Summary
Slice культур облегчения манипуляций развития эмбриона путем генной и фармакологической возмущения. Тем не менее, культура условия должны обеспечить нормальное развитие может продолжаться в течение уменьшить среды срез. Проиллюстрируем это протокол, который способствует нормальному развитию спинной шнур продолжаться в течение по крайней мере 24 часов.
Abstract
Slice культур может облегчить манипуляции развития эмбриона и фармакологически, и через генной манипуляции. В этом приведенная система, потенциальные смертельные побочные эффекты, в связи с системными приложениями препарат может быть преодолен. Тем не менее, культура условия должны обеспечить нормальное развитие идет по сниженной среду срез. Мы сосредоточились на развитии спинного мозга, в частности, что из нейронов спинного мозга двигателя. Мы систематически изменять условия культивирования кусочков куриного эмбриона от точки, в которой большинство нейронов спинного мозга двигатель был рожден. Мы анализировали количество и тип моторных нейронов, которые выжили в период культуре и позиция тех моторных нейронов по сравнению с, что в естественных условиях. Мы обнаружили, что сыворотка типа и нейротрофических факторов должны были в течение периода культивирования и смогли сохранить моторных нейронов жив по крайней мере, 24 часа в сутки и позволит тем моторных нейронов перейти на соответствующие должности вспинного мозга. Мы представляем эти условия культивирования и методологии подготовки эмбрионов срез культур с использованием куриных эмбрионов потрошился встроенные в агарозном и нарезанный использованием vibratome.
Introduction
Во время нормального развития эмбриона, много различных типов клеток генерируются, которые должны мигрировать с их точки происхождения, где они в конечном итоге работает в зрелом организме. В развивающихся спинного мозга, клеток-предшественников расположены в вентрикулярной зоне в средней линии и генерировать много подтипов постмитотических нейронов и глиальных клеток, которые должны мигрировать к интеграции в функциональных нейронных цепей необходимых для обработки сенсорных и моторных выходов 1. Спинной моторные нейроны, которые контролируют сокращения мышц конечностей были тщательно изучены и многое известно о молекулах и механизмов, которые управляют формированием их различных подклассов. Тем не менее, известно гораздо меньше механизмов, с помощью которых моторные нейроны мигрируют, разделения и получать синаптических входов.
Двигательного нейрона подтипа личности, приобретенных в течение развития в иерархическом порядке. Двигательного нейрона подтипы могут быть широко классифицированы яNto различных столбцов, отделов и бассейны, которые определяются их проекции аксонов. Мотор колонны проекта аксоны либо осевой, висцеральный или мышц конечностей. Мотор подразделений разделить конечностей проектирование моторных нейронов бокового столбца двигателя (БМО) в тех проектирования до живота или спины мышцы 2. В подразделений, групп моторных нейронов называется проект двигателя бассейнов отдельных мышц конечностей 2, 3. Limb-проектирования моторных нейронов определяются их выражение фактор транскрипции Foxp1 4, 5, в то время как дивизии личность характеризуется выражением гомеодоменовых транскрипционных факторов Иле-1 (проектирование снизу) или LHX-1 (проектирование сверху) 6. Действительно, LHX-1 выражения, необходимые для соответствующего спинной проекции моторных нейронов 7. Каждый из этих подтипов занимают различные должности в спинном мозге, брюшной проектирование двигательных нейронов приходят на проживание медиальнее сверху projectiнг моторных нейронов. Это приводит к LMC быть разделены на так называемые LMCmedial (LMCm) и LMClateral (LMCl) подразделений. Ведомственные и автомобильного парка организация приобрела в два этапа 8. На первом этапе, отделов сегрегация осуществляется через миграцию моторных нейронов в характерной медиальнее бокового моды. LMCl клетки образуются после LMCm клетки и так LMCl мигрирует через LMCm достичь своей окончательной позиции расселения. На втором этапе происходит моторных нейронов в разделении и кластеров их в двигатель бассейны нейронов, предположительно, через спинной-вентральной сортировки моторных нейронов. Члены катенин-зависимых классической семьи кадгерина было показано, что решающее значение для обеих фазах двигательного нейрона 8-10 организации. Однако, как кадгерина функция управляет клеточного движения еще плохо изучены.
