Summary
슬라이스 문화 유전자와 약리 섭동에 의해 배아 개발의 조작을 용이하게합니다. 그러나, 문화 조건은 일반적인 개발 슬라이스의 감소 환경 내에서 수행 할 수 있는지 확인해야합니다. 우리는 최소 24 시간 동안 진행되는 것이 정상적인 척추의 개발을 용이하게하는 프로토콜을 보여줍니다.
Abstract
슬라이스 문화 모두 pharmacologically 및 유전자 조작을 통해 배아 개발의 조작을 용이하게 할 수 있습니다. 이 감소 시스템에서 전신 약물 응용 프로그램으로 인해 잠재적 인 치명적인 부작용을 극복 할 수 있습니다. 그러나, 문화 조건 슬라이스의 감소 환경 내에서 일반적인 개발 진행을 확인해야합니다. 우리는 특히 척추 모터 뉴런의 것을 척수의 개발에 초점을했습니다. 우리는 체계적으로 대부분의 척추 운동 뉴런이 탄생 된 시점에서 닭 배아 슬라이스 문화 조건을 다양한. 우리는 생체에 해당에 비해 문화 기간 및 그 모터 뉴런의 위치 동안 살아 모터 뉴런의 수와 유형을 assayed. 우리는 혈청 유형과 neurotrophic 요인은 문화 기간 동안 필요했다 발견 최소 24 시간에 모터 뉴런이 살아 유지하고있는 모터 뉴런이 적절한 위치로 마이그레이션 할 수 있도록 할 수있었습니다척추. 우리는이 문화 조건 및 아가로 오스에 포함 eviscerated 닭 배아를 사용하여 배아 슬라이스 문화를 준비하는 방법을 제시하고 vibratome를 사용하여 썰어.
Introduction
정상적인 배아 발달 동안, 많은 다른 세포 유형은 원산지 자신의 관점에서 그들은 결국 성숙한 유기체에서 작동합니다 위치로 마이그레이션해야하는 생성됩니다. 개발 척수 내 전구 세포는 중간 선에서 심실 지역에 위치해 있으며, 감각 처리와 모터 출력 1 필요한 기능 neuronal 회로로 통합 마이그레이션해야합니다 postmitotic의 뉴런과 glial 세포의 여러 하위 유형을 생성합니다. 사지 근육의 수축을 제어 척수 모터 뉴런은 광범위하게 연구되었으며 대부분 서로 다른 서브 클래스의 형성을 유도 분자 및 메커니즘의 알려져 있습니다. 그러나, 훨씬 덜은 모터 뉴런이, 마이그레이션 분리 및 신경 입력을받을하여 메커니즘을 알려져 있습니다.
모터 신경 세포의 하위 유형의 신원은 계층 적 방식으로 개발되는 동안 획득 한 것입니다. 모터 신경 세포의 하위 유형은 크게 전을 분류 할 수 있습니다n 인물 별개의 열, 그들의 축삭의 계획에 의해 정의 된 부서 및 수영장. 축, 내장 또는 다리 근육 중 하나에 모터 열 프로젝트 axons합니다. 자동차 부문은 복부 나 등쪽 근육에 2를 투영 사람들에 측면 모터 열 (LMC)의 모터 뉴런을 투영 다리를 나눌. 부서 내에서 모터 뉴런의 클러스터는 다리 2, 3에서 개별 근육에 모터 풀 프로젝트를 칭했다. 사업부 신분이 homeodomain 전사 인자 췌장-1 (ventrally 투영) 또는 Lhx-1 (dorsally 예상) 6의 표현을 특징으로하는 반면, 사지 - 돌출 모터 뉴런은 전사 인자 Foxp1 4, 5 자신의 표현에 의해 정의됩니다. 사실, Lhx-1 표현은 모터 뉴런 7 적절한 등쪽의 예측이 필요합니다. 이러한 하위 유형의 각 척수 내에서 독특한 위치를 차지하고, 복부 돌출 모터 뉴런은 dorsally projecti에 안쪽 거주하는 온NG 모터 뉴런. LMC의이 결과는 소위 LMCmedial (LMCm)와 LMClateral (LMCl) 부문으로 분리된다. 사업부 및 모터 수영장 조직은 두 단계 8에 인수되어 있습니다. 첫 번째 단계에서 사업부 분리는 수평 패션에 대한 중간 특성의 모터 뉴런의 마이그레이션을 통해 달성된다. LMCl 세포는 LMCl는 최종 침전 위치를 달성하기 위해 LMCm을 통해 마이그레이션하기 때문에 LMCm 세포와 후 생성됩니다. 두 번째 단계는 모터 뉴런의 등쪽 - 복부 정렬을 통해 추측 컨데, 모터 뉴런 풀에 부서와 클러스터 그들 안에 모터 뉴런이 소요됩니다. catenin에 의존 클래식 cadherin 가족 회원은 모터 신경 조직 8-10의 두 단계에 중요한 것으로 표시되었습니다. 그러나, cadherin 기능은 세포의 움직임을 제어하는 방법을 제대로 이해된다.
