Summary
स्लाइस संस्कृतियों जीन और औषधीय perturbations से भ्रूण के विकास के हेरफेर की सुविधा. हालांकि, संस्कृति की स्थिति सुनिश्चित करना चाहिए कि सामान्य विकास टुकड़ा की कमी पर्यावरण के भीतर कार्रवाई कर सकते हैं. हम एक प्रोटोकॉल है कि सामान्य रीढ़ की हड्डी के विकास की सुविधा के लिए कम से कम 24 घंटे के लिए आगे बढ़ना वर्णन.
Abstract
स्लाइस संस्कृतियों भ्रूण के विकास के हेरफेर की सुविधा दोनों औषधीय और जीन जोड़तोड़ के माध्यम से कर सकते हैं. इस प्रणाली में कम संभावित घातक पक्ष प्रभाव प्रणालीगत दवा अनुप्रयोगों के कारण को दूर किया जा सकता है. हालांकि, संस्कृति की स्थिति टुकड़ा के कम पर्यावरण के भीतर है कि सामान्य विकास आय सुनिश्चित करना चाहिए. हम रीढ़ की हड्डी के विकास पर ध्यान केंद्रित किया है, विशेष रूप से रीढ़ की मोटर न्यूरॉन्स की. हम व्यवस्थित बिंदु है जिस पर सबसे रीढ़ की मोटर न्यूरॉन्स पैदा हुआ था से चिकन भ्रूण स्लाइस की संस्कृति की स्थिति अलग है. हम और मोटर न्यूरॉन्स कि vivo में तुलना संस्कृति अवधि और उन मोटर न्यूरॉन्स की स्थिति के दौरान बच की संख्या प्रकार assayed. हमने पाया है कि सीरम प्रकार और neurotrophic कारकों संस्कृति अवधि के दौरान आवश्यक थे और कम से कम 24 घंटे के लिए मोटर न्यूरॉन्स को जीवित रखने के लिए और उन मोटर न्यूरॉन्स में उपयुक्त पदों को विस्थापित करने की अनुमति के लिए करने में सक्षम थेरीढ़ की हड्डी है. हम इन संस्कृति शर्तों और भ्रूण टुकड़ा eviscerated चिकन agarose में एम्बेडेड भ्रूण का उपयोग संस्कृतियों की तैयारी की पद्धति मौजूद है और एक vibratome का उपयोग कर कटा हुआ.
Introduction
सामान्य भ्रूण के विकास के दौरान, कई अलग अलग प्रकार के सेल उत्पन्न कर रहे हैं जो मूल की उनकी बात से जहाँ वे अंततः परिपक्व जीव में कार्य करेगा विस्थापित चाहिए. विकासशील रीढ़ की हड्डी के भीतर, पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं पर midline वेंट्रिकुलर क्षेत्र में स्थित हैं और कई उपप्रकारों उत्पन्न postmitotic न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं है जो कार्यात्मक neuronal संवेदी प्रसंस्करण और मोटर outputs 1 के लिए आवश्यक सर्किट में एकीकृत करने की ओर पलायन करना चाहिए. रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन्स कि अंग की मांसपेशियों के संकुचन नियंत्रण बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है और बहुत अणु और तंत्र कि उनके विभिन्न उपवर्गों के गठन ड्राइव से जाना जाता है. हालांकि, बहुत कम तंत्र है जिसके द्वारा मोटर न्यूरॉन्स को विस्थापित करने के लिए, अलग और synaptic आदानों प्राप्त की जाना जाता है.
मोटर न्यूरॉन subtype एक पदानुक्रमित फैशन में विकास के दौरान पहचान हासिल कर ली है. मोटर न्यूरॉन उपप्रकारों मोटे तौर पर मैं वर्गीकृत कर सकते हैंNto अलग कॉलम, डिवीजनों और पूल के है जो अपने अक्षतंतु अनुमानों से परिभाषित कर रहे हैं. या तो axial, आंत या अंग की मांसपेशियों के लिए मोटर परियोजना axons स्तंभ. मोटर डिवीजनों ventral या पृष्ठीय मांसपेशियों के लिए 2 पेश करने वालों में पार्श्व मोटर स्तंभ (LMC) मोटर न्यूरॉन्स पेश अंग प्रतिभाग. प्रभागों के भीतर, मोटर न्यूरॉन्स के समूहों अंग 2, 3 में व्यक्ति की मांसपेशियों के लिए मोटर पूल परियोजना करार दिया. अंग पेश मोटर न्यूरॉन्स प्रतिलेखन कारक Foxp1 4, 5 उनकी अभिव्यक्ति से परिभाषित कर रहे हैं, जबकि प्रभागीय पहचान प्रतिलेखन homeodomain (औदरीयता पेश) आइलेट-1 या LHX 1 कारकों (पृष्ठीय पेश) 6 की अभिव्यक्ति के द्वारा होती है. दरअसल, LHX-1 अभिव्यक्ति की मोटर न्यूरॉन्स 7 उपयुक्त पृष्ठीय अनुमानों के लिए आवश्यक है. इन उपप्रकारों में से प्रत्येक रीढ़ की हड्डी के भीतर अलग पदों पर कब्जा, उदर पेश मोटर न्यूरॉन्स पृष्ठीय projecti औसत दर्जे का रहते आएएनजी मोटर न्यूरॉन्स. LMC में यह परिणाम तथाकथित (LMCm) LMCmedial और LMClateral डिवीजनों (LMCl) में बांटा जा रहा है. संभागीय और मोटर पूल संगठन दो 8 चरणों में अधिग्रहण कर लिया है. पहले चरण में, प्रभागीय अलगाव एक पार्श्व फैशन के लिए औसत दर्जे विशेषता में मोटर न्यूरॉन्स के माइग्रेशन के माध्यम से हासिल की है. LMCl कोशिकाओं LMCm कोशिकाओं और इतने LMCl LMCm के माध्यम से migrates अपने अंतिम निपटाने की स्थिति को प्राप्त करने के बाद उत्पन्न होता है. दूसरे चरण में एक और मोटर न्यूरॉन पूल में विभाजन उन्हें समूहों के भीतर मोटर न्यूरॉन्स लेता है, शायद एक मोटर न्यूरॉन्स की छँटाई पृष्ठीय उदर के माध्यम से. Catenin निर्भर शास्त्रीय cadherin परिवार के सदस्यों को मोटर न्यूरॉन संगठन 8-10 के दोनों चरणों के लिए महत्वपूर्ण होना दिखाया गया है. हालांकि, कैसे cadherin समारोह सेल आंदोलन नियंत्रण खराब समझा जाता है.