Приобретение столбчатые, отделов и бассейн тождества требует внешних сигналов, что картина intrinsiС экспрессии транскрипционных факторов 11. Кроме того, около 50% всех моторных нейронов умереть через апоптоз во время нормального развития в процесс, который требует внешних сигналов от конечностей, в основном за счет нейротрофических поддержку выживание двигательных нейронов. Таким образом, двигательный нейрон развития требует соответствующих условий будет поддерживаться в течение относительно длительного timecourse. По этой причине, практические аспекты создания спинного культур срез кабеля для поддержания двигательных нейронов выживания требуют выяснения соответствующих условий культуры. Предыдущий культур срез зародыша были использованы, чтобы следить за поведением внешне добавил очищенной популяции нейронов 12-14. Однако, по нашим сведениям культуры условий, способствующих на месте двигательных нейронов выживания и миграции в себе кусочек не были опубликованы. Мы изменили стандартное условие культуры, которая способствует выживанию очищают, диссоциированных черепных моторных нейронов для облегчения мOTOR нейрона развития в системе культуры срез зародыша. Мы также следили за позиционирование сохранившихся двигательных нейронов и продемонстрировать, что в значительной степени нормальное положение двигательного нейрона подразделениями, приобретенных в течение периода культивирования.
Protocol
1. Сделать Необходимые решения
- 1 M фосфатный буфер. Взвесить 109,4 г Na 2 HPO 4 и 32 г NaH 2 PO 4 H 2 0, смешать и растворить в воде общего объема 1 л.
- Фосфатным буферным раствором (PBS): Подготовка 0,1 М фосфатный буфер, 0,15 М NaCl. 100 мл PBS должно хватить для обработки срезов из 10 эмбрионов.
- Агарозы: Тепло PBS решение около 70 ° C и добавить твердый низкой температурой плавления агарозы в то время как медленно постоянно помешивая. Сделайте раствор до конечной концентрации 4% (вес / объем) агарозы. Сделайте запас 50 мл этого раствора. Оставьте этот раствор на водяной бане выдерживают при 48 ° C, пока требуется. Любое решение агарозном неиспользованные после эксперимента можно хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких недель.
- Антитела блок решение: Добавить эмбриональной телячьей сыворотки и тритона Х-100 до конечной концентрATION 1% (V / V) эмбриональной телячьей сыворотки, 0,1% (V / V) Тритон Х-100 в PBS. 10 мл блоке решения будет достаточно для иммуноокрашивания из 5 слайдов криостата разделов.
- Fixative: Подготовка 0,75 мм NaOH, 4% (вес / объем) параформальдегида (ВНИМАНИЕ). Для подготовки фиксатора тепла, необходимого количества воды до 70 ° C, добавляют концентрированной NaOH до необходимой конечной концентрации, добавьте твердый параформальдегид и перемешать до полного растворения. Прохладный на льду до 4 ° C. 10 мл этого раствора хватит на 20 скважинах эмбриона ломтиками.
- Раствор сахарозы: Подготовка 10 мл 30% (вес / объем) раствор сахарозы, содержащий 0,1 М фосфатного буфера. 10 мл этого раствора хватит на 10 скважинах эмбриона ломтиками.
- 70% (объем / объем) этанола. Развести 70 мл абсолютного этилового спирта с 30 мл воды.
- Культура Medium: Приготовьте раствор 1% экстракт куриных эмбрионов, 1% пенициллина / стрептомицина, 0,35% L-глютамин, 0,1% 2-mercaptoethanol, 4% курицы сыворотки, 2% B27 добавки и 100 нг / мл ciliaryneurotrophic фактор роста (CNTF) все разводят в Neurobasal среды, подготовленный на льду и использовали тот же день. 10 мл культуральной среды необходима для 20 скважин эмбриона ломтиками.