원주, 사업부 및 수영장 정체성의 인수 외부 신호를 필요로하는 패턴 intrinsi전사 인자 11의 C 표현. 또한 모든 모터 뉴런의 50 % 정도는 주로 모터 신경 세포의 생존의 neurotrophic 지원을 통해, 다리에서 외부 신호를 필요로하는 과정에서 정상적인 개발 중에 apoptosis를 통해 죽어. 따라서, 모터 신경 세포 개발은 비교적 긴 timecourse으로 유지 될 수있는 적절한 환경이 필요합니다. 이러한 이유로, 모터 신경 세포의 생존을 유지하기 위해 척추의 슬라이스 문화를 생성하는 practicalities 적절한 문화 조건의 해설을 필요로합니다. 이전 배아 슬라이스 문화는 neuronal 인구에게 12-14를 extrinsically 추가 정화의 동작을 따라하는 데 사용되었습니다. 그러나, 슬라이스 자체 내에서 현장 모터 신경 세포의 생존 및 마이그레이션에 용이하게 지식 문화 조건에 게시되지 않았습니다. 우리는 정화의 생존을 촉진하는 표준 문화 조건을 수정, dissociated 두개골 모터 뉴런이 m을 촉진하기 위해배아 슬라이스 문화 시스템 내의 otor 신경 세포 개발. 우리는 또한 생존 모터 뉴런의 위치를 모니터링하고 모터 뉴런 부서의 대부분이 정상적인 위치는 문화 기간 동안 획득 한 것을 보여줍니다.
Protocol
1. 필수 솔루션 만들기
- 1 M 인산 버퍼 :. 109.4 g 오세영 2 HPO 4, 32g 아뇨 2 PO 4를 체중 H 2 0, 혼합 1 리터의 총 볼륨에 물에 용해.
- 인산염은 식염 (PBS)를 버퍼 : 0.1 M 인산 버퍼, 0.15 M NaCl을 준비합니다. PBS의 100 ML 10 배아에서 슬라이스의 처리를 위해 충분해야합니다.
- 아가로 오스 : 약 70 열 PBS 솔루션 ° C와 고체 낮은 녹는 온도가 아가로 오스를 추가 천천히 지속적으로 교반하면서. 4퍼센트의 최종 농도 (w / V) 아가로 오스에 대한 솔루션을 확인하십시오. 이 솔루션의 50 ML의 재고를 확인하십시오. 필요한 ° C까지 48 유지 waterbath에서이 솔루션을 둡니다. 실험 후 사용하지 않는 모든 아가로 오스 솔루션은 몇 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 항체 블록 솔루션 : 최종 concentr에 태아 송아지 혈청과 트리톤 Triton X-100을 추가1 %의 ation (V / V) 태아 송아지 혈청, 0.1 % (V / V) 트라이 튼 PBS에서 X-100. 블록 솔루션의 10 ML는 그라 이오 스탯 섹션 5 슬라이드 immunostaining에 충분합니다.
- 정착액 : 0.75 mm NaOH, 4 % (w / V) paraformaldehyde (주의)를 준비합니다. 70 물 정착액 열 필요 금액을 준비하는 ° C, 필요한 최종 농도에 집중 NaOH를 추가 용해 될 때까지 고체 paraformaldehyde와 혼합을 추가합니다. 4 ° C.에 얼음이 차가운 이 솔루션의 10 ML은 배아 슬라이스의 20 우물에 충분합니다.
- 자당 솔루션 : 0.1 M 인산 버퍼를 포함하는 30 % (w / V) 자당 솔루션의 10 ML를 준비합니다. 이 솔루션의 10 ML은 배아 슬라이스의 10 우물에 충분합니다.
- 70 % (V / V) 에탄올은. 물 30 ML과 절대 에탄올의 70 ML을 희석.