खानेदार प्रभागीय, और पूल पहचान के अधिग्रहण बाह्य संकेतों की आवश्यकता है कि पैटर्न intrinsiग प्रतिलेखन 11 कारकों की अभिव्यक्ति. इसके अतिरिक्त, सभी मोटर न्यूरॉन्स की 50% के आसपास सामान्य विकास के दौरान apoptosis के माध्यम से एक प्रक्रिया है कि अंग से बाह्य संकेतों की आवश्यकता में मोटर न्यूरॉन अस्तित्व के neurotrophic समर्थन के माध्यम से बड़े पैमाने पर मर जाते हैं,. इस प्रकार, मोटर न्यूरॉन विकास करने के लिए उपयुक्त एक अपेक्षाकृत लंबे timecourse पर बनाए रखा जा वातावरण की आवश्यकता है. इस कारण से, रीढ़ की हड्डी टुकड़ा संस्कृतियों पैदा करने के लिए मोटर न्यूरॉन अस्तित्व को बनाए रखने के practicalities उपयुक्त संस्कृति शर्तों की व्याख्या की आवश्यकता होती है. पिछले भ्रूण टुकड़ा संस्कृतियों बाहर से जोड़ा neuronal आबादी 12-14 शुद्ध व्यवहार का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, हमारे ज्ञान संस्कृति शर्तों कि टुकड़ा के भीतर ही स्वस्थानी मोटर न्यूरॉन अस्तित्व और माइग्रेशन में सुविधा के लिए प्रकाशित नहीं किया गया है. हम एक मानक संस्कृति हालत कि विशुद्ध अस्तित्व की सुविधा संशोधित, dissociated कपाल मोटर न्यूरॉन्स मीटर की सुविधा के लिएएक भ्रूण टुकड़ा संस्कृति प्रणाली के भीतर otor न्यूरॉन विकास. हम भी जीवित मोटर न्यूरॉन्स की स्थिति पर नजर रखी और दिखाना है कि मोटर न्यूरॉन डिवीजनों के काफी हद तक सामान्य पदों संस्कृति अवधि के दौरान अर्जित है.
Protocol
1. आवश्यकता समाधान
- 1 एम फास्फेट बफर: 109.4 छ ना 2 4 HPO और वजन 32 छ नाह 2 4 पीओ एच 2 0 मिश्रण है, और पानी में 1 लीटर की कुल मात्रा को भंग करने के लिए.
- फास्फेट खारा (पीबीएस) buffered: 0.1 एम फॉस्फेट बफर, 0.15 एम NaCl तैयार. पीबीएस के 100 मिलीलीटर के 10 भ्रूण से स्लाइस के प्रसंस्करण के लिए पर्याप्त होना चाहिए.
- Agarose: हीट पीबीएस समाधान लगभग 70 डिग्री सेल्सियस और जोड़ने के ठोस कम पिघलने तापमान agarose धीरे धीरे whilst लगातार क्रियाशीलता. 4% की एक अंतिम एकाग्रता (w / v) agarose समाधान करें. इस समाधान के 50 मिलीलीटर की एक शेयर करें. इस समाधान एक 48 पर रखा ° C जब तक आवश्यक waterbath में छोड़ दें. प्रयोग के बाद किसी भी agarose अप्रयुक्त समाधान कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
- एंटीबॉडी ब्लॉक समाधान: एक अंतिम concentr भ्रूण बछड़ा सीरम और ट्राइटन X-1001% की समझना (v / v) भ्रूण बछड़ा सीरम, 0.1% (v / v) ट्राइटन पीबीएस में X-100. ब्लॉक समाधान के 10 मिलीलीटर cryostat वर्गों के 5 स्लाइड के immunostaining के लिए पर्याप्त होगा.
- लगानेवाला: 0.75 मिमी NaOH, 4% (w / v) (सतर्कता) paraformaldehyde तैयार. 70 करने के लिए पानी की लगानेवाला गर्मी के लिए आवश्यक राशि तैयार डिग्री सेल्सियस, आवश्यक अंतिम एकाग्रता केंद्रित NaOH जोड़ने के लिए, जब तक भंग ठोस paraformaldehyde और मिश्रण जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस तक बर्फ पर शांत इस समाधान के 10 मिलीलीटर भ्रूण स्लाइस के 20 कुओं के लिए पर्याप्त होगा.
