der Autoren haben konkurrierenden Interessen oder Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir möchten Sharon Boast für viele aufschlussreiche Diskussionen und B. Novitch danken für die freundliche Gabe der Antikörper an FOXP1. Diese Arbeit durch ein Stipendium aus dem Wellcome Trust KCT und ein Projekt Beihilfe des Wellcome Trust SRP (Grant Referenznummer 094399/B/10/Z) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Henry Stewart Farms, UK | Fertilised Brown Bovan Gold Hen's eggs (Henry Stewart Farms, UK), stored at 14 °C until incubation | |
| 21 Gauge needle | BD-Microlance-3 | 304432 | |
| 5 ml syringe | BD Plastipak | 302187 | |
| #5 Dumont forceps | Roboz | RS 5045 | |
| Micro Dissecting scissors | Roboz | RS 5910SC | (3.5 in straight) |
| Embryo embedding moulds: Peel away moulds | Agar Scientific | G3764 | Pyramidal shaped 22 mm to 12 mm |
| Super glue | Power Flex, Loctite | ||
| Ethanol | SIGMA | 32221 | |
| Sodium di-hydrogen Phosphate, mono-hydrate | BDH | 102454R | |
| Di Sodium mono-hydrogen Phosphate | VWR/ BDH | 102494C | |
| Sodium Chloride | VWR/BDH | 27810.295 | |
| Low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10500-064 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| Sodium Hydroxide | FLUKA | 71689 | |
| Paraformaldehyde | VWR/BDH | 28794.295 | |
| Plastic disposable pasteur pipettes | ElKay Precision laboratory consumables | 127-P503-000 | Liquipette 3 ml volume |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170 | |
| Sucrose | SIGMA | S0389 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | SIGMA | S5761 | |
| Chicken Embryo Extract | Seralabs | CE650-J | |
| Penicillin/ Streptomycin solution | Gibco | 15070 | |
| L-Glutamine solution | Gibco | 25030 | |
| 2-mercapt–thanol | Gibco | 21985 | |
| Horse serum | Southern Group Labs | 9028B | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Neurobasal medium | Gibco | Cat ~ 2103 | |
| CilliaryNeurotrophic factor (CNTF) | R and D Systems | 557-NT-010 | |
| Chick Serum | SIGMA | C5405 | |
| Primary antibodies | were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank, with the exception of anti-foxP1 antibodies, which were a kind gift from Bennett Novitch of UCLA. Primary antibodies dilutions were Rabbit anti-FoxP1 (1/32000), Mouse anti-Lhx1/2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FoxP1 (1/1000). All antibodies were stored at 4 °C. |
||
| Secondary antibodies | Donkey anti-Guinea Pig (cy3) (1:1000) purchased from Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-Rabbit (Alexa Fluor 594) (1:1000) purchased from Invitrogen All antibodies were stored at 4 °C. |
||
| 24-well plate | Corning COSTAR | 3473 | ultralow attachment 24-well plate |
| O.C.T. | Tissue Tek, Sakura | 4583 | Optimum Cutting Temperature |
| Vectashield | Vector Labs | H1000 | Vectashield fluorescent mounting medium |
| Slides | Thermo Scientific | Superfrost-Plus positively-charged slides, 25 x 75 x 1.0 mm | |
| Cover Glass | VWR International | 631-0167 | 25x60 mm |
| Forced draft incubator: | Lyon Electric Company | kept humid by ensuring water levels always sufficient, maintained at 38 °C | |
| Cryostat | Brite, Huntingdon, UK | -36 °C | |
| Tissue Culture Incubator | DH Autoflow | Nuaire 38 °C, 5% CO2 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT1000-S | |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse E80i fluorescence microscope | |
| Digital Camera | Nikon | Nikon DS5M and Hamammatsu ORCA ER |
References
- Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: Inductive signals and transcriptional codes. Nature Reviews Genetics. 1 (1), 20-29 (2000).
- Landmesser, L. Distribution Of Motoneurons Supplying Chick Hind Limb Muscles. Journal of Physiology-London. 284, 371-389 (1978).
- Romanes, G. J. The motor pools of the spinal cord. Progress in Brain Research. 11, 93-119 (1964).
- Dasen, J. S., De Camilli, A., Wang, B., Tucker, P. W., Jessell, T. M. Hox repertoires for motor neuron diversity and connectivity gated by a single accessory factor, FoxP1. Cell. 134 (2), 304-316 (2008).
- Rousso, D. L., Gaber, Z. B., Wellik, D., Morrisey, E. E., Novitch, B. G. Coordinated actions of the forkhead protein Foxp1 and Hox proteins in the columnar organization of spinal motor neurons. Neuron. 59 (2), 226-240 (2008).
- Tsuchida, T., Ensini, M., et al. Topographic organization of embryonic motor-neurons defined by expression of limhomeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
- Kania, A., Johnson, R. L., Jessell, T. M. Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb. Cell. 102 (2), 161-173 (2000).
- Price, S. R., Garcia, N. V. D., Ranscht, B., Jessell, T. M. Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins. Cell. 109 (2), 205-216 (2002).
- Demireva, E. Y., Shapiro, L. S., Jessell, T. M., Zampieri, N. Motor Neuron Position and Topographic Order Imposed by β- and γ-Catenin Activities. Cell. 147 (3), 641-652 (2011).
- Bello, S. M., Millo, H., Rajebhosale, M., Price, S. R. Catenin-Dependent Cadherin Function Drives Divisional Segregation of Spinal Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (2), 490-505 (2012).
- Haase, G., Dessaud, E., et al. GDNF acts through PEA3 to regulate cell body positioning and muscle innervation of specific motor neuron pools. Neuron. 35 (5), 893-905 (2002).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods in Cell Biology. 51 (51), 109-124 (1996).
- Hotary, K. B., Tosney, K. W. Cellular interactions that guide sensory and motor neurites identified in an embryo slice preparation. Developmental Biology. 176 (1), 22-35 (1996).
- Krull, C. E., Tosney, K. Embryo slices and strips: Guidance and adhesion assays in the avian embryo. Methods in Cell Biology: New Methods in Avian Embryology. Bronner-Fraser, M. 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. San Diego. 97-113 (2008).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. (Reprinted From Journal Of Morphology, Vol. 88, 1951). Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Rakic, P. A century of progress in corticoneurogenesis: From silver impregnation to genetic engineering. Cerebral Cortex. 16, I3-I17 (2006).
- Bingham, S. M., Sittaramane, V., Mapp, O., Patil, S., Prince, V. E., Chandrasekhar, A. Multiple mechanisms mediate motor neuron migration in the zebrafish hindbrain. Dev. Neurobiol. 70 (2), 87-99 (2010).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Developmental Dynamics. 236 (12), 3514-3523 (2007).
- Das, R. M., Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium. J. Vis. Exp. (62), e3920 (2012).
- Barnes, S. H., Price, S. R., Wentzel, C., Guthrie, S. C. Cadherin-7 and cadherin-6B differentially regulate the growth, branching and guidance of cranial motor axons. Development. 137 (5), 805-814 (2010).