- 문화 매체 : 1 % 닭 배아 추출물, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 0.35 % L-글루타민, 0.1 % 2 mercaptoeth의 솔루션을 준비anol, 4퍼센트 닭 혈청, 2% B27 보충제, 100 ML / NG ciliaryneurotrophic의 성장 인자 (CNTF) neurobasal 매체에 희석 모든, 얼음에 준비하고 당일 사용됩니다. 문화 매체의 10 ML은 배아 슬라이스의 20 우물이 필요합니다.
2. 칙의 배아 준비
- 장소는 15 24 개최하기 위해 개발 ° C까지 38 강제 통풍 보육에 수평으로 긴 쪽과 암탉의 알을 수정 된. 이 사이트는 보통 부화 약 4 일이 필요합니다.
- 부화의 두 번째 날, 70 % 에탄올에 배어 휴지로 닦고하여 알 껍질을 소독. 주의 깊게 관통 5 ML의 주사기에 부착 알부민의 5 ML을 제거 21 게이지 바늘을 사용하여 알 껍질의 평면 끝. 쉘을 열 때 배아가 손상되지 않도록이 떨어져 쉘에서 배아를 낮 춥니 다. 보육에 계란을 반환하고 추가 2 일을 품다.
- 무딘 뒤몽 # 5 포셉 C를 사용arefully 피어스 쉘의 상단 중간과 쉘의 9cm이 주위를 제거합니다. 배 주위를 잘라 조심스럽게 해부하는 동안 HBSS의 배아와 장소를 올린다. 배아는 햄버거와 해밀턴 (1992) 15에 따라 조작해야합니다. 사용 된 모든 배아 무대 24 가까이에 있어야합니다. 이상의 흔적을 보여 모든 배아는 폐기해야합니다.
- 양막 막, chorio-allantoic 막, 머리와 두 개의 뒤몽 # 5 포셉을 사용하여 allantois를 제거합니다. 모든 내부 장기를 제거하는 배아를 골자를 빼 버리다. 이 작업을 수행하려면, 마이크로 해부 가위로 배의 복부 중간 선을 자르면 포셉 한 쌍의와 함께 뱃 부리 장식이있는 트렁크 지역 주변의 배아를 개최, 창자와 심장의 뱃 부리 장식이있는 부분을 잡아 당겨 caudally. 그것은이이 완전히 완료하는 것이 중요합니다. 당신은 배아 명확하게 somites 볼 수 있습니다. 횡 방향 가슴 몸을 잘라 상부 및 하부 사지 buds.Now 사이에 반으로 배아를 잘라microdissection 가위를 사용하여 벽.
3. 배아 슬라이스 준비
- 물 목욕에서 아가로 오스 솔루션을 제거합니다. 일회용 3 ML 플라스틱 파스퇴르 피펫의 바닥에서 5cm 잘라.
- 부드럽게 건조 배양 접시에 절개 솔루션과 장소의 요람 배아를하는 두 집게를 사용하여 해부 배아의 요추 절반을 제거합니다. 파스퇴르 피펫 사용하여 배아의 상단에, 아가로 오스 2 ML 주위에 피펫 약 0.5 ML를 제거한 다음 피펫으로 배아 슬라이스를 빨아. 거리에 플라스틱 금형은 아가로 오스에있는 거품을 소개하지 돌 껍질로 배와 아가로 오스를 전송합니다. 부드럽게 아래쪽을 향해 가슴 부분에 플라스틱 몰드에서 아가로 오스의 맨 아래에 배아를 낮 춥니 다. 태아는 바로 21 게이지 바늘을 사용 할 위치해야합니다. 조각은 또한 개발 사지의 일부를 포함하고 중요합니다 그 한천에 배의 방향ose이 할 수 있습니다. 아가로 오스를 설정 얼음에 배를 놓으십시오. 배아는이 기간 (2 분 정도) 동안 방향을 변경하지 않는 조심해.
- Leica VT1000S vibratome (속도 3, 주파수 4, 400 μm 두께의 슬라이스)는 HBSS로 가득 썰기 챔버와 설정하고 얼음처럼 차가운 바다로 둘러싸여 있어야합니다. 아가로 오스 블록은 다음 슈퍼 접착제로 vibratome 플랫폼에 붙어 있습니다. 아가로 오스 블록을 주변 아가로 오스 1-3 밀리 배아 조각을 떠날 면도날로 손질합니다. 명확한 꼭대기 ectodermal rigde로 사지 꽃 봉오리 섹션을 포함 슬라이스가 선택되어 있으며이 조각 나서 HBSS에 배치됩니다. 일반적으로, 태아 당 1-2 적합한 조각이 있습니다. 부드럽게 두 바늘을 사용하여 조직 슬라이스 주위 아가로 오스를 제거합니다. 그것은이는 철저하고 신중하게 이루어집니다 것이 중요합니다.