- सुक्रोज समाधान: एक 30% (w / v) sucrose 0.1 एम फॉस्फेट बफर युक्त समाधान के 10 मिलीलीटर की तैयारी. इस समाधान के 10 मिलीलीटर भ्रूण स्लाइस के 10 कुओं के लिए पर्याप्त होगा.
- 70 (v / v)% इथेनॉल. निरपेक्ष इथेनॉल के 70 मिलीलीटर पानी की 30 मिलीलीटर के साथ पतला.
- संस्कृति के माध्यम: 1% चिकन भ्रूण निकालने, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.35% एल Glutamine, 0.1% 2 mercaptoeth एक समाधान तैयार, 4 anol.% चिकन सीरम, 2% B27 पूरक और 100 ciliaryneurotrophic एनजी / एमएल वृद्धि कारक (CNTF) सभी neurobasal माध्यम में पतला, बर्फ पर तैयार किया और उसी दिन इस्तेमाल किया. संस्कृति के माध्यम के 10 मिलीलीटर भ्रूण स्लाइस के 20 कुओं के लिए आवश्यक है.
2. चूजे के भ्रूण तैयार
- जगह एक मजबूर मसौदा इनक्यूबेटर में सबसे लंबे समय तक क्षैतिज 38 ° C जब तक वे 24 15 मंच विकसित पक्ष के साथ मुर्गियाँ अंडे निषेचित. यह आमतौर पर ऊष्मायन लगभग 4 दिनों की आवश्यकता है.
- ऊष्मायन के दूसरे दिन पर, एक ऊतक 70% इथेनॉल में भिगो कागज से पोंछते द्वारा अंडे का खोल बाँझ. ध्यान अंडा एक 21 गेज सुई का उपयोग एक 5 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी है और albumin की 5 मिलीग्राम हटा खोल के फ्लैट अंत बेध. यह भ्रूण खोल से दूर कम करती है तो जब भ्रूण खोल खोला है क्षतिग्रस्त नहीं है. इनक्यूबेटर में अंडे वापस लौटें और उन्हें एक और 2 दिनों के लिए सेते हैं.
- पा डुमोंट 5 # संदंश ग का उपयोगarefully खोल के ऊपर मध्य बेध और खोल के 9 2 सेमी के आसपास हटा दें. भ्रूण के आसपास कट और सावधानी से भ्रूण और विच्छेदन के दौरान HbSS में जगह उठा. भ्रूण हैम्बर्गर और हैमिल्टन (1992) 15 के अनुसार मंचन किया जाना चाहिए. सभी इस्तेमाल भ्रूण 24 चरण के लिए करीब होना चाहिए. भ्रूण कि विषमता के कोई लक्षण दिखाने को खारिज किया जाना चाहिए.
- भ्रूणावरण झिल्ली, chorio अपरापोषिक झिल्ली, सिर, और दो डुमोंट 5 संदंश का उपयोग अपरापोषिका निकालें. भ्रूण अंतड़ी निकालना सभी आंतरिक अंगों को दूर करने के लिए. ऐसा करने के लिए, सूक्ष्म विदारक कैंची के साथ भ्रूण के उदर midline खोलने में कटौती, संदंश की एक जोड़ी के साथ व्याख्यान चबूतरे वाला ट्रंक क्षेत्र के आसपास भ्रूण पकड़, पेट और दिल के व्याख्यान चबूतरे वाला हिस्सा हड़पने और दुमदारी से खींच. यह महत्वपूर्ण है कि इस सफाई से किया जाता है. आप को देखने के भ्रूण स्पष्ट रूप से somites में सक्षम होना चाहिए. आधे में भ्रूण कट, transversely ऊपरी और निचले अंग buds.Now बीच वक्ष शरीर ट्रिमदीवार का उपयोग कर microdissection कैंची.
3. भ्रूण स्लाइस तैयार
- पानी से स्नान agarose समाधान निकालें. कट एक डिस्पोजेबल 3 मिलीलीटर प्लास्टिक पाश्चर विंदुक के नीचे से 5 सेमी.
- धीरे से विच्छेदित दो संदंश का उपयोग करने के लिए विच्छेदन समाधान और एक सूखी पेट्री डिश में जगह के भ्रूण पालने बाहर भ्रूण की काठ आधे हटा दें. पाश्चर विंदुक का प्रयोग, agarose के 2 मिलीलीटर के आसपास हटाने, भ्रूण के शीर्ष पर विंदुक लगभग 0.5 मिलीग्राम और फिर विंदुक में भ्रूण टुकड़ा चूसना. भ्रूण और agarose स्थानांतरण एक छील दूर प्लास्टिक मोल्ड देखभाल करने के लिए agarose में कोई बुलबुले परिचय नहीं. धीरे agarose के नीचे प्लास्टिक मोल्ड में वक्ष नीचे की ओर का सामना करना पड़ अनुभाग के साथ भ्रूण कम. भ्रूण के लिए सीधे एक 21 गेज सुई का उपयोग किया जा तैनात किया जाना चाहिए. स्लाइस भी विकासशील अंग का हिस्सा होते हैं और यह महत्वपूर्ण है कि अगर में भ्रूण के उन्मुखीकरणose की अनुमति देगा. Agarose सेट बर्फ पर नाव रखें. ख्याल है कि भ्रूण अभिविन्यास (2 मिनट के आसपास) इस अवधि के दौरान परिवर्तन नहीं करता है.