2. Приготовление куриного эмбриона
- Место оплодотворенные яйца кур с длинной стороной горизонтально в принудительной тягой инкубаторе при 38 ° C, пока они развиваются на сцене 15 24. Для этого обычно требуется около 4 дней инкубации.
- На второй день инкубации, стерилизовать яичной скорлупы, вытирая салфеткой бумаги, смоченной в 70% этанола. Аккуратно проткнуть плоский конец яичной скорлупы использованием 21-игла прикреплена к 5 мл шприц и удалите 5 мл альбумина. Это снижает эмбриона в сторону от корпуса таким образом, эмбрион не был поврежден, когда корпус открыт. Вернуться яйца в инкубатор и инкубировать их в течение еще 2 дней.
- Использование затупленных Дюмон # 5 щипцы сarefully пробить верхнюю середину корпуса и удалить около 9 см 2 оболочки. Вырезать вокруг эмбриона и осторожно выньте эмбриона и место в HBSS во время вскрытия. Эмбрионы должны быть организованы в соответствии с Гамбургер и Hamilton (1992) 15. Все эмбрионы должны быть использованы на стадии близкой к 24. Любой эмбрионов, которые проявляют никаких признаков аномалии должны быть отброшены.
- Снимите амниона мембраны, хорио-аллантоисной мембраны, голова, и аллантоиса с помощью двух Дюмон # 5 щипцов. Потрошение эмбриона, чтобы удалить все внутренние органы. Чтобы сделать это, разрезать вентральной срединной линии эмбриона с микро-рассечение ножницами, держа эмбриона вокруг ростральной области ствол с одной парой щипцов, возьмите ростральной части кишки и сердце, и тянуть каудально. Важно, что это делается чисто. Вы должны быть в состоянии видеть зародыш сомитов ясно. Вырезать зародыш в два раза, поперечно между верхней и нижней конечности buds.Now обрезать грудной теластене с помощью микродиссекции ножницы.
3. Подготовка эмбрионов Slice
- Снимите решение агарозы из водяной бане. Отрежьте 5 см от дна одноразовые 3 мл пластиковые пипетки Пастера.
- Аккуратно удалите поясничного половина расчлененного эмбрион, используя два пинцета к колыбели эмбриона из раствора вскрытие и место в сухих чашки Петри. С помощью пипетки Пастера, удалить около 2 мл агарозы, пипетки примерно 0,5 мл на верхней части эмбриона, а затем сосать кусочек эмбриона в пипетку. Трансфер эмбрионов и агарозы в удаляйте пластиковые формы заботиться, чтобы не вводить никаких пузырьков в агарозы. Осторожно опустите эмбриона на дно агарозы в пластиковые формы с грудного отдела вниз. Эмбрион должен быть установлен для прямого использования 21-иглой. Ломтиками также будет содержать часть развивающейся конечности, и важно, что ориентация эмбриона в агареOSE позволит этого. Установите лодку на лед, чтобы установить агарозы. Заботьтесь о том, что эмбрион не меняет ориентацию в течение этого периода (около 2 мин.)
- Leica VT1000S vibratome (Speed 3, частота 4, 400 мкм толстыми ломтиками) должны быть настроены с нарезки камере, заполненной HBSS и окружен ледяной водой. Блок агарозы, затем застрял в vibratome платформы с супер клеем. Блок агарозном обрезается лезвием бритвы, чтобы оставить эмбриона части с 1-3 мм агарозы, окружающих его. Ломтиками, которые включают разделы зачатка конечности с четко апикальной эктодермального rigde выбраны и эти кусочки помещают в HBSS. Вообще, есть от одного до двух подходящих срезов за один эмбрион. Аккуратно удалите агарозном вокруг срезах тканей с помощью двух игл. Важно, что это будет сделано тщательно и осторожно.