4. 배양의 배아 슬라이스
- requir에 문화 솔루션 500 ML을 (위 설명)를 추가24도 초 낮은 첨부 파일 처리 조직 문화 판 우물의 에드 번호입니다. 잘에 HBSS 용액에서주의 깊게 조각을 전송합니다. 일반적으로 우리는 각도에 2-3 조각을하려고합니다. 24 시간에 5 % CO 2와 37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터에서 24도 판을 놓습니다.
5. Immunostaining의 조각 Sectioning
- 문화 시대 따라 배아 슬라이스의 각도에 버퍼 수정 500 μl를 추가하고 20 분에 얼음에 출발합니다. 총 솔루션은 다음 조심스럽게 제거 세 PBS 세차는 5 분 간격으로 수행됩니다. 조각 그런 다음 6 시간 주변, 슬라이스 싱크까지, 4 ° C에서 자당 솔루션에 남아되어 있지만 (예 : 야간) 이상에 남아있을 수 있습니다.
- 20 ° C.에 추가 자당 솔루션에서 조각과 소량를 제거하고 약 5 분 근처에 하나 ML 10월에서 평형 거리에 껍질을 벗기면 월 채워진 플라스틱 금형 각 슬라이스 평면를 탑재합니다.장착 후, 더욱 강화하기 위해 드라이 아이스에 수직으로 금형을 배치합니다.
- 그라 이오 스탯에 10월 블록을 탑재하고 약 20 분 동안 -24 ° C에서 블록을 평형. Superfrost 플러스 슬라이드에 장착 15mm 섹션과 각 조각을 잘라 버릴거야. 그들이 필요한 ° C까지 슬라이드는 -80에서 저장 될 수 있습니다.
6. Immunofluorescence
- 챔버의 하단에 (우리가 압력솥 테이프로 고정 1 개 또는 2 ML 플라스틱 피펫을 사용하여)에서 제기 된 슬라이드를 즐길 수있는 humidified 챔버에서 개최 된 수평 슬라이드에 PBS의 피펫 1-2 ML. 20 5 분을 위해 PBS에있는 절을 길러 ° C를 초과 10월은 슬라이드에서 PBS 솔루션을 제거하고 섹션을 통해 블록 솔루션 500 ML를 추가, 20에서 30 분 동안 배양 제거하는 ° C. 블록 솔루션을 제거하고 즉시 희석 주요 항체 500 ML를 추가 ° C 18-22 시간에 대해 4에서 알을 품다, 슬라이드에 추가됩니다.
- 기본 항체 솔루션을 제거하고 즉시이었다H 20에서 5 분, 세 번이나 PBS 1 ML과 슬라이드 ° 초과 기본 항체 솔루션을 제거 할 수 C. 섹션을 통해 희석 차 항체 500 ML을 추가합니다. 슬라이드 그런 다음 30 분에 20 ° C에서 남아 있습니다. 차 항체 솔루션은 다음 제거 슬라이드 20 ° C.에 PBS에 3 회 5 분을 씻고있다
- 이 세차 후, 최종 PBS 세척을 가볍게 두드리다 초과 PBS를 제거 할 슬라이드의 가장자리를 제거 슬라이드에 vectashield 두 방울을 추가하고 부드럽게 거품 형성을 피하고 섹션을 통해 유리 coverslip을 마련. 이미징 전에 슬라이드의 가장자리에서 blotting에 의해 초과 Vectashield를 제거합니다.
7. 영상
- 이미지 immunostained 섹션. 우리는 Hamammatsu ORCA ER 디지털 카메라 및 10 X, 20X 40 X 객관적인 렌즈가 장착 된 니콘 이클립스 E80i 형광 현미경을 사용합니다.
