Summary
Skive kulturer lette manipulering av embryo utvikling av genet og farmakologiske forstyrrelser. Imidlertid må dyrkningsbetingelser at normal utvikling kan fortsette innenfor redusert miljø av stykket. Vi illustrere en protokoll som muliggjør normal ryggmarg utvikling å fortsette i minst 24 timer.
Abstract
Skive kulturer kan lette manipulering av embryo utvikling både farmakologisk og gjennom genet manipulasjoner. I denne reduserte systemet, kan potensielle dødelige bivirkninger på grunn av systemisk stoffet applikasjoner bli overvunnet. Imidlertid må dyrkningsbetingelser sikre at normal utvikling provenyet innenfor redusert miljø av stykket. Vi har fokusert på utvikling av ryggmargen, særlig det av spinal motor nevroner. Vi systematisk variert kultur forhold kylling embryo skiver fra det punktet hvor de fleste spinal motor nevroner hadde blitt født. Vi analysert antall og type av motoriske nevroner som overlevde i kulturperiode og posisjonen av de motoriske nevroner i forhold til at in vivo. Vi fant at serum type og neurotrofiske faktorer ble kreves under kulturperiode og var i stand til å holde motor nevroner live i minst 24 timer og tillate de motoriske nevroner å migrere til hensiktsmessige stillinger iryggmargen. Vi presentere disse kultur forhold og metodikk for å forberede embryo skive kulturer bruker eviscerated kyllingembryoer innebygd i agarose og skiver med en vibratome.
Introduction
Under normal embryo utvikling, er mange forskjellige celletyper generert som må migrere fra deres synspunkt opprinnelse til hvor de vil til slutt fungere i den modne organismen. Innenfor utvikle ryggmargen, er stamceller som ligger i den ventrikulære sonen på midtlinjen og generere mange undertyper av postmitotic nevroner og gliaceller som må migrere å integrere i funksjonelle nevrale kretser som kreves for sensorisk prosessering og motorutganger en. Spinal motor nevroner som kontrollerer sammentrekning av lem muskler har blitt grundig studert, og mye er kjent av molekylene og mekanismer som driver dannelsen av deres forskjellige underklasser. Det er imidlertid mye mindre kjent av mekanismer som motor nevroner vandrer, skille og motta synaptiske innganger.
Motor neuron subtype identitet er ervervet under utvikling i et hierarkisk måte. Motor Nevron subtyper kan grovt klassifiseres into distinkte søyler, divisjoner og bassenger som er definert av sine axon anslag. Motor kolonner prosjektet aksoner til enten aksial, visceral eller lem muskler. Motor divisjoner dele opp lem prosjektering motor nevroner i lateral motor kolonnen (LMC) inn i de prosjektering til ventral eller dorsal muskler 2. Innenfor divisjonene, kalt klynger av motoriske nevroner motor bassenger prosjektet til enkelte muskler i ben 2, 3. Limb-prosjektering motor nevroner er definert av deres uttrykk for transkripsjonsfaktor 4 Foxp1, 5, mens avdelings identitet er preget av uttrykket av de homeodomain transkripsjonsfaktorer Islet-1 (ventrally prosjektering) eller Lhx-1 (dorsally prosjektering) 6. Faktisk er Lhx-1 uttrykk som kreves for de aktuelle dorsal projeksjoner av motoren nevroner 7. Hver av disse subtypene okkupere forskjellige stillinger i ryggmargen, ventral prosjektering motor nevroner kommer til å ligge mediale til dorsally projecting motor nevroner. Dette resulterer i LMC blir segregert i såkalte LMCmedial (LMCm) og LMClateral (LMCl) divisjoner. Avdelte og motor pool organisasjon er ervervet i to faser 8. I den første fasen, er avdelings segregering oppnås via en migrering av motoriske nerveceller i en karakteristisk mediale til laterale mote. De LMCl celler genereres etter LMCm celler og så LMCl vandrer gjennom LMCm å oppnå sin endelige settling posisjon. Den andre fasen tar motoriske nevroner i en divisjon og klynger dem inn motor Nevron bassenger, antagelig via en dorsal-ventral sortering av motoriske nerveceller. Medlemmer av catenin-avhengige klassisk cadherin familie har blitt vist seg å være avgjørende for begge faser av motor Nevron organisasjon 8-10. Men hvordan er cadherin funksjonen kontrollerer celle bevegelse dårlig forstått.