4. Ломтики культивирования эмбрионов
- Добавить 500 мл культуры решении (см. выше) в requirред количество скважин из 24-и ультра низкой привязанности рассматривается планшета для культуры ткани. Перенесите ломтики тщательно от HBSS раствор в скважину. В общем, мы стараемся от двух до трех кусочков в каждую лунку. Поместите 24-луночный планшет в культуре ткани инкубаторе при температуре 37 ° C с 5% CO 2 в течение 24 часов.
5. Секционирование фрагменты для Иммуноокрашивание
- После периода культивирования, добавить 500 мкл небуферизованных исправления в каждую лунку эмбриона ломтиками и оставить на льду в течение 20 мин. Общая раствор затем осторожно удалить и три PBS промывки осуществляется с 5-минутным интервалом. Ломтиками, затем оставить в растворе сахарозы при 4 ° С, пока раковины ломтиками, около 6 часов, но можно оставить на длительное время (например, на ночь).
- Удалите кусочки и промокните лишнюю раствора сахарозы и уравновешивают примерно в 1 мл октября около 5 мин при 20 ° C. Установите каждый кусочек квартиры в октябре заполненные удаляйте пластиковые формы.После установки, поместите формы вертикально на сухом льду, чтобы затвердеть.
- Установите октября блоков в криостат и равновесие блоков при -24 ° C в течение около 20 мин. Разрезать каждый ломтик с 15 мм разделов установлены на Superfrost-Plus слайдов. Слайды можно хранить при температуре -80 ° C, пока они необходимы.
6. Иммунофлюоресценция
- Пипеткой 1-2 мл PBS на горизонтальной слайды состоялась во влажной камере с горки подняли со дна камеры (мы используем 1 или 2 мл пластиковые пипетки зафиксирован в автоклаве ленты). Инкубируйте секций в PBS в течение 5 мин при 20 ° С для удаления избытка октября Снимите решение PBS из слайда и добавить 500 мл блоке решения по участкам, инкубировать в течение 30 мин при 20 ° C. Снимите блок решения и сразу же добавить 500 мл разведенного первичное антитело добавляют к слайдам, инкубировать при температуре 4 ° С в течение 18-22 часов.
- Удалить первичный раствор антитела и сразу же былч слайды с 1 мл PBS в течение 5 минут, три раза при 20 ° С для удаления избытка первичного решения антител. Добавить 500 мл разведенного вторичным антителом по разделам. Слайды затем оставляют при 20 ° С в течение 30 мин. Побочное решение антитела удаляют и слайд промывали 3 раза по 5 мин в PBS при 20 ° C.
- После этих моет, удалить окончательного PBS стирки, приложите край слайда, чтобы удалить излишки PBS, добавить две капли vectashield на слайдах и осторожно положите стекло покровное по участкам, избегая образования пузырьков. Удалите излишки Vectashield на промокательной от края до слайды изображений.
7. Изображениями
- Изображение иммуноокрашиванию разделов. Мы используем Nikon Eclipse E80i флуоресцентный микроскоп оснащен Hamammatsu ORCA ER цифровой камерой и 10 X, 20х и 40 х объективов.
Representative Results
Использование культурного ломтиками следить за развитием интернейронов и проекционные нейроны сыграла весомую роль в прогрессирующей нашем понимании поколения организации в коре 16. В спинного мозга, двигательных нейронов развития последовало использованием культур эмбрионов данио рерио целом 17. Тем не менее, моторных нейронов спинного организации у рыбок данио является относительно простой (в связи с отсутствием крупных мышц конечностей у рыб). Молекулярные механизмы, которые управляют иерархии спинного организации двигательных нейронов при развитии высших позвоночных в настоящее время мало изучены. Культура условия, способствующие выживанию нейронов и миграцию клеток тела эмбриона срез культур высших позвоночных животных, таким образом, требуется. В настоящее время, спинного мозга срез культур высших позвоночных животных были использованы для семян диссоциированных нейронов в верхней части ломтиками 12-14, расследование флуоресцентно меченые аксоны на периферии среза18, или клеток-предшественников поведения в раннем развитии спинного шнура 19. Нарежьте условия культивирования для последующего спинного мозга, особенно тех, которые поддерживают развитие двигательных нейронов в настоящее время отсутствуют.