- Leica VT1000S vibratome (3 स्पीड, 4 आवृत्ति, 400 सुक्ष्ममापी मोटी स्लाइस) टुकड़ा करने की क्रिया HbSS साथ भरा कक्ष के साथ सेट अप चाहिए और बर्फ के ठंडे पानी से घिरा हुआ है. agarose ब्लॉक तो सुपर गोंद के साथ vibratome मंच के लिए अटक गई है. agarose ब्लॉक agarose यह आसपास के 1-3 मिमी के साथ भ्रूण टुकड़ा छोड़ एक रेजर ब्लेड के साथ छंटनी की है. चयनित स्लाइस कि एक स्पष्ट शिखर बहिर्जनस्तरीय rigde के साथ अंग कली वर्गों में शामिल कर रहे हैं और इन स्लाइस तो HbSS में रखा जाता है. आम तौर पर, वहाँ केवल एक से दो भ्रूण प्रति उपयुक्त स्लाइस हैं. धीरे दो सुइयों का उपयोग करते हुए ऊतक स्लाइस के आसपास agarose हटा दें. यह जरूरी है कि यह अच्छी तरह से और ध्यान से किया जाता है.
4. संवर्धन भ्रूण स्लाइस
- Requir संस्कृति समाधान के 500 मिलीलीटर (ऊपर उल्लिखित) जोड़ेंएक 24-अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव इलाज टिशू कल्चर प्लेट के कुओं की संख्या एड. स्लाइस ध्यान स्थानांतरण से कुएं में HbSS समाधान. सामान्य में, हम प्रत्येक कुएं में दो से तीन स्लाइसें करने की कोशिश की है. 37 डिग्री सेल्सियस से कम 24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 24 अच्छी तरह से थाली रखें.
5. Immunostaining के लिए स्लाइस सेक्शनिंग
- संस्कृति अवधि के बाद भ्रूण स्लाइस की एक अच्छी तरह से unbuffered तय की 500 μl जोड़ने और 20 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दें. कुल समाधान तो सावधानी से निकाल दिया जाता है और तीन पीबीएस washes बाहर 5 मिनट के अंतराल के साथ किया जाता है. स्लाइस तो 4 डिग्री सेल्सियस पर sucrose समाधान में छोड़ दिया, जब तक स्लाइस सिंक, 6 घंटा के आसपास है, लेकिन लंबे समय तक के लिए (उदाहरण के लिए) रातोंरात छोड़ा जा सकता है.
- स्लाइस और अतिरिक्त sucrose समाधान बंद थपका निकालें और 20 डिग्री सेल्सियस में लगभग 5 मिनट के लिए लगभग 1 मिलीलीटर अक्टूबर में संतुलन में लाना एक अक्टूबर से भरे दूर छील प्लास्टिक मोल्ड में प्रत्येक टुकड़ा फ्लैट माउंट.बढ़ते के बाद, molds जगह खड़ी सूखी बर्फ जमना.
- Cryostat में अक्टूबर ब्लॉक माउंट और -24 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 20 मिनट के लिए ब्लॉक संतुलन में लाना. 15 मिमी Superfrost प्लस स्लाइड पर घुड़सवार वर्गों के साथ एक टुकड़ा काट. स्लाइड्स -80 पर संग्रहीत किया जा सकता ° C जब तक वे की जरूरत है.
6. इम्यूनोफ्लोरेसेंस
- पिपेट पीबीएस के 1-2 मिलीलीटर क्षैतिज कक्ष (हम 1 या 2 मिलीलीटर प्लास्टिक आटोक्लेव टेप के साथ तय pipettes का उपयोग) के नीचे से उठाया स्लाइड के साथ एक humidified कक्ष में आयोजित स्लाइड पर. 20 में 5 मिनट के लिए पीबीएस में वर्गों सेते ° C ° हटाने के अतिरिक्त अक्तूबर स्लाइड से पीबीएस समाधान निकालें और वर्गों पर ब्लॉक समाधान के 500 मिलीलीटर जोड़ने, 20 पर 30 मिनट के लिए सेते हैं सी. ब्लॉक समाधान निकालें और तुरंत पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 500 मिलीलीटर जोड़ने स्लाइड करने के लिए कहा, 4 बजे ° C 18-22 घंटे के लिए सेते हैं.
- प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और तुरंत थाज पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ 5, 20 मिनट तीन बार के लिए स्लाइड ° सी अतिरिक्त प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालने के. वर्गों पर पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के 500 मिलीलीटर जोड़ें. स्लाइड्स फिर 30 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दिया है. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तो हटा दिया है और स्लाइड 20 डिग्री सेल्सियस से कम 3 बार पीबीएस में 5 मिनट धोया
- इन washes के बाद, अंतिम PBS धोने, थपका अतिरिक्त पीबीएस हटाने के लिए स्लाइड के किनारे को दूर करने के लिए, स्लाइड्स पर vectashield की दो बूँदें जोड़ने और धीरे वर्गों पर एक गिलास coverslip रखना, बुलबुला गठन से परहेज. इमेजिंग से पहले स्लाइड के किनारे से सोख्ता द्वारा अतिरिक्त Vectashield निकालें.