Oppkjøpet av columnar, avdelte og basseng identiteter krever ytre signaler som mønster intrinsic uttrykk for transkripsjonsfaktorer 11. I tillegg, rundt 50% av alle motoriske nevroner dør via apoptose under normal utvikling i en prosess som krever ytre signaler fra lem, hovedsakelig gjennom neurotrophic støtte av motor Nevron overlevelse. Dermed krever motoriske nervecellen utvikling riktig miljø for å bli opprettholdt over en relativt lang tidsforløpet. Av denne grunn, de praktiske generere ryggmargen skive kulturer for å opprettholde motor Nevron overlevelse krever klarlegging av aktuelle kultur forhold. Tidligere embryo skive kulturer har blitt brukt til å følge oppførselen til extrinsically lagt renset nevronale populasjoner 12-14. Imidlertid har våre kunnskaper kultur forhold som letter in situ motor neuron overlevelse og migrasjon innenfor sektoren selv ikke publisert. Vi modifisert en standard kultur tilstand som letter overlevelse renset, til dissosierte cranial motoriske nevroner lette mOTOR neuron utvikling innen et embryo stykke kultur-systemet. Vi også overvåket plasseringen av de overlevende motoriske nevroner og vise at hovedsakelig normale posisjoner av motoriske nevroner divisjoner er ervervet under kulturperiode.
Protocol
1. Gjør Nødvendige Solutions
- 1 M fosfatbuffer:. Vei opp 109,4 g Na 2 HPO 4 og 32 g NaH 2 PO 4 H 2 0, bland og oppløses i vann til totalt volum på 1 liter.
- Fosfatbufret saltoppløsning (PBS): Fremstill 0,1 M fosfatbuffer, 0,15 M NaCl. 100 ml PBS bør være tilstrekkelig for behandling av stykker fra 10 embryoer.
- Agarose: Heat PBS-løsning til rundt 70 ° C og tilsett fast lavtsmeltende temperatur agarose langsomt under omrøring kontinuerlig. Gjøre løsningen til en sluttkonsentrasjon på 4% (w / v) agarose. Lag et lager av 50 ml av denne løsningen. Forlate denne løsningen i et vannbad holdt ved 48 ° C inntil behov. Enhver agarose løsning ubrukt etter at forsøket kan lagres ved 4 ° C i flere uker.
- Antibody blokk: Tilsett føtalt kalveserum og Triton X-100 til en endelig konsentrasjonerasjon av 1% (v / v) føtalt kalveserum, 0,1% (v / v) Triton X-100 i PBS. 10 ml av blokk løsning vil være tilstrekkelig for den farging av 5 lysbilder av kryostat seksjoner.
- Fiksativ: Forbered 0,75 mm NaOH, 4% (w / v) paraformaldehyd (FORSIKTIG). For å forberede fiksativ varme nødvendig mengde av vann til 70 ° C, tilsett konsentrert NaOH til nødvendige sluttkonsentrasjon, legge fast paraformaldehyd og bland til oppløst. Avkjøl på is til 4 ° C. 10 ml av denne løsningen vil være tilstrekkelig for 20 brønner av embryo stykker.
- Sukrose Løsning: Forbered 10 ml av en 30% (w / v) sukrose-løsning inneholdende 0,1 M fosfatbuffer. 10 ml av denne løsningen vil være tilstrekkelig for 10 brønner av embryo stykker.
- 70% (v / v) etanol. Fortynn 70 ml absolutt etanol med 30 ml vann.
