Summary
Slice kulturer underlättar hantering av embryots utveckling genom gen och farmakologiska störningar. Dock måste odlingsbetingelser att normal utveckling kan fortsätta inom reducerad miljö skiva. Vi visar ett protokoll som underlättar normal ryggmärg utvecklingen kan fortsätta i minst 24 timmar.
Abstract
Slice kulturer kan underlätta manipulering av embryots utveckling både farmakologiskt och genom gen manipulationer. I denna reducerade systemet, kan potentiella dödliga biverkningar på grund av systemiska läkemedel ansökningar övervinnas. Dock måste odlingsbetingelser se till att normal utveckling fortsätter inom den reducerade miljön i segmentet. Vi har fokuserat på utvecklingen av ryggmärgen, särskilt för spinala motorneuroner. Vi varierade systematiskt odlingsbetingelser för skivor kycklingembryon från den punkt där de flesta spinal motoriska nervceller hade fötts. Vi analyserade antalet och typen av motoriska nervceller som överlevt under kultur perioden och ställningen för de motoriska nervceller jämfört med in vivo. Vi fann att serum typ och faktorer neurotrofiska krävdes under kultur perioden och kunde hålla motoriska nervceller vid liv i minst 24 timmar och tillåta dem motoriska nervceller att migrera till lämpliga positioner iryggmärgen. Vi presenterar dessa odlingsbetingelser och metoder för att framställa kulturer embryon skiva med urtagna kycklingembryon inbäddade i agaros och skivade med en vibratome.
Introduction
Under normal embryoutveckling, många olika celltyper genererades som måste migrera från sin utgångspunkt där de så småningom kommer att fungera i den mogna organismen. Inom utvecklingsländerna ryggmärgen, är progenitorceller belägna i den ventrikulära zonen vid mittlinjen och generera många subtyper av postmitotiska neuroner och gliaceller som måste migrera till integreras i funktionella neuronala kretsar som krävs för sensorisk bearbetning och utgångar motor 1. Spinal motoriska nervceller som styr sammandragning av armar muskler har studerats utförligt och mycket är känt om de molekyler och mekanismer som driver bildandet av de olika underklasser. Emellertid är mycket mindre känt genom vilka mekanismer motoriska nervceller vandrar, segregera och få synaptiska ingångar.
Motorneuron subtyp identitet förvärvas under utveckling i ett hierarkiskt sätt. Motorneuron subtyper kan grovt klassas into distinkta kolumner, divisioner och pooler som definieras av sina axon prognoser. Motor kolonner projekt axoner till antingen axiella, viscerala eller lem muskler. Motor divisioner dela benet skjuter motoriska nervceller i den laterala motorns kolumn (LMC) i de utskjutande till ventrala eller dorsala muskler 2. Inom divisionerna kallas kluster av motoriska nervceller motor pooler projekt till enskilda muskler i benet 2, 3. Limb-utskjutande motoriska nervceller definieras genom deras expression av transkriptionsfaktom Foxp1 4, 5, medan delning identitet kännetecknas av uttrycket av homeodomänen transkriptionsfaktorer Islet-1 (ventralt utskjutande) eller Lhx-1 (dorsalt utskjutande) 6. Faktum är Lhx-1-uttryck krävs för lämpliga rygg prognoser av motoriska nervceller 7. Var och en av dessa subtyper intar olika positioner inom ryggmärgen, ventrala utskjutande motoriska nervceller kommer att bo medial till dorsalt projecting motorneuroner. Detta resulterar i att LMC är uppdelade i sk LMCmedial (LMCm) och LMClateral (LMCl) divisioner. Divisional och motor pool organisation förvärvas i två faser 8. I den första fasen, är divisionschef segregering uppnås genom en vandring av motoriska nervceller i en karakteristisk medial till lateral mode. De LMCl cellerna genereras efter LMCm cellerna och så LMCl vandrar genom LMCm att uppnå sin slutliga sedimentering läge. Den andra fasen tar motoriska nervceller i en division och kluster dem i motorneuron pooler, förmodligen via en dorsal-ventral sortering av de motoriska nervceller. Medlemmar av catenin-beroende klassiska cadherin familj har visat sig vara avgörande för båda faserna av motorneuron organisation 8-10. Men hur är cadherin funktionen kontrollerar cellrörelse dåligt kända.
Förvärvet av columnar, divisions och pool identiteter kräver yttre signaler som mönster intrinsic. uttryck av transkriptionsfaktorer 11. Dessutom cirka 50% av alla motoriska nervceller dör genom apoptos under normal utveckling i en process som kräver yttre signaler från lem, till stor del genom neurotrofisk stöd motorneuron överlevnad. Således kräver motorneuron utveckling en lämplig miljö skall upprätthållas på en relativt lång tidsförloppet. Av denna anledning de praktiska generera spinal kulturer sladd skiva för att bibehålla motorneuron överlevnad kräver att klarlägga lämpliga odlingsbetingelser. Tidigare embryo slice kulturer har använts för att följa beteendet hos extrinsically lagt renade neuronala populationer 12-14. Dock har våra förutsättningar kunskaper kultur som underlättar in situ motorneuron överlevnad och migration inom segmentet själv inte publicerats. Vi ändrade en standard kultur tillstånd som underlättar överlevnaden av renat till dissocierade kraniella motoriska nervceller underlättar mOTOR neuron utveckling inom ett embryo skiva kultur-system. Vi övervakade också placeringen av de överlevande motoriska nervceller och visar att i stort sett normala positioner för motorneuron divisionerna förvärvas under odlingsperioden.