7. इमेजिंग
- Immunostained वर्गों छवि. हम एक Nikon ग्रहण E80i प्रतिदीप्ति एक Hamammatsu ORCA ईआर डिजिटल कैमरा और 10 एक्स, 20X और 40 एक्स उद्देश्य लेंस के साथ सुसज्जित खुर्दबीन का उपयोग करें.
Representative Results
सुसंस्कृत स्लाइस के उपयोग interneuron और प्रक्षेपण न्यूरॉन्स के विकास का पालन 16 प्रांतस्था के भीतर संगठन की पीढ़ी के बारे में हमारी समझ को प्रगति में प्रभावशाली रहा है. रीढ़ की हड्डी में, मोटर न्यूरॉन विकास पूरे zebrafish भ्रूण की संस्कृतियों 17 का उपयोग करने का पालन किया गया है. हालांकि, रीढ़ की हड्डी zebrafish में मोटर न्यूरॉन संगठन अपेक्षाकृत आसान है (मछली में बड़े अंग मांसपेशियों की कमी के कारण). आणविक तंत्र है कि उच्च रीढ़ की विकास के दौरान रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन संगठन के एक पदानुक्रम ड्राइव वर्तमान खराब समझ रहे हैं. संस्कृति की स्थिति है कि न्यूरॉन और उच्च रीढ़ की भ्रूण टुकड़ा संस्कृतियों में सेल शरीर प्रवास के अस्तित्व को सुविधाजनक बनाने के इस प्रकार के लिए आवश्यक हैं. वर्तमान में, उच्च रीढ़ की रीढ़ की हड्डी टुकड़ा संस्कृतियों 12-14 स्लाइस के शीर्ष पर किया गया है बीज dissociated न्यूरॉन्स के लिए प्रयोग किया जाता है, टुकड़ा की परिधि में fluorescently लेबल axons की जांच18, या पूर्वज जल्दी रीढ़ की हड्डी 19 विकास में सेल व्यवहार की. बाद में रीढ़ की हड्डी डोरियों, विशेष रूप से उन है कि बनाए रखने मोटर न्यूरॉन विकास वर्तमान में कमी कर रहे हैं के लिए संस्कृति शर्तों स्लाइस.
करने के लिए रीढ़ की हड्डी में neuronal विकास का पालन करने का प्रयास कर सकते हैं, विशेष रूप से है कि रीढ़ की मोटर न्यूरॉन्स की, हम विभिन्न संस्कृति की स्थिति है कि मोटर न्यूरॉन अस्तित्व और न्यूरॉन्स के पार्श्व प्रवास के माध्यम से मोटर संगठन में प्रारंभिक आदेश के अधिग्रहण को बढ़ावा देने सकता है की जांच. प्रारंभिक 18 मंच का उपयोग कर 20 लड़की भ्रूण रीढ़ की हड्डी के स्लाइस मंच परीक्षण निरर्थक साबित कर दिया है, हम करने के लिए कुछ घंटे से अधिक देर के लिए मोटर न्यूरॉन्स को जीवित रखने के लिए सक्षम नहीं थे और संस्कृति अवधि (डेटा पर LMCl कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या की पीढ़ी का प्रदर्शन करने में असमर्थ थे नहीं दिखाया). इसलिए हम मंच के टुकड़ा संस्कृतियों 24 भ्रूण की जांच, एक Timepoint जब LMCl और LMCm न्यूरॉन्स के बहुमत उत्पन्न किया गया है, लेकिन जब LMCl न्यूरॉन मैं अपने प्रवास में अब भी हैnfancy (चित्रा 1a - ग). LMCl न्यूरॉन्स के इस पार्श्व प्रवास बड़े पैमाने पर 27 चरण तक पूरा 24 के बाद 36 घंटा (1 चित्रा df) के आसपास है. हमारी परख इस प्रकार न्यूरॉन्स को जीवित रखने और उदर सींग में अपने प्रवास laterally की सुविधा के लिए सक्षम होने के लिए सरल किया जा सकता है. हम अपेक्षाकृत सरल संस्कृति सिर्फ हांक साथ या चिकन सीरम या चिकन भ्रूण निकालने के बिना संतुलित नमक समाधान युक्त शर्तों के साथ अपने प्रयोगों को शुरू कर दिया. सभी मामलों में, हालांकि हम LMC टुकड़ा में न्यूरॉन्स को बनाए रखने में सक्षम थे, हम LMCl न्यूरॉन्स को बनाए रखा जा रहा है के कुछ सबूत पाया (कम से कम LHX-1 की अभिव्यक्ति). इसके अलावा, हम HB9 पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी में जैसे जीन के अनुचित अभिव्यक्ति, एक vivo (नहीं दिखाया डेटा) में स्थिति है कि कभी नहीं होता पाया. इस प्रकार, इन सरल संस्कृति स्थितियों मोटर न्यूरॉन संगठन के अधिग्रहण की जांच के लिए उपयुक्त नहीं हैं.