- Dyrkingsmedium: Tilbered en oppløsning av 1% kylling embryo ekstrakt, 1% penicillin / streptomycin, 0,35% L-Glutamin, 0,1% 2-mercaptoethanol, 4% kylling serum, 2% B27 supplement og 100 ng / ml ciliaryneurotrophic vekstfaktor (CNTF) alle fortynnet i neurobasal medium; forberedt på is og brukte samme dag. 10 ml kulturmedium kreves for 20 brønner av embryo stykker.
2. Chick Embryo Forberedelse
- Sted befruktede høner egg med den lengste siden horisontalt i en tvungen utkast inkubator ved 38 ° C før de utvikler å iscenesette 15 24. Dette krever vanligvis ca 4 dagers inkubering.
- På den andre dagen av inkubasjon sterilisere egg shell ved å tørke med en klut papir dyppet i 70% etanol. Nøye pierce den flate enden av egget skallet ved hjelp av en 21 gauge nål festet til en 5 ml sprøyte og fjern 5 ml albumin. Dette senker embryoet bort fra skallet slik at embryoet ikke skades når skallet åpnes. Returner eggene i inkubatoren og inkuber dem i ytterligere 2 dager.
- Bruke avstumpet Dumont # 5 tang carefully stikk midten av skallet og fjerne rundt 9 cm 2 av skall. Skjær rundt embryo og forsiktig løft ut embryo og plasser i HBSS under disseksjon. Embryoene skal være iscenesatt i henhold til Hamburger og Hamilton (1992) 15. Alle embryoer som brukes bør være på nær scenen 24. Eventuelle embryo som viser noen tegn til unormale skal kastes.
- Fjerne amnion membran, Chorio-allantoic membran, hodet, og allantois ved hjelp av to Dumont nr 5 tang. Eviscerate embryo for å fjerne alle indre organer. For å gjøre dette, kutte åpne ventrale midtlinjen av embryoet med mikro dissecting saks, hold embryo rundt rostral bagasjerommet regionen med en pinsett, ta tak i rostral del av tarmen og hjertet og trekk caudally. Det er viktig at dette blir gjort rent. Du bør være i stand til å se fosteret somites tydelig. Skjær embryo i to, tvers mellom den øvre og nedre lem buds.Now trimme thorax kroppenveggen med mikrodisseksjon saks.
3. Embryo Slice Forberedelse
- Fjern agarose løsningen fra vannbadet. Cut 5 cm fra bunnen av en disponibel 3 ml plast Pasteur pipette.
- Fjern forsiktig lumbar halvdelen av dissekerte embryoet ved hjelp av to tang til vugge embryoet ut av disseksjon løsning og sted i en tørr petriskål. Bruke Pasteur pipette, fjern rundt 2 ml av agarose, pipette ca 0,5 ml på toppen av embryoet og deretter suge opp embryoet stykke inn i pipetten. Overfør embryo og agarose til en skrelle bort plast mold tar seg ikke å innføre noen bobler i agarose. Senk embryo til bunnen av agarosen i plast mold med thorax delen vender nedover. Embryoet bør plasseres for å være rett ved hjelp av en 21 gauge nål. Sektorene vil også inneholde en del av den tredje lem, og det er viktig at orienteringen av embryoet i agarenose vil tillate dette. Plasser båten på isen for å sette agarose. Pass på at fosteret ikke endrer retning i denne perioden (rundt 2 min).
- Leica VT1000S vibratome (3 Speed, Frekvens 4, 400 mikrometer tykke skiver) skal settes opp med kutting kammer fylt med HBSS og omgitt av iskaldt vann. Agarosen blokken er så fast til vibratome plattform med superlim. Agarosen blokken er trimmet med et barberblad for å forlate embryo brikke med 1-3 mm av agarose som omgir den. Sektorene som inkluderer lem BUD seksjoner med et klart apikal ectodermal Rigde er valgt og disse skivene blir så plassert i HBSS. Vanligvis er det bare én til to passende skiver pr embryo. Fjern forsiktig agarose rundt vev skiver ved hjelp av to nåler. Det er viktig at dette gjøres grundig og nøye.