Representative Results
interneuron과 투사 뉴런의 발전을 따르도록 교양 슬라이스의 사용은 피질 16 내 조직의 생성에 대한 우리의 이해를 진행에 영향을했습니다. 척추, 모터 신경 세포의 개발은 전체 zebrafish의 배아의 문화 17를 사용하여 다음되었습니다. 그러나, zebrafish의 척추 모터 신경 조직은 (물고기의 큰 사지 근육의 부족하기 때문에) 상대적으로 간단합니다. 높은 vertebrates의 개발 기간 동안 척추 운동 신경 조직의 계층 구조를 유도 분자 메커니즘은 현재 제대로 이해하고 있습니다. 높은 vertebrates의 배아 슬라이스 문화의 신경 세포의 생존과 전지 본체 마이그레이션을 용이하게 문화 조건에 따라서 필요합니다. 현재, 높은 vertebrates의 척추 슬라이스 문화는 슬라이스 12-14의 상단에 씨앗 dissociated 뉴런에 사용되었으며, 슬라이스의 주변에 휘황 표시 axons을 조사18 일 또는 초기 척추 개발 19 전구 세포의 행동. 특히 나중에 척추 코드, 모터 신경 세포 개발은 현재 부족 유지 사람들에게 문화 조건을 갈라.
척추 모터 뉴런의, 우리는 모터 신경 세포의 생존과 뉴런의 측면 이동을 통해 모터 조직의 초기 주문의 인수를 촉진 할 수 다양한 문화 조건을 조사 특히 것을 척추 neuronal 개발을 수행하려고 시도합니다. 20 여자의 배아 척추 슬라이스를 개최하기 위해 단계 18를 사용하여 초기 시험은 보람 입증, 우리는 몇 시간 이상은 모터 뉴런이 살아있게 할 수 없습니다와 문화 시대 (데이터를 LMCl 세포의 상당한 숫자의 생성을 설명 할 수 없습니다 ) 표시되지 않습니다. 따라서 우리는 무대의 슬라이스 문화 24 배아, LMCl 및 LMCm의 뉴런의 대부분이 생성 된 timepoint를 조사하지만, LMCl 신경 세포 이주는 내가 아직 때nfancy (그림 1a-C). LMCl 뉴런의이 측면 마이그레이션 이후 24-36 시간 (그림 1 DF) 주위 무대 27 일까지 대부분 완료됩니다. 우리 검정 따라서 뉴런이 살아있게하고 복부 뿔에 옆으로의 마이그레이션을 용이하게하는 것을 간소화 할 수있다. 우리는 함께 또는 닭 혈청 또는 닭 배아 추출물없이 행크의 균형 소금 솔루션을 포함하는 비교적 간단한 문화 조건의 실험을 시작했다. 우리가 슬라이스에 LMC의 뉴런을 유지 할 수 있었다하지만, 모든 경우에, 우리는 LMCl 뉴런이 유지되는 작은 증거를 발견 (적어도 Lhx-1의 표현으로). 또한, 우리는 등쪽의 척추 HB9와 같은 유전자의 부적절한 표현, 생체 (데이터 미도시)에 발생하지 않을 상황을 발견했다. 따라서, 다음과 같은 간단한 문화 조건은 모터 신경 조직의 인수의 조사를 위해 적합하지 않습니다.
우리는 따라서 더 복잡한 conditio을 추구NS와베이스 dissociated 배아 닭 두개골 모터 뉴런의 생존을 촉진하기 출판 된 공식을 사용으로. 이 조건은 20 일 (neurobasal 매체의 1 % 여자들의 배아 추출물, 1 % 펜 패 혈성, 0.35 % L-글루타민, 0.1 % 2-메르 캅토 에탄올, 2 % 말 혈청, 2퍼센트 B27 보충 및 50 ML / NG ciliaryneurotrophic의 성장 인자 (CNTF) (여기서 거스리 중간이라고도 함)보다 단순한 미디어보다 살아 더 많은 모터 뉴런을 유지 않았습니다. 또한이 등쪽의 척추 전사 인자의 가짜 표현 될 없습니다. 그러나, LMCl 뉴런의 생존 (그림 1 GI, 가난 했었고 P는). 따라서 우리는 우리가 거스리 매체, 혈청 기원 즉 동물, 혈청의 농도와 매체의 CNTF의 농도의 주요 요소로 간주 하잖 다양한. 우리가 찾은 그 말 혈청에서 혈청을 변경 칙 혈청 50 NG / ML 100에서 CNTF의 농도 증가에 NG / ML은 실질적으로 t 증가그는 LMCl과 LMCm 세포의 생존과도 문화 조건의 24 시간 (그림 1 JL, P)을 통해 복부 경적으로의 마이그레이션을 허용했다. 모터 뉴런, LMCl하고 LMCm의 비율의 총 수는 실제로 복부 뿔에 LMCl 세포의 이주 (그림 비켜에서가 아닌 슬라이스 문화에 발전 할 수 있었다 배아 섹션의 매우 유사 등장 한 코, P). 따라서, 우리는 전사 인자의 발현, 전화 번호 및 모터 뉴런의 위치에 따라, 우리의 슬라이스 문화 조건은 최소한 24 시간의 기간 동안 정상적인 척추 운동 뉴런 개발을 요점을 되풀이하다 생각합니다.