हम इस तरह से अधिक जटिल conditio की मांगएनएस और एक आधार के रूप में एक सूत्रीकरण कि dissociated भ्रूण चिकन कपाल मोटर न्यूरॉन्स के अस्तित्व को सुविधाजनक बनाने के लिए प्रकाशित किया गया है. यह हालत 20 (1% लड़की भ्रूण निकालने, 1% पेन Strep, 0.35% एल Glutamine, 0.1% 2 mercaptoethanol, 2% घोड़े सीरम, 2% B27 पूरक और neurobasal माध्यम में 50 ciliaryneurotrophic एनजी / एमएल वृद्धि कारक (CNTF) (यहाँ बुलाया गुथरी मध्यम) अधिक मोटर न्यूरॉन्स अधिक सरल मीडिया से जीवित रखा था इसके अतिरिक्त, यह पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी में प्रतिलेखन कारकों के नकली अभिव्यक्ति में परिणाम नहीं था. हालांकि, LMCl न्यूरॉन्स के अस्तित्व गरीब था (चित्रा 1 सैनिक, ) पी. इसलिए हम विभिन्न हम क्या गुथरी मध्यम, अर्थात् सीरम की मूल के पशु, सीरम की एकाग्रता और मध्यम में CNTF की एकाग्रता में महत्वपूर्ण कारक माना जाता है हमने पाया है कि हार्स सीरम से सीरम बदलने एनजी / एमएल चिकी सीरम और 50 से एनजी / एमएल 100 से CNTF की एकाग्रता में वृद्धि काफी टी वृद्धि हुईवह कोशिकाओं LMCm LMCl और के अस्तित्व और भी संस्कृति शर्तों (चित्रा jl 1, पी) के 24 घंटे से अधिक उदर सींग में अपने प्रवास की अनुमति दी. मोटर न्यूरॉन्स, LMCm की LMCl और अनुपात की कुल संख्या, वास्तव, उदर सींग में LMCl कोशिकाओं के प्रवास बहुत भ्रूण के वर्गों है कि ओवो बजाय टुकड़ा संस्कृति में विकसित करने के लिए अनुमति दी गई थी के समान दिखाई (चित्रा ko 1, पी). इस प्रकार, हमें विश्वास है कि प्रतिलेखन कारक अभिव्यक्ति, सेल नंबर और मोटर न्यूरॉन्स की स्थिति के आधार पर, हमारे टुकड़ा संस्कृति शर्तों एक 24 घंटे की अवधि में कम से कम सामान्य स्पाइनल मोटर न्यूरॉन विकास पुनरावृत्ति करना.
चित्रा 1. एक - ग. LMC की पीढ़ी की स्थिति (Foxp1 में धुंधला हो जानाख) और LMCl (LHX 1 24 स्तर पर एक) में धुंधला हो. ग दो चैनलों के एक मर्ज है. midline एक और विकास में एक बिंदीदार रेखा के रूप में दिखाया गया है, वी रीढ़ की हड्डी के dorsoventral अक्ष के उन्मुखीकरण (डी, वी) से पता चलता है घ - च. LMC (घ में Foxp1 धुंधला हो जाना) और (LHX 1 ई में धुंधला हो जाना) 27 स्तर पर संगठन LMCl की स्थिति च दो चैनलों के एक मर्ज है जी मैं. LHX-1 (छ) और (ज) एक टुकड़ा का एक माध्यम है कि कपाल मोटर न्यूरॉन सेल अस्तित्व का समर्थन करता है (गुथरी मध्यम, हमारे "प्रारंभिक मध्यम" 20 संदर्भ देखें) में संवर्धित वर्गों में अभिव्यक्ति Foxp1. LHX-1 अब मोटर न्यूरॉन्स में व्यक्त किया है, हालांकि वहाँ LMC Foxp1 अभिव्यक्ति द्वारा evidenced कोशिकाओं के कुछ अस्तित्व है. डी, वी (छ) में रीढ़ की हड्डी के dorsoventral अक्ष के उन्मुखीकरण (डी, वी) से पता चलता है. एमएल एस के mediolateral अक्ष (एम, एल) के उन्मुखीकरण से पता चलता हैपिनाल कॉर्ड जम्मू - एल. LMCl (जम्मू में उदर सींग में LHX-1) कोशिकाओं और सामान्य में LMC (Foxp1 कश्मीर में) लड़की 4% सीरम और 100 एनजी / एमएल CNTF युक्त मध्यम में संवर्धित स्लाइस में देखा जा सकता है. नोट है कि कुछ LMCl कोशिकाओं ventral सींग में एक पार्श्व स्थिति में पाए जाते हैं. में तीर (जे) LMCl कोशिकाओं के कुछ पार्श्व स्थिति से पता चलता है. (एल) दो चैनलों के एक मर्ज मीटर - ओ. - एल (एम) LHX-1 और एक जम्मू में दिखाया भ्रूण का टुकड़ा संस्कृति के दौरान ओवो में रखा भ्रूण के वर्गों में (एन) Foxp1 की अभिव्यक्ति की स्थिति. (ओ) के दो चैनलों के एक मर्ज है. LMCl का प्रतिशत (Foxp1 + ve / Lhx1 ve +) LMC बनाम कोशिकाओं (Foxp1 + ve / Lhx1 ve) विभिन्न स्थितियों में टुकड़ा संस्कृतियों में पाया कोशिकाओं के Quantitation गompared ओवो (जो 100% का प्रतिनिधित्व करते हैं) में रखा भ्रूण को नियंत्रित करने के लिए. छात्र टी परीक्षण *** पी <0.01 का प्रतिनिधित्व करता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
Discussion
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एक चिकन भ्रूण टुकड़ा whilst मोटर न्यूरॉन्स को जीवित रखने और संस्कृति की अवधि के दौरान विस्थापित जारी करने के लिए एक दिन से अधिक के लिए incubated की अनुमति देता है. शर्तों elucidating मोटर न्यूरॉन्स को जीवित रखने में, हम कई महत्वपूर्ण आवश्यक सुविधाओं की पहचान की है. ऐसा लगता है कि ऊपर 4% से लड़की सीरम मोटर न्यूरॉन्स और एक अलग प्रजाति से सीरम के साथ अपने प्रतिस्थापन के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है बर्दाश्त नहीं है. दिलचस्प है, हमने पाया है कि सीरम के उच्च सांद्रता की उपस्थिति स्लाइस के रूप में वे टुकड़ा आकार में सकल विकृतियों के प्रमुख ऊतक के अतिवृद्धि को बढ़ावा के लिए हानिकारक थे. अधिक महत्वपूर्ण बात, cilliary neurotrophic कारक की उपस्थिति भी महत्वपूर्ण साबित हुआ. यह एक अलग संभावना है है कि स्लाइस काफी लंबी अवधि के लिए सिर्फ 24 घंटा से संवर्धित किया, शायद यह भी अनुमति संवेदी अभिवाही इनपुट की रीढ़ की हड्डी को दृश्य करने में सक्षम हो सकता है रहता है. इसके अतिरिक्त, संस्कृतिture यहाँ की स्थिति भी विकासशील brainstem मध्यमस्तिष्क और / सेरिबैलम की संस्कृतियों का टुकड़ा करने के लिए उपयोगी साबित हो सकता है.