Protocol
1. Gör Obligatoriska lösningar
- 1 M fosfatbuffert:. Väg upp 109,4 g Na 2 HPO 4 och 32 g NaH 2 PO 4 H 2 0, blanda och löser sig i vatten till total volym av 1 liter.
- Fosfatbuffrad saltlösning (PBS): Bered 0,1 M fosfatbuffert, 0,15 M NaCl. 100 ml PBS bör räcka för bearbetning av skivor från 10 embryon.
- Agaros: Värme PBS-lösning till ca 70 ° C och tillsätt fast låg agaros smälttemperatur sakta under omrörning kontinuerligt. Gör lösningen till en slutlig koncentration av 4% (vikt / vol) agaros. Gör ett lager av 50 ml av denna lösning. Låt denna lösning i ett vattenbad som hölls vid 48 ° C tills de behövdes. Varje agaroslösning oanvänd efter experimentet kan lagras vid 4 ° C under flera veckor.
- Antikropp blockera: Tillsätt fetalt kalvserum och Triton X-100 till en slutlig concentrring av 1% (volym / volym) fetalt kalvserum, 0,1% (volym / volym) Triton X-100 i PBS. 10 ml av block lösning räcker för immunofärgning av 5 glider av kryostatsnitt.
- Fixativ: Bered 0,75 mM NaOH, 4% (vikt / vol) paraformaldehyd (VARNING). För att framställa fixativ värme som krävs mängd vatten till 70 ° C, tillsätt koncentrerad NaOH till önskad slutlig koncentration, tillsätt fast paraformaldehyd och blanda tills det är upplöst. Kyl på is till 4 ° C. 10 ml av denna lösning kommer att räcka för 20 brunnar av embryo skivor.
- Sackaroslösning: Bered 10 ml av en 30% (vikt / volym) sackaros innehållande 0,1 buffert M fosfat. 10 ml av denna lösning kommer att räcka för 10 brunnar av embryo skivor.
- 70% (volym / volym) etanol. Späd 70 ml absolut etanol med 30 ml vatten.
- ODLINGSMEDIUM: Bered en lösning av 1% kycklingembryo extrakt, 1% penicillin / streptomycin, 0,35% L-glutamin, 0,1% 2-mercaptoethanol, 4% kyckling serum, 2% B27 tillägg och 100 ng / ml ciliaryneurotrophic tillväxtfaktor (CNTF) alla utspätt i Neurobasal medium, beredd på is och använde samma dag. 10 ml odlingsmedium krävs för 20 brunnar av embryo skivor.
2. Kycklingembryo Förberedelser
- Plats befruktade hönsägg med den längsta sidan horisontellt i ett forcerat drag inkubator vid 38 ° C tills de utvecklas till steg 15 24. Detta kräver vanligtvis ungefär 4 dagars inkubation.
- På den andra dagen av inkubationen, sterilisera äggskalet genom att torka med ett silkespapper indränkt i 70% etanol. Försiktigt genomborra den platta änden av äggskalet med en 21 gauge nål fäst vid en 5 ml spruta och avlägsna 5 ml albumin. Detta sänker embryot bort från tanken så att embryot inte skadas när skalet öppnas. Återgå äggen till inkubatorn och inkubera dem under ytterligare 2 dagar.
- Använda trubbiga Dumont # 5 pincett carefully genomborra den övre mitten av skalet och ta bort cirka 9 cm 2 av skal. Skär runt embryot och lyft försiktigt ut embryot och placera i HBSS under dissektion. Embryona ska stegvis enligt Hamburger och Hamilton (1992) 15. Alla använda embryon bör vara nära till steg 24. Alla embryon som visar några tecken på abnormitet ska kasseras.
- Ta amnion membran, chorio-allantois membran, huvudet och allantois med två DuMont # 5 pincett. Rensning embryot att ta bort alla inre organ. För att göra detta, klipp upp ventrala mittlinjen på embryo med micro dissekera sax, håll embryot runt rostral stammen regionen med en pincett, ta tag i rostral delen av tarmen och hjärtat och dra kaudalt. Det är viktigt att detta sker snyggt. Du ska kunna se embryot somiter tydligt. Skär embryot i halv, tvärs mellan de övre och nedre extremiteterna buds.Now trimma bröstkorg kroppenväggen med hjälp mikrodissektion sax.