1 그림. - 다. LMC의 세대의 상태 (의 Foxp1 착색B)와 LMCl (단계 24에서)에서 Lhx-1 염색. C는 두 채널의 병합입니다. 중간 선이와 D에 점선으로 표시되어, V는 척추의 dorsoventral (D, V) 축 방향을 보여줍니다 D -. 6. . LMC (D에서 Foxp1 착색)와 LMCl (전자의 Lhx-1 염색) 단계 27에서 조직의 상태 F는 두 채널의 병합이다 g -. 전. Lhx-1 (g)와 Foxp1 (H) (거스리 매체, 우리의 "초기 매체"참조 20 참조) 두개의 모터 신경 세포의 생존을 지원하는 매체에 배양 한 조각의 섹션에 표현. Foxp1 표현으로 입증 LMC 세포의 일부 생존이 있지만 Lhx-1은 더 이상 모터 뉴런으로 표현되지 않습니다. (g)에서 D, V는 척추의 dorsoventral (D, V) 축 방향을 보여줍니다. ML의 s의 mediolateral (M, L) 축의 방향을 보여줍니다pinal 코드 J - 내가. LMCl 세포 (J의 복부 뿔에 Lhx-1)과 일반적으로 LMC는 (K의 Foxp1) 4퍼센트 여자는 혈청과 100 NG / ML CNTF를 포함하는 매체에 배양 조각에서 관찰 할 수 있습니다. 일부 LMCl 세포는 복부 뿔의 측면 위치에 발견됩니다. 에있는 화살표 (J)는 LMCl 세포의 일부 측면 위치를 보여줍니다. (나) 두 채널의 병합입니다 m -. 오. 난 - Lhx-1 (m)와 J에 표시되는 배아의 슬라이스 문화 중에 비켜에 보관 배아의 섹션에서 Foxp1 (n)이 표현의 상태입니다. (O) 두 채널의 병합입니다. P는. LMCl의 비율 (Foxp1 + VE / Lhx1 + VE) LMC 대 세포 (Foxp1 + VE / Lhx1-VE) 다른 조건에서 슬라이스 문화에서 발견 세포의 Quantitation C비켜 (이 100 %를 나타냅니다)에 보관 배아를 제어 할 수 ompared. 학생의 t-테스트 ***는 P <0.01를 나타냅니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 닭 배아 슬라이스가 모터 뉴런이 살아 있도록하고 문화 기간 동안 마이그레이션을 계속하면서 하루 이상 incubated 할 수 있습니다. 모터 뉴런이 살아 유지 조건을 elucidating에서, 우리는 필요한 몇 가지 주요 기능을 확인하고 있습니다. 그것은 최대 4 %의 여자의 혈청은 모터 뉴런과 다른 종의 혈청과의 교환의 생존에 중요 용납되지 않습니다 것 같습니다. 흥미롭게도, 우리는 혈청보다 높은 농도의 존재들이 슬라이스 모양의 총 왜곡로 이어지는 조직의 전면에 자라 난을 추진 같이 조각에 해로운 사실을 발견했습니다. 더 중요한 건, cilliary neurotrophic 요인의 존재도 중요이었다. 이 조각은 심지어 척수로 감각 수입 성의 입력의 시각화를 허용, 단 24 시간보다 훨씬 더 기간 동안 배양 할 수있을 수 있다는 독특한 가능성이 남아있다. 또한 막여기 진짜야 조건은 또한 개발 brainstem과 midbrain / 소뇌의 문화를 썰 유용 할 수 있습니다.