4. Dyrking Embryo Slices
- Tilsett 500 ml av kultur-løsning (beskrevet ovenfor) til required antall brønner av en 24-brønners ultralav vedlegg behandlet vevskulturplaten. Overfør skivene nøye fra HBSS oppløsningen inn i brønnen. Generelt, prøver vi å ha to til tre stykker i hver brønn. Plasser 24-brønners plate i vevskultur inkubator ved 37 ° C med 5% CO 2 i 24 timer.
5. Seksjonering skivene for farging
- Etter kulturperiode, tilsett 500 ul ubufret reparasjonen på hver brønn av embryo stykker og la på isen i 20 min. Den totale løsningen fjernes deretter forsiktig og tre PBS vaskinger utføres, med 5-minutters intervaller. Sektorene blir deretter igjen i sukrose-løsning ved 4 ° C, inntil den stykker vasken, rundt 6 hr men kan stå for lengre (f.eks over natten).
- Fjerne skiver og DAB av ekstra sukroseløsning og likevekt i rundt 1 ml oktober for rundt 5 minutter ved 20 ° C. Monter hver skive flatt i en OCT-fylt skrelle bort plast mold.Etter montering, plasser formene vertikalt på tørris å stivne.
- Monter oktober blokker i kryostaten og stabilisere blokkene ved -24 ° C i ca 20 min. Skjær hver skive med 15 mm seksjoner montert på SuperFrost-Plus lysbilder. Lysbilder kan lagres ved -80 ° C til de er nødvendig.
6. Immunfluorescens
- Pipetter 1-2 ml PBS på de horisontale lysbildene holdt i en fuktet kammer med lysbildene hevet fra bunnen av kammeret (vi bruker 1 eller 2 ml plastpipetter fiksert med autoklav tape). Inkuber seksjoner i PBS i 5 min ved 20 ° C for å fjerne overflødig oktober Fjern PBS-løsning fra lysbildet og tilsett 500 ml av blokk oppløsning over seksjonene, inkubere i 30 minutter ved 20 ° C. Oppheve sperren løsningen og umiddelbart tilsett 500 ml fortynnet primære antistoff tilsatt til lysbildene, inkuber ved 4 ° C i 18-22 timer.
- Fjern primære antistoff løsning og umiddelbart varh lysbildene med 1 ml PBS i 5 min, tre ganger ved 20 ° C for å fjerne overskudd primære antistoff løsning. Tilsett 500 ml fortynnet sekundært antistoff over seksjonene. Lysbildene er deretter igjen ved 20 ° C i 30 min. Den sekundære antistoff Løsningen blir deretter fjernet og lysbildet vasket 3 ganger 5 min i PBS ved 20 ° C.
- Etter disse vasker, fjerner den siste PBS vask, bearbeid kanten av rasgropa for å fjerne overflødig PBS, tilsett to dråper vectashield på lysbildene og forsiktig legge et dekkglass over seksjonene, unngå bobledannelse. Fjern overflødig Vectashield av blotting fra kanten av lysbildene før bildebehandling.
7. Imaging
- Bilde av immunostained seksjoner. Vi bruker et Nikon Eclipse E80i fluorescens mikroskop utstyrt med en Hamammatsu ORCA ER digitalkamera og 10 X, 20X og 40 X objektiv.
Representative Results
Bruken av dyrkede skiver å følge utviklingen av interneuron og projeksjon nevroner har vært toneangivende i går vår forståelse av den generasjonen av organisasjonen i hjernebarken 16. I ryggmargen, har motoriske nevroner utvikling blitt fulgt med kulturer av hele sebrafisk embryo 17. Imidlertid er spinal motoriske nevroner organisasjon i sebrafisk relativt enkel (på grunn av mangel på store lem muskler i fisk). De molekylære mekanismene som driver et hierarki av spinal motor nevroner organisasjon under utviklingen av høyere virveldyr er for tiden dårlig forstått. Kultur forhold som letter neuron overlevelse og cellen kroppen migrasjon i embryo slice kulturer av høyere virveldyr er dermed nødvendig. Foreløpig har ryggmargen slice kulturer av høyere virveldyr blitt brukt til frø dissosierte nevroner oppå sektorene 12-14, undersøke fluorescensmerkede axoner i periferien av stykket18, eller av stamceller atferd tidlig ryggmargen utvikling 19. Skjære kultur vilkår for senere ryggmargen, spesielt de som opprettholder er motoriske nervecellen utvikling for tiden mangler.