Для пытаться следовать нейронов спинного развития, в частности, что спинного моторных нейронов, мы исследовали различные условия культуры, которые могут способствовать двигательных нейронов выживания и приобретение первоначального заказа в двигатель организации, через латеральной миграции нейронов. Начальная стадия испытаний с использованием 18 до этап 20 куриных эмбрионов спинного кусочки шнура оказались бесплодными, мы были не в состоянии держать моторных нейронов живых дольше, чем на несколько часов и не смогли продемонстрировать генерацию значительного числа клеток LMCl по культуре периода (данные не показаны). Поэтому мы исследовали срез культуры стадию 24 эмбрионов, момента времени, когда большинство LMCl и LMCm нейроны были получены, но когда LMCl миграции нейронов все еще находится в яnfancy (рис. 1а-в). Это латеральной миграции LMCl нейронов в значительной степени завершен этап 27, около 24 до 36 час позже (рис. 1, г). Наш анализ может таким образом быть упрощена, чтобы быть в состоянии держать живых нейронов и содействовать их миграции сбоку в вентральной рога. Мы начали наши эксперименты с относительно простыми условиями культивирования, содержащей только сбалансированные Хэнка солевой раствор с сывороткой или без курицы или экстракт куриных эмбрионов. Во всех случаях, хотя мы были в состоянии поддерживать LMC нейронов в срезе, мы нашли мало свидетельств LMCl нейронов поддерживается (по крайней мере выражение LHX-1). Кроме того, мы обнаружили нарушения экспрессии генов, таких как HB9 в спинной спинной мозг, ситуация, которая никогда не происходит в естественных условиях (данные не представлены). Таким образом, эти простые условия культуры не пригодны для исследования приобретению организацией двигательного нейрона.
Таким образом, мы искали более сложное conditioнс, а в качестве базы использовались формулировки, которые были опубликованы чтобы облегчить выживание диссоциированных эмбриональные куриные черепных моторных нейронов. Это условие 20 (1% экстракт куриных эмбрионов, 1% Pen Strep, 0,35% L-глютамин, 0,1% 2-меркаптоэтанол, 2% лошадиной сыворотки, 2% B27 добавки и 50 нг / мл ciliaryneurotrophic фактор роста (CNTF) в Neurobasal среде (здесь называется Guthrie среде) не держать больше моторных нейронов жив, чем более простые средства массовой информации. Кроме того, оно не приводит к ложным экспрессии транскрипционных факторов в спинной спинной мозг. Тем не менее, выживаемость нейронов LMCl был бедным (рис. 1 Г.И., р). Таким образом, мы изменялась, что мы считать ключевыми факторами в среднесрочной Гатри, а именно животного происхождения в сыворотке крови, концентрации в сыворотке крови и концентрации CNTF в среду. Мы обнаружили, что изменение сыворотки лошадиной сыворотки в Chick сыворотки и увеличение концентрации CNTF от 50 нг / мл до 100 нг / мл существенно увеличить тОн выживания LMCl и LMCm клеток, а также позволили их миграции в вентральный рог в течение 24 часов в условиях культивирования (рис. 1 JL, р). Общее количество моторных нейронов, отношение к LMCm LMCl и, по сути, миграция LMCl клеток в брюшную рог появился очень похожий на участках эмбрионов, которые были позволил разработать в яйце, а не в срез культуры (рис 1 KO, р). Таким образом, мы считаем, что на основе фактора транскрипции выражения, номер мобильного и положение моторных нейронов, наши условия срез культуры повторять нормальных двигательных нейронов спинного развития по крайней мере, в течение 24 часов периода.