아마도 이러한 슬라이스 문화 조건의 사용에서 가장 큰 잠재적 인 혜택은 그러한 마음으로 배아의 나머지 부분에 부정적 영향에 대한 가능성을 최소화하면서 단백질 기능의 약리 조작에 대한 가능성을 촉진한다는 것입니다. 다른 신호 경로의 억제제와 agonists의 많은 수는 다른 척추 신경의 하위 유형의 마이그레이션하고, 잠재적으로, 개발 기간 동안 지역의 척추 회로의 형성에 미치는 영향을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 이러한 siRNAs 및 morpholino의 oligonucleotides의 사용을 만든 것과 같은 단백질 표현의 일부 유전자 섭동은, 그들 만 초기 개발에 도입 (비켜 electroporation 절차에의 제한하기 때문에)와에 대한 효과는 마지막으로 할 수있는 사실로 고통 팀의 짧은 기간E (보통 한 일). 우리 슬라이스 문화는 나중에 단계에서 시작하며 슬라이스의 문화의 기간 동안의 효과를 볼 수 썰기 단계에서 나중에 개발에이 기술을 사용할 수있는 가능성을 갖게된다.
슬라이스 문화 프로토콜은 모두 척추 운동 뉴런뿐만 아니라 시간 경과 비디오 현미경을 통해 실시간으로 등쪽 interneuron 이주의 시각화를 허용 할 수 있습니다. 이것은 하얀 빛 아래 또는 형광 이미징을 사용하여 위상 대비 현미경을 사용하여 달성 할 수 있습니다. 후자 기술 한 다음 사용한다면 형광 라벨의 도입이 필요합니다. 이것은 뇌실이나 뉴런의 집합에 형광 단백질을 유도 할 수 구조의 비켜 electroporation에있는 다리 또는 anterograde 라벨에서 역행 라벨 중 하나를 통해 이러한 DiI 또는 디오와 같은 형광 염료의 도입에 의해 하나 달성 할 수 있습니다.
Disclosures
저자 중 누구도 관심 분야 나 관심의 충돌을 경쟁 없습니다.
Acknowledgments
우리는 Foxp1에 항체의 종류 선물에 대한 많은 통찰력 토론 및 B. Novitch에 대한 샤론의 자랑을 감사드립니다. KCT 할 수있는 웰컴 트러스트에서 학생이기와 웰컴 트러스트에서 SRP (권한 부여 참조 번호 094399/B/10/Z)에 프로젝트 교부금으로 운용로 작동합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Henry Stewart Farms, UK | Fertilised Brown Bovan Gold Hen's eggs (Henry Stewart Farms, UK), stored at 14 °C until incubation | |
| 21 Gauge needle | BD-Microlance-3 | 304432 | |
| 5 ml syringe | BD Plastipak | 302187 | |
| #5 Dumont forceps | Roboz | RS 5045 | |
| Micro Dissecting scissors | Roboz | RS 5910SC | (3.5 in straight) |
| Embryo embedding moulds: Peel away moulds | Agar Scientific | G3764 | Pyramidal shaped 22 mm to 12 mm |
| Super glue | Power Flex, Loctite | ||
| Ethanol | SIGMA | 32221 | |
| Sodium di-hydrogen Phosphate, mono-hydrate | BDH | 102454R | |
| Di Sodium mono-hydrogen Phosphate | VWR/ BDH | 102494C | |
| Sodium Chloride | VWR/BDH | 27810.295 | |
| Low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10500-064 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| Sodium Hydroxide | FLUKA | 71689 | |
| Paraformaldehyde | VWR/BDH | 28794.295 | |
| Plastic disposable pasteur pipettes | ElKay Precision laboratory consumables | 127-P503-000 | Liquipette 3 ml volume |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170 | |
| Sucrose | SIGMA | S0389 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | SIGMA | S5761 | |
| Chicken Embryo Extract | Seralabs | CE650-J | |
| Penicillin/ Streptomycin solution | Gibco | 15070 | |
| L-Glutamine solution | Gibco | 25030 | |
| 2-mercapt–thanol | Gibco | 21985 | |
| Horse serum | Southern Group Labs | 9028B | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Neurobasal medium | Gibco | Cat ~ 2103 | |
| CilliaryNeurotrophic factor (CNTF) | R and D Systems | 557-NT-010 | |
| Chick Serum | SIGMA | C5405 | |
| Primary antibodies | were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank, with the exception of anti-foxP1 antibodies, which were a kind gift from Bennett Novitch of UCLA. Primary antibodies dilutions were Rabbit anti-FoxP1 (1/32000), Mouse anti-Lhx1/2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FoxP1 (1/1000). All antibodies were stored at 4 °C. |
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| Secondary antibodies | Donkey anti-Guinea Pig (cy3) (1:1000) purchased from Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-Rabbit (Alexa Fluor 594) (1:1000) purchased from Invitrogen All antibodies were stored at 4 °C. |
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| 24-well plate | Corning COSTAR | 3473 | ultralow attachment 24-well plate |
| O.C.T. | Tissue Tek, Sakura | 4583 | Optimum Cutting Temperature |
| Vectashield | Vector Labs | H1000 | Vectashield fluorescent mounting medium |
| Slides | Thermo Scientific | Superfrost-Plus positively-charged slides, 25 x 75 x 1.0 mm | |
| Cover Glass | VWR International | 631-0167 | 25x60 mm |
| Forced draft incubator: | Lyon Electric Company | kept humid by ensuring water levels always sufficient, maintained at 38 °C | |
| Cryostat | Brite, Huntingdon, UK | -36 °C | |
| Tissue Culture Incubator | DH Autoflow | Nuaire 38 °C, 5% CO2 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT1000-S | |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse E80i fluorescence microscope | |
| Digital Camera | Nikon | Nikon DS5M and Hamammatsu ORCA ER |
References
- Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: Inductive signals and transcriptional codes. Nature Reviews Genetics. 1 (1), 20-29 (2000).