Å forsøke å følge spinal neuronal utvikling, særlig det av spinal motor nevroner, undersøkte vi ulike kultur forhold som kan fremme motor neuron overlevelse og oppkjøpet av første orden i motor organisasjon gjennom lateral migrasjon av nervecellene. Innledende forsøk med stadium 18 til scenen 20 chick embryo ryggmargen skiver var ufruktbare, vi var ikke i stand til å holde motor nevroner i live lenger enn noen få timer, og var i stand til å demonstrere generasjon betydelig antall LMCl celler over kulturen perioden (data ikke vist). Vi har derfor undersøkt slice kulturer av scenen 24 embryoer, en Tidspunkt når flertallet av LMCl og LMCm nevroner er generert, men når LMCl neuron migrasjon er fortsatt i sin jegnfancy (Figur 1a-c). Dette lateral migrasjon av LMCl nevroner er i stor grad ferdig med scenen 27, rundt 24 til 36 hr senere (Figur 1 df). Vår analysen således kunne forenkles til å kunne holde de neurons live og å lette deres migrasjon lateralt i ventrale horn. Vi startet våre eksperimenter med relativt enkle dyrkningsbetingelser inneholdende bare Hanks balanserte saltløsning med eller uten kylling serum eller kylling embryo ekstrakt. I alle tilfeller, selv om vi var i stand til å opprettholde LMC nevroner i stykket, fant vi lite bevis for LMCl nevroner opprettholdes (minst ved uttrykk for Lhx-1). Videre har vi funnet upassende ekspresjon av gener som HB9 i dorsal ryggmarg, en situasjon som aldri forekommer in vivo (data ikke vist). Dermed disse enkle kultur forholdene ikke er egnet for undersøkelse av oppkjøpet av motoriske nervecellen organisasjon.
Vi dermed søkt ut mer kompleks conditions og som en base brukt en formulering som er publisert for å lette overlevelse av dissosiert embryonale kylling kraniale motoriske nevroner. Denne tilstanden 20 (1% kylling embryo ekstrakt, 1% Pen Strep, 0,35% L-Glutamin, 0,1% 2-merkaptoetanol, 2% hest serum, 2% B27 supplement og 50 ng / ml ciliaryneurotrophic vekstfaktor (CNTF) i neurobasal medium (her kalt Guthrie medium) har beholdt flere motoriske nevroner i live enn de mer enkle media. I tillegg, det gjorde ikke føre falsk uttrykk for transkripsjonsfaktorer i dorsal ryggmargen. Men overlevelsen av LMCl nevroner var dårlig (Figur 1 GI, p). Derfor variert hva vi anses å være viktige faktorer i Guthrie mediet, nemlig dyret opprinnelsesland serum, konsentrasjonen av serum og konsentrasjonen av CNTF i mediet. Vi fant at endre serum fra hest serum til Chick serum og en økning i konsentrasjonen av CNTF fra 50 ng / ml til 100 ng / ml betydelig økt than overlevelse LMCl og LMCm celler og også tillatt migrasjon inn ventrale horn over 24 hr av dyrkningsbetingelser (figur 1 jl, p). Det totale antallet motor nevroner, forholdet mellom LMCm til LMCl og faktisk dukket migrasjon av LMCl celler i ventrale horn svært lik deler av embryoer som hadde fått lov til å utvikle seg i ovo heller enn i stykket kultur (figur 1 ko, p). Dermed tror vi at basert på transkripsjonsfaktor uttrykk, celle nummer og plassering av motoriske nevroner, våre slice dyrkningsbetingelser rekapitulere normal spinal motor neuron utvikling minst over en 24 timers periode.