Рисунок 1. - с. Статус поколения LMC (Foxp1 окрашивание вб) и LMCl (LHX-1 окрашивания в) на этапе 24. С собой слияние двух каналов. Срединной линии показан в виде пунктирной линии и D, V показывает ориентацию дорсовентральных (D, V) оси спинного мозга D -. Ф. . Статус LMC (Foxp1 окрашивание в г) и LMCl (LHX-1 окрашивания в е) организация на этапе 27 F представляет собой слияние двух каналов г -. Я. LHX-1 (г) и Foxp1 (ч) выражение в разделах кусочек культивируют в среде, которая поддерживает черепно двигательных нейронов выживания клеток (Guthrie среды, наши "исходной среде" см. ссылку 20). LHX-1 больше не выражены в моторных нейронов, хотя есть некоторые выживание клеток LMC свидетельствует Foxp1 выражение. D, V в (г) показывает ориентацию дорсовентральных (D, V) оси спинного мозга. ML показывает ориентацию медиолатеральная (M, L) оси сPinal J шнур - л. LMCl клеток (LHX-1 в вентральных рогов J) и LMC в целом (в Foxp1 к) можно наблюдать в ломтики культивировали в среде, содержащей 4% куриных сыворотки и 100 нг / мл CNTF. Обратите внимание, что некоторые LMCl клетки находятся в боковом положении в вентральной рога. Стрелка в (J) показывает боковое положение некоторых из LMCl клеток. (L) является слиянием двух каналов м -. О. Статус выражение LHX-1 (м) и Foxp1 (п) в разделах эмбрион в яйце хранится в течение срез культуры эмбриона показано на J - л. (О) является слиянием двух каналов. Р. Количественная доля LMCl (Foxp1 + VE / Lhx1 + VE) клеток по сравнению с LMC (Foxp1 + VE / Lhx1-ве) клетки, находящиеся в срез культуры в различных условиях сompared контролировать эмбрионы хранятся в ово (которые представляют 100%). Т-тест *** Студенческая представляет р <0,01. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Discussion
Протокол, описанный здесь, позволяет кусочек куриного эмбриона для инкубировали в течение более одного дня, в то время сохранение моторных нейронов живы и продолжают мигрировать в течение периода культивирования. В выяснении условий держать моторные нейроны живы, мы определили несколько ключевых особенностей требуется. Кажется, что до 4% куриных сыворотки имеет решающее значение для выживания моторных нейронов и замена ее с сывороткой разных видов не допускается. Интересно, мы обнаружили, что наличие высокой концентрации сыворотки наносят ущерб ломтиками, поскольку они способствовали разрастание ткани, ведущее к валовым искажений в срезе форму. Более того, присутствие цилиарной нейротрофический фактор также оказалась критической. Остается вероятность, что кусочки могут быть культивировали в течение значительно более длительный период, чем просто 24 часа в сутки, может быть, даже с учетом визуализации сенсорных афферентного входа в спинной мозг. Кроме того, культуратуры условия здесь могут также оказаться полезными для нарезки культура развивается ствола мозга и среднего мозга / мозжечка.
Возможно, самая большая потенциальная выгода в использовании этих условиях срез культуры в том, что они облегчают возможность фармакологической манипуляции функции белка, минимизируя возможность неблагоприятного воздействия на остальную часть зародыша, таких как сердце. Большое количество ингибиторов и агонисты различные сигнальные пути могут быть использованы для оценки миграции различных подтипа нейронов спинного и, возможно, их влияние на формирование местных спинного схемы в процессе разработки. Кроме того, некоторые генетические возмущения экспрессии белка, такие как те, которые делают использование siRNAs и морфолино олигонуклеотиды, страдают от того, что они могут быть введены только на ранних стадиях развития (из-за ограничений в области в яйце процедуры электропорации) и влияние лишь в течение короткий период тиме (обычно один день). Наша часть культуры началось на более поздних этапах и дает возможность использовать эту технологию позднее в развитии на стадии нарезки, чтобы просмотреть их последствий в период культуре срез.