शायद इन टुकड़ा संस्कृति शर्तों के उपयोग में सबसे बड़ा संभावित लाभ है कि वे भ्रूण के बाकी पर दिल के रूप में प्रतिकूल प्रभाव के लिए क्षमता को कम करने whilst प्रोटीन समारोह के औषधीय हेरफेर के लिए संभावना की सुविधा है. और inhibitors agonists के अलग संकेत दे रास्ते की एक बड़ी संख्या में विभिन्न रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन subtypes के प्रवास और संभावित, स्थानीय विकास के दौरान रीढ़ की हड्डी में सर्किट के गठन के अपने प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, प्रोटीन अभिव्यक्ति की कुछ आनुवंशिक perturbations, उन है कि siRNAs और morpholino oligonucleotides प्रयोग कर के रूप में, तथ्य यह है कि वे केवल विकास में जल्दी शुरू किया जा सकता है (सीमाओं के कारण में ओवो electroporation प्रक्रियाओं में) और प्रभाव के लिए ही पिछले से पीड़ित टिम की एक छोटी अवधिई (आम तौर पर एक दिन). हमारे टुकड़ा संस्कृति बाद के चरणों में शुरू कर दिया है और इस प्रौद्योगिकी के विकास में बाद में टुकड़ा करने की क्रिया स्तर पर टुकड़ा की संस्कृति की अवधि के दौरान अपने प्रभाव को देखने के लिए उपयोग करने की संभावना affords.
टुकड़ा संस्कृति प्रोटोकॉल भी दोनों रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी के माध्यम से वास्तविक समय में पृष्ठीय interneuron प्रवास के दृश्य की अनुमति दे सकता है. चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग सफेद रोशनी के नीचे या प्रतिदीप्ति इमेजिंग के उपयोग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है. यदि बाद तकनीक फिर से इस्तेमाल किया जा रहे थे फ्लोरोसेंट लेबल की शुरूआत की जरूरत है. फ्लोरोसेंट रंजक के DiI या DIO रूप में लागू होने से या तो किया जा सकता है या तो अंग या वेंट्रिकल से या constructs न्यूरॉन्स की एक सबसेट में फ्लोरोसेंट प्रोटीन ड्राइव ओवो electroporation में अग्रगामी लेबलिंग से प्रतिगामी लेबलिंग के माध्यम से हासिल की है.
Disclosures
लेखकों की कोई भी हितों या हित के संघर्ष प्रतिस्पर्धा है.
Acknowledgments
हम कई व्यावहारिक विचार - विमर्श और बी Novitch के लिए एंटीबॉडी की तरह का उपहार के लिए शेरोन घमंड Foxp1 के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम के रूप में वेलकम ट्रस्ट से एक छात्रवृत्ति KCT और वेलकम ट्रस्ट से एसआरपी (अनुदान संदर्भ संख्या 094399/B/10/Z) एक परियोजना अनुदान द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Henry Stewart Farms, UK | Fertilised Brown Bovan Gold Hen's eggs (Henry Stewart Farms, UK), stored at 14 °C until incubation | |
| 21 Gauge needle | BD-Microlance-3 | 304432 | |
| 5 ml syringe | BD Plastipak | 302187 | |
| #5 Dumont forceps | Roboz | RS 5045 | |
| Micro Dissecting scissors | Roboz | RS 5910SC | (3.5 in straight) |
| Embryo embedding moulds: Peel away moulds | Agar Scientific | G3764 | Pyramidal shaped 22 mm to 12 mm |
| Super glue | Power Flex, Loctite | ||
| Ethanol | SIGMA | 32221 | |
| Sodium di-hydrogen Phosphate, mono-hydrate | BDH | 102454R | |
| Di Sodium mono-hydrogen Phosphate | VWR/ BDH | 102494C | |
| Sodium Chloride | VWR/BDH | 27810.295 | |
| Low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10500-064 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| Sodium Hydroxide | FLUKA | 71689 | |
| Paraformaldehyde | VWR/BDH | 28794.295 | |
| Plastic disposable pasteur pipettes | ElKay Precision laboratory consumables | 127-P503-000 | Liquipette 3 ml volume |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170 | |
| Sucrose | SIGMA | S0389 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | SIGMA | S5761 | |
| Chicken Embryo Extract | Seralabs | CE650-J | |
| Penicillin/ Streptomycin solution | Gibco | 15070 | |
| L-Glutamine solution | Gibco | 25030 | |
| 2-mercapt–thanol | Gibco | 21985 | |
| Horse serum | Southern Group Labs | 9028B | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Neurobasal medium | Gibco | Cat ~ 2103 | |
| CilliaryNeurotrophic factor (CNTF) | R and D Systems | 557-NT-010 | |
| Chick Serum | SIGMA | C5405 | |
| Primary antibodies | were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank, with the exception of anti-foxP1 antibodies, which were a kind gift from Bennett Novitch of UCLA. Primary antibodies dilutions were Rabbit anti-FoxP1 (1/32000), Mouse anti-Lhx1/2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FoxP1 (1/1000). All antibodies were stored at 4 °C. |
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| Secondary antibodies | Donkey anti-Guinea Pig (cy3) (1:1000) purchased from Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-Rabbit (Alexa Fluor 594) (1:1000) purchased from Invitrogen All antibodies were stored at 4 °C. |