Figur 1. a - c. Status for generering av LMC (Foxp1 flekker ib) og LMCl (Lhx-1 farging i en) på trinn 24. c er en sammenslåing av de to kanalene. Midtlinjen er vist som en stiplet linje i en og D, viser V orienteringen av dorsoventral (D, V) aksen av ryggmargen d -. F. . Status for LMC (Foxp1 flekker i d) og LMCl (Lhx-1 farging i e) organisasjon på scenen 27 f er en sammenslåing av de to kanalene g -. Jeg. Lhx-1 (g) og Foxp1 (h) uttrykk i deler av et stykke dyrket i et medium som støtter cranial motor neuron celle overlevelse (Guthrie medium, vår "første medium" se referanse 20). Lhx-1 ikke lenger uttrykt i motoriske neuroner, selv om det er noen overlevelse LMC celler dokumentert av Foxp1 uttrykk. D, V i (g) viser orienteringen av dorsoventral (D, V) aksen av ryggmargen. ML viser orienteringen av mediolateral (M, L) akse sPinal ledningen j - l. LMCl celler (Lhx-1 i ventrale horn i j) og LMC generelt (Foxp1 i k) kan observeres i skiver dyrket i medium som inneholder 4% chick serum og 100 ng / ml CNTF. Oppmerksom på at noen LMCl celler finnes i en lateral posisjon i ventrale horn. Pilen i (j) viser sideleie av noen av de de LMCl cellene. (L) er en sammenslåing av de to kanalene m -. O. Status for ekspresjon av Lhx-1 (m) og Foxp1 (n) i deler av et embryo holdt i ovo under stykke kulturen av embryoet vist i j - L. (O) er en sammenslåing av de to kanalene. S.. Kvantifisering av andel av LMCl (Foxp1 + ve / Lhx1 + ve) celler versus LMC (Foxp1 + ve / Lhx1-ve) celler som finnes i skive kulturer i ulike forhold compared å kontrollere embryoer holdt i ovo (som representerer 100%). Student t-test *** representerer p <0,01. Klikk her for å se større figur .
Discussion
Protokollen er beskrevet her gjør en kylling embryo stykke å bli inkubert i mer enn én dag mens du holder motor nevroner i live og fortsette å migrere under kultur perioden. I belyse forholdene for å holde motor nevroner i live, har vi identifisert flere viktige funksjoner som kreves. Det ser ut til at opptil 4% chick serum er avgjørende for overlevelsen av motoriske nevroner og dens erstatning med serum fra en annen art er ikke tolerert. Interessant, fant vi at tilstedeværelsen av høyere konsentrasjoner av serum var skadelig for sektorene som de fremmet overvekst av vev fører til brutto skjevheter i stykke figuren. Enda viktigere, tilstedeværelse av cilliary neurotrophic faktor også vist kritisk. Det gjenstår en distinkt mulighet for at skivene kan være i stand til å bli dyrket i betydelig lengre perioder enn bare 24 timer, kanskje til og med slik at visualisering av sensorisk afferent input til ryggmargen. Tillegg, culture forholdene her kan også være nyttig å skjære kulturer i utviklingsland hjernestammen og midthjernen / lillehjernen.
Kanskje den største potensielle fordelen i bruken av disse skive dyrkningsbetingelser er at de lette muligheten for farmakologisk manipulering av protein funksjon samtidig minimere potensialet for uønskede effekter på resten av embryoet, som hjertet. Et stort antall inhibitorer og agonister av ulike signalveier kan brukes til å vurdere den migrering av forskjellige spinal neuron subtyper og eventuelt deres virkning av dannelsen av lokale spinal kretser under utviklingen. I tillegg, noen genetiske perturbasjoner av protein ekspresjon, slik som de som gjør bruk av siRNAs og morfolino oligonukleotider, lider av det faktum at de bare kan bli introdusert tidlig i utviklingen (grunnet begrensninger ii ovo electroporation prosedyrer) og effektene bare vare en kort periode time (typisk en dag). Vår stykke kultur startes på senere stadier og gir muligheten til å bruke denne teknologien senere i utviklingen på slicing scenen for å vise sine effekter i løpet av kulturen i stykket.