Протокол срез культуры может также позволить визуализации и спинного двигательный нейрон, а также спинной миграции интернейронов в режиме реального времени с помощью покадровой видео микроскопии. Это может быть достигнуто с помощью фазово-контрастной микроскопии при дневном свете или с помощью флуоресцентной микроскопии. Если последний техники должны были быть использованы то введение флуоресцентных меток не требуется. Это может быть достигнуто либо путем введения флуоресцентных красителей, таких как DiI или DIO либо через ретроградной маркировки из конечностей или антероградной маркировки из желудочка или в яйце электропорации конструкций ездить флуоресцентных белков в подмножество нейронов.
Disclosures
Ни один из авторов конкурирующие интересы или конфликт интересов.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Шарон Boast за многочисленные обсуждения проницательный и B. Novitch за добрые дар антител к Foxp1. Эта работа финансируется за счет студенчества из Wellcome Trust, чтобы KCT и проект грант от Wellcome Trust в SRP (грант идентификационный номер 094399/B/10/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Henry Stewart Farms, UK | Fertilised Brown Bovan Gold Hen's eggs (Henry Stewart Farms, UK), stored at 14 °C until incubation | |
| 21 Gauge needle | BD-Microlance-3 | 304432 | |
| 5 ml syringe | BD Plastipak | 302187 | |
| #5 Dumont forceps | Roboz | RS 5045 | |
| Micro Dissecting scissors | Roboz | RS 5910SC | (3.5 in straight) |
| Embryo embedding moulds: Peel away moulds | Agar Scientific | G3764 | Pyramidal shaped 22 mm to 12 mm |
| Super glue | Power Flex, Loctite | ||
| Ethanol | SIGMA | 32221 | |
| Sodium di-hydrogen Phosphate, mono-hydrate | BDH | 102454R | |
| Di Sodium mono-hydrogen Phosphate | VWR/ BDH | 102494C | |
| Sodium Chloride | VWR/BDH | 27810.295 | |
| Low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10500-064 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| Sodium Hydroxide | FLUKA | 71689 | |
| Paraformaldehyde | VWR/BDH | 28794.295 | |
| Plastic disposable pasteur pipettes | ElKay Precision laboratory consumables | 127-P503-000 | Liquipette 3 ml volume |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170 | |
| Sucrose | SIGMA | S0389 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | SIGMA | S5761 | |
| Chicken Embryo Extract | Seralabs | CE650-J | |
| Penicillin/ Streptomycin solution | Gibco | 15070 | |
| L-Glutamine solution | Gibco | 25030 | |
| 2-mercapt–thanol | Gibco | 21985 | |
| Horse serum | Southern Group Labs | 9028B | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Neurobasal medium | Gibco | Cat ~ 2103 | |
| CilliaryNeurotrophic factor (CNTF) | R and D Systems | 557-NT-010 | |
| Chick Serum | SIGMA | C5405 | |
| Primary antibodies | were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank, with the exception of anti-foxP1 antibodies, which were a kind gift from Bennett Novitch of UCLA. Primary antibodies dilutions were Rabbit anti-FoxP1 (1/32000), Mouse anti-Lhx1/2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FoxP1 (1/1000). All antibodies were stored at 4 °C. |
||
| Secondary antibodies | Donkey anti-Guinea Pig (cy3) (1:1000) purchased from Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-Rabbit (Alexa Fluor 594) (1:1000) purchased from Invitrogen All antibodies were stored at 4 °C. |
||
| 24-well plate | Corning COSTAR | 3473 | ultralow attachment 24-well plate |
| O.C.T. | Tissue Tek, Sakura | 4583 | Optimum Cutting Temperature |
| Vectashield | Vector Labs | H1000 | Vectashield fluorescent mounting medium |
| Slides | Thermo Scientific | Superfrost-Plus positively-charged slides, 25 x 75 x 1.0 mm | |
| Cover Glass | VWR International | 631-0167 | 25x60 mm |
| Forced draft incubator: | Lyon Electric Company | kept humid by ensuring water levels always sufficient, maintained at 38 °C | |
| Cryostat | Brite, Huntingdon, UK | -36 °C | |
| Tissue Culture Incubator | DH Autoflow | Nuaire 38 °C, 5% CO2 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT1000-S | |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse E80i fluorescence microscope | |
| Digital Camera | Nikon | Nikon DS5M and Hamammatsu ORCA ER |
References
- Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: Inductive signals and transcriptional codes. Nature Reviews Genetics. 1 (1), 20-29 (2000).