- Landmesser, L. Distribution Of Motoneurons Supplying Chick Hind Limb Muscles. Journal of Physiology-London. 284, 371-389 (1978).
- Romanes, G. J. The motor pools of the spinal cord. Progress in Brain Research. 11, 93-119 (1964).
- Dasen, J. S., De Camilli, A., Wang, B., Tucker, P. W., Jessell, T. M. Hox repertoires for motor neuron diversity and connectivity gated by a single accessory factor, FoxP1. Cell. 134 (2), 304-316 (2008).
- Rousso, D. L., Gaber, Z. B., Wellik, D., Morrisey, E. E., Novitch, B. G. Coordinated actions of the forkhead protein Foxp1 and Hox proteins in the columnar organization of spinal motor neurons. Neuron. 59 (2), 226-240 (2008).
- Tsuchida, T., Ensini, M., et al. Topographic organization of embryonic motor-neurons defined by expression of limhomeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
- Kania, A., Johnson, R. L., Jessell, T. M. Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb. Cell. 102 (2), 161-173 (2000).
- Price, S. R., Garcia, N. V. D., Ranscht, B., Jessell, T. M. Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins. Cell. 109 (2), 205-216 (2002).
- Demireva, E. Y., Shapiro, L. S., Jessell, T. M., Zampieri, N. Motor Neuron Position and Topographic Order Imposed by β- and γ-Catenin Activities. Cell. 147 (3), 641-652 (2011).
- Bello, S. M., Millo, H., Rajebhosale, M., Price, S. R. Catenin-Dependent Cadherin Function Drives Divisional Segregation of Spinal Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (2), 490-505 (2012).
- Haase, G., Dessaud, E., et al. GDNF acts through PEA3 to regulate cell body positioning and muscle innervation of specific motor neuron pools. Neuron. 35 (5), 893-905 (2002).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods in Cell Biology. 51 (51), 109-124 (1996).
- Hotary, K. B., Tosney, K. W. Cellular interactions that guide sensory and motor neurites identified in an embryo slice preparation. Developmental Biology. 176 (1), 22-35 (1996).
- Krull, C. E., Tosney, K. Embryo slices and strips: Guidance and adhesion assays in the avian embryo. Methods in Cell Biology: New Methods in Avian Embryology. Bronner-Fraser, M. 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. San Diego. 97-113 (2008).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. (Reprinted From Journal Of Morphology, Vol. 88, 1951). Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Rakic, P. A century of progress in corticoneurogenesis: From silver impregnation to genetic engineering. Cerebral Cortex. 16, I3-I17 (2006).
- Bingham, S. M., Sittaramane, V., Mapp, O., Patil, S., Prince, V. E., Chandrasekhar, A. Multiple mechanisms mediate motor neuron migration in the zebrafish hindbrain. Dev. Neurobiol. 70 (2), 87-99 (2010).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Developmental Dynamics. 236 (12), 3514-3523 (2007).
- Das, R. M., Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium. J. Vis. Exp. (62), e3920 (2012).
- Barnes, S. H., Price, S. R., Wentzel, C., Guthrie, S. C. Cadherin-7 and cadherin-6B differentially regulate the growth, branching and guidance of cranial motor axons. Development. 137 (5), 805-814 (2010).