Stykket kultur protokollen kunne også tillate visualisering av både spinale motoriske nevroner samt dorsal interneuron migrasjon i sanntid via time-lapse video mikroskopi. Dette kan oppnås ved hjelp av fasekontrast mikroskopi under hvitt lys eller gjennom bruk av fluorescens-avbildning. Hvis sistnevnte teknikken skulle brukes deretter innføring av fluorescerende etiketter er nødvendig. Dette kan oppnås enten ved innføring av fluorescerende fargestoffer som Dii eller dio via enten retrograd merking fra lem eller anterograd merking fra ventrikkelen eller ovo elektroporering av konstruksjoner for å drive fluorescerende proteiner i en undergruppe av nerveceller.
Disclosures
Ingen av forfatterne har konkurrerende interesser eller interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Sharon Skryt for mange innsiktsfulle diskusjoner og B. Novitch for den type gave av antistoff mot Foxp1. Dette arbeidet som finansieres av en studieplass fra Wellcome Trust til KCT og et prosjekt stipend fra Wellcome Trust til SRP (Grant referansenummer 094399/B/10/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Henry Stewart Farms, UK | Fertilised Brown Bovan Gold Hen's eggs (Henry Stewart Farms, UK), stored at 14 °C until incubation | |
| 21 Gauge needle | BD-Microlance-3 | 304432 | |
| 5 ml syringe | BD Plastipak | 302187 | |
| #5 Dumont forceps | Roboz | RS 5045 | |
| Micro Dissecting scissors | Roboz | RS 5910SC | (3.5 in straight) |
| Embryo embedding moulds: Peel away moulds | Agar Scientific | G3764 | Pyramidal shaped 22 mm to 12 mm |
| Super glue | Power Flex, Loctite | ||
| Ethanol | SIGMA | 32221 | |
| Sodium di-hydrogen Phosphate, mono-hydrate | BDH | 102454R | |
| Di Sodium mono-hydrogen Phosphate | VWR/ BDH | 102494C | |
| Sodium Chloride | VWR/BDH | 27810.295 | |
| Low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10500-064 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| Sodium Hydroxide | FLUKA | 71689 | |
| Paraformaldehyde | VWR/BDH | 28794.295 | |
| Plastic disposable pasteur pipettes | ElKay Precision laboratory consumables | 127-P503-000 | Liquipette 3 ml volume |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170 | |
| Sucrose | SIGMA | S0389 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | SIGMA | S5761 | |
| Chicken Embryo Extract | Seralabs | CE650-J | |
| Penicillin/ Streptomycin solution | Gibco | 15070 | |
| L-Glutamine solution | Gibco | 25030 | |
| 2-mercapt–thanol | Gibco | 21985 | |
| Horse serum | Southern Group Labs | 9028B | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Neurobasal medium | Gibco | Cat ~ 2103 | |
| CilliaryNeurotrophic factor (CNTF) | R and D Systems | 557-NT-010 | |
| Chick Serum | SIGMA | C5405 | |
| Primary antibodies | were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank, with the exception of anti-foxP1 antibodies, which were a kind gift from Bennett Novitch of UCLA. Primary antibodies dilutions were Rabbit anti-FoxP1 (1/32000), Mouse anti-Lhx1/2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FoxP1 (1/1000). All antibodies were stored at 4 °C. |
||
| Secondary antibodies | Donkey anti-Guinea Pig (cy3) (1:1000) purchased from Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-Rabbit (Alexa Fluor 594) (1:1000) purchased from Invitrogen All antibodies were stored at 4 °C. |
||
| 24-well plate | Corning COSTAR | 3473 | ultralow attachment 24-well plate |
| O.C.T. | Tissue Tek, Sakura | 4583 | Optimum Cutting Temperature |
| Vectashield | Vector Labs | H1000 | Vectashield fluorescent mounting medium |
| Slides | Thermo Scientific | Superfrost-Plus positively-charged slides, 25 x 75 x 1.0 mm | |
| Cover Glass | VWR International | 631-0167 | 25x60 mm |
| Forced draft incubator: | Lyon Electric Company | kept humid by ensuring water levels always sufficient, maintained at 38 °C | |
| Cryostat | Brite, Huntingdon, UK | -36 °C | |
| Tissue Culture Incubator | DH Autoflow | Nuaire 38 °C, 5% CO2 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT1000-S | |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse E80i fluorescence microscope | |
| Digital Camera | Nikon | Nikon DS5M and Hamammatsu ORCA ER |
References
- Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: Inductive signals and transcriptional codes. Nature Reviews Genetics. 1 (1), 20-29 (2000).