- Landmesser, L. Distribution Of Motoneurons Supplying Chick Hind Limb Muscles. Journal of Physiology-London. 284, 371-389 (1978).
- Romanes, G. J. The motor pools of the spinal cord. Progress in Brain Research. 11, 93-119 (1964).
- Dasen, J. S., De Camilli, A., Wang, B., Tucker, P. W., Jessell, T. M. Hox repertoires for motor neuron diversity and connectivity gated by a single accessory factor, FoxP1. Cell. 134 (2), 304-316 (2008).
- Rousso, D. L., Gaber, Z. B., Wellik, D., Morrisey, E. E., Novitch, B. G. Coordinated actions of the forkhead protein Foxp1 and Hox proteins in the columnar organization of spinal motor neurons. Neuron. 59 (2), 226-240 (2008).
- Tsuchida, T., Ensini, M., et al. Topographic organization of embryonic motor-neurons defined by expression of limhomeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
- Kania, A., Johnson, R. L., Jessell, T. M. Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb. Cell. 102 (2), 161-173 (2000).
- Price, S. R., Garcia, N. V. D., Ranscht, B., Jessell, T. M. Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins. Cell. 109 (2), 205-216 (2002).
- Demireva, E. Y., Shapiro, L. S., Jessell, T. M., Zampieri, N. Motor Neuron Position and Topographic Order Imposed by β- and γ-Catenin Activities. Cell. 147 (3), 641-652 (2011).
- Bello, S. M., Millo, H., Rajebhosale, M., Price, S. R. Catenin-Dependent Cadherin Function Drives Divisional Segregation of Spinal Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (2), 490-505 (2012).
- Haase, G., Dessaud, E., et al. GDNF acts through PEA3 to regulate cell body positioning and muscle innervation of specific motor neuron pools. Neuron. 35 (5), 893-905 (2002).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods in Cell Biology. 51 (51), 109-124 (1996).
- Hotary, K. B., Tosney, K. W. Cellular interactions that guide sensory and motor neurites identified in an embryo slice preparation. Developmental Biology. 176 (1), 22-35 (1996).
- Krull, C. E., Tosney, K. Embryo slices and strips: Guidance and adhesion assays in the avian embryo. Methods in Cell Biology: New Methods in Avian Embryology. Bronner-Fraser, M. 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. San Diego. 97-113 (2008).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. (Reprinted From Journal Of Morphology, Vol. 88, 1951). Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Rakic, P. A century of progress in corticoneurogenesis: From silver impregnation to genetic engineering. Cerebral Cortex. 16, I3-I17 (2006).
- Bingham, S. M., Sittaramane, V., Mapp, O., Patil, S., Prince, V. E., Chandrasekhar, A. Multiple mechanisms mediate motor neuron migration in the zebrafish hindbrain. Dev. Neurobiol. 70 (2), 87-99 (2010).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Developmental Dynamics. 236 (12), 3514-3523 (2007).
- Das, R. M., Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium. J. Vis. Exp. (62), e3920 (2012).
- Barnes, S. H., Price, S. R., Wentzel, C., Guthrie, S. C. Cadherin-7 and cadherin-6B differentially regulate the growth, branching and guidance of cranial motor axons. Development. 137 (5), 805-814 (2010).