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| 24-well plate | Corning COSTAR | 3473 | ultralow attachment 24-well plate |
| O.C.T. | Tissue Tek, Sakura | 4583 | Optimum Cutting Temperature |
| Vectashield | Vector Labs | H1000 | Vectashield fluorescent mounting medium |
| Slides | Thermo Scientific | Superfrost-Plus positively-charged slides, 25 x 75 x 1.0 mm | |
| Cover Glass | VWR International | 631-0167 | 25x60 mm |
| Forced draft incubator: | Lyon Electric Company | kept humid by ensuring water levels always sufficient, maintained at 38 °C | |
| Cryostat | Brite, Huntingdon, UK | -36 °C | |
| Tissue Culture Incubator | DH Autoflow | Nuaire 38 °C, 5% CO2 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT1000-S | |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse E80i fluorescence microscope | |
| Digital Camera | Nikon | Nikon DS5M and Hamammatsu ORCA ER |
References
- Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: Inductive signals and transcriptional codes. Nature Reviews Genetics. 1 (1), 20-29 (2000).
- Landmesser, L. Distribution Of Motoneurons Supplying Chick Hind Limb Muscles. Journal of Physiology-London. 284, 371-389 (1978).
- Romanes, G. J. The motor pools of the spinal cord. Progress in Brain Research. 11, 93-119 (1964).
- Dasen, J. S., De Camilli, A., Wang, B., Tucker, P. W., Jessell, T. M. Hox repertoires for motor neuron diversity and connectivity gated by a single accessory factor, FoxP1. Cell. 134 (2), 304-316 (2008).
- Rousso, D. L., Gaber, Z. B., Wellik, D., Morrisey, E. E., Novitch, B. G. Coordinated actions of the forkhead protein Foxp1 and Hox proteins in the columnar organization of spinal motor neurons. Neuron. 59 (2), 226-240 (2008).
- Tsuchida, T., Ensini, M., et al. Topographic organization of embryonic motor-neurons defined by expression of limhomeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
- Kania, A., Johnson, R. L., Jessell, T. M. Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb. Cell. 102 (2), 161-173 (2000).
- Price, S. R., Garcia, N. V. D., Ranscht, B., Jessell, T. M. Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins. Cell. 109 (2), 205-216 (2002).
- Demireva, E. Y., Shapiro, L. S., Jessell, T. M., Zampieri, N. Motor Neuron Position and Topographic Order Imposed by β- and γ-Catenin Activities. Cell. 147 (3), 641-652 (2011).
- Bello, S. M., Millo, H., Rajebhosale, M., Price, S. R. Catenin-Dependent Cadherin Function Drives Divisional Segregation of Spinal Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (2), 490-505 (2012).
- Haase, G., Dessaud, E., et al. GDNF acts through PEA3 to regulate cell body positioning and muscle innervation of specific motor neuron pools. Neuron. 35 (5), 893-905 (2002).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods in Cell Biology. 51 (51), 109-124 (1996).
- Hotary, K. B., Tosney, K. W. Cellular interactions that guide sensory and motor neurites identified in an embryo slice preparation. Developmental Biology. 176 (1), 22-35 (1996).
- Krull, C. E., Tosney, K. Embryo slices and strips: Guidance and adhesion assays in the avian embryo. Methods in Cell Biology: New Methods in Avian Embryology. Bronner-Fraser, M. 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. San Diego. 97-113 (2008).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. (Reprinted From Journal Of Morphology, Vol. 88, 1951). Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Rakic, P. A century of progress in corticoneurogenesis: From silver impregnation to genetic engineering. Cerebral Cortex. 16, I3-I17 (2006).
- Bingham, S. M., Sittaramane, V., Mapp, O., Patil, S., Prince, V. E., Chandrasekhar, A. Multiple mechanisms mediate motor neuron migration in the zebrafish hindbrain. Dev. Neurobiol. 70 (2), 87-99 (2010).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Developmental Dynamics. 236 (12), 3514-3523 (2007).
- Das, R. M., Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium. J. Vis. Exp. (62), e3920 (2012).
- Barnes, S. H., Price, S. R., Wentzel, C., Guthrie, S. C. Cadherin-7 and cadherin-6B differentially regulate the growth, branching and guidance of cranial motor axons. Development. 137 (5), 805-814 (2010).