- Landmesser, L. Distribution Of Motoneurons Supplying Chick Hind Limb Muscles. Journal of Physiology-London. 284, 371-389 (1978).
- Romanes, G. J. The motor pools of the spinal cord. Progress in Brain Research. 11, 93-119 (1964).
- Dasen, J. S., De Camilli, A., Wang, B., Tucker, P. W., Jessell, T. M. Hox repertoires for motor neuron diversity and connectivity gated by a single accessory factor, FoxP1. Cell. 134 (2), 304-316 (2008).
- Rousso, D. L., Gaber, Z. B., Wellik, D., Morrisey, E. E., Novitch, B. G. Coordinated actions of the forkhead protein Foxp1 and Hox proteins in the columnar organization of spinal motor neurons. Neuron. 59 (2), 226-240 (2008).
- Tsuchida, T., Ensini, M., et al. Topographic organization of embryonic motor-neurons defined by expression of limhomeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
- Kania, A., Johnson, R. L., Jessell, T. M. Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb. Cell. 102 (2), 161-173 (2000).
- Price, S. R., Garcia, N. V. D., Ranscht, B., Jessell, T. M. Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins. Cell. 109 (2), 205-216 (2002).
- Demireva, E. Y., Shapiro, L. S., Jessell, T. M., Zampieri, N. Motor Neuron Position and Topographic Order Imposed by β- and γ-Catenin Activities. Cell. 147 (3), 641-652 (2011).
- Bello, S. M., Millo, H., Rajebhosale, M., Price, S. R. Catenin-Dependent Cadherin Function Drives Divisional Segregation of Spinal Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (2), 490-505 (2012).
- Haase, G., Dessaud, E., et al. GDNF acts through PEA3 to regulate cell body positioning and muscle innervation of specific motor neuron pools. Neuron. 35 (5), 893-905 (2002).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods in Cell Biology. 51 (51), 109-124 (1996).
- Hotary, K. B., Tosney, K. W. Cellular interactions that guide sensory and motor neurites identified in an embryo slice preparation. Developmental Biology. 176 (1), 22-35 (1996).
- Krull, C. E., Tosney, K. Embryo slices and strips: Guidance and adhesion assays in the avian embryo. Methods in Cell Biology: New Methods in Avian Embryology. Bronner-Fraser, M. 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. San Diego. 97-113 (2008).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. (Reprinted From Journal Of Morphology, Vol. 88, 1951). Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Rakic, P. A century of progress in corticoneurogenesis: From silver impregnation to genetic engineering. Cerebral Cortex. 16, I3-I17 (2006).
- Bingham, S. M., Sittaramane, V., Mapp, O., Patil, S., Prince, V. E., Chandrasekhar, A. Multiple mechanisms mediate motor neuron migration in the zebrafish hindbrain. Dev. Neurobiol. 70 (2), 87-99 (2010).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Developmental Dynamics. 236 (12), 3514-3523 (2007).
- Das, R. M., Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium. J. Vis. Exp. (62), e3920 (2012).
- Barnes, S. H., Price, S. R., Wentzel, C., Guthrie, S. C. Cadherin-7 and cadherin-6B differentially regulate the growth, branching and guidance of cranial motor axons. Development. 137 (5), 805-814 (2010).