3. Embryo skiva Förberedelser
- Avlägsna agaroslösningen från vattenbadet. Klipp 5 cm från botten av en engångs 3 ml plast pasteurpipett.
- Ta försiktigt bort ländryggen halvan av dissekerade embryot med två tänger till vagga embryot från dissekering lösningen och häll i en torr petriskål. Använda Pasteurpipett, bort omkring 2 ml agaros, pipett cirka 0,5 ml på toppen av embryot och sedan suga upp embryot skiva in i pipetten. Överför embryot och agaros till en skala bort plastform se till att inte införa några bubblor i agarosen. Försiktigt sänka embryot till botten av agaros i plastform med bröstkorg sektionen nedåt. Embryot bör placeras för att vara rakt med en 21 gauge nål. Skivorna kommer också att innehålla en del av den lemmen och det är viktigt att orienteringen av embryot i ägarnose tillåter detta. Placera båten på is för att ställa agarosen. Se till att embryot inte ändrar inriktning under denna period (ca 2 minuter).
- Leica VT1000S vibratome (Speed 3, Frekvens 4, 400 im tjocka skivor) bör inrättas med skivning kammare fylld med HBSS och omgiven av iskallt vatten. Agaros blocket sedan fastnat på vibratome plattform med superlim. Agaros blocket trimmas med ett rakblad för att lämna embryot bit med 1-3 mm agaros omger den. Skivorna som innehåller delar lem knopp med en tydlig apikal ektodermal rigde väljs och dessa skivor placeras sedan i HBSS. Generellt finns det bara 1:59 lämpliga skivor per embryo. Ta försiktigt bort agarosen runt vävnadsskivor med två nålar. Det är viktigt att detta görs grundligt och noggrant.
4. Odling Embryo skivor
- Tillsätt 500 ml av kultur-lösning (beskrivs ovan) till kräed antal brunnar i en 24-brunnars ultralåg behandlad fastsättning vävnadsodlingsplatta. Överför skivorna försiktigt från HBSS-lösning i brunnen. I allmänhet försöker vi att ha 2-3 skivor i varje brunn. Placera 24-brunnsplatta i vävnadsodlingsinkubator vid 37 ° C med 5% CO 2 i 24 timmar.
5. Sektionering av skivdelar för Immunfärgning
- Efter odlingsperioden, tillsätt 500 pl obuffrad fix till varje brunn i embryo skivor och lämna på is i 20 min. Den totala lösningen avlägsnas sedan försiktigt och tre PBS-tvättar utförs, med 5-minuters intervall. Skivorna lämnas sedan i sackaroslösning vid 4 ° C tills skivorna diskbänken, cirka 6 timmar, men kan lämnas för längre (t.ex. över natten).
- Ta bort skivor och sandskädda utanför extra sackaroslösning och jämvikt i ca 1 ml oktober för cirka 5 minuter vid 20 ° C. Montera varje skiva lägenhet i ett oktober-fyllda skal bort plastform.Efter montering, placera formarna vertikalt på torris för att stelna.
- Montera oktober blocken i kryostaten och utjämna blocken vid -24 ° C i cirka 20 minuter. Skär varje skiva med 15 mm sektioner monterade på SuperFrost-Plus bilder. Objektglasen kan lagras vid -80 ° C tills de behövs.
6. Immunofluorescens
- Pipettera 1-2 ml PBS på de horisontella objektglasen hölls i en fuktad kammare med bilderna upp från botten av kammaren (vi använder 1 eller 2 pipetter ml plast fixerades med tejp autoklav). Inkubera sektionerna i PBS under 5 min vid 20 ° C för att avlägsna överskott av oktober Avlägsna PBS-lösningen från sliden och tillsätt 500 ml blocklösning under sektionerna, inkubera under 30 min vid 20 ° C. Ta blocket lösningen och omedelbart lägga 500 ml utspädd primär antikropp till bilderna, inkubera vid 4 ° C i 18-22 timmar.
- Avlägsna primär antikropp-lösning och omedelbart blevh objektglasen med 1 ml PBS under 5 minuter, tre gånger vid 20 ° C för att avlägsna överskott av primär antikroppslösning. Tillsätt 500 ml utspädd sekundär antikropp över sektionerna. Objektglasen lämnas sedan vid 20 ° C under 30 minuter. Den sekundära antikroppslösningen avlägsnas sedan och objektglaset tvättades 3 gånger 5 min i PBS vid 20 ° C.
- Efter dessa tvättar du bort den sista PBS tvätten, sandskädda kanten av bilden för att avlägsna överskott PBS, tillsätt två droppar vectashield på bilderna och försiktigt lägga ett täckglas över sektionerna, för att undvika blåsbildning. Ta bort överflödigt Vectashield genom blotting från kanten av bilderna innan avbildning.
7. Imaging
- Image immunofärgade sektionerna. Vi använder en Nikon Eclipse E80i fluorescensmikroskop utrustat med en Hamammatsu ORCA ER digitalkamera och 10 X, 20x och 40 x objektiv.
Representative Results
Användningen av odlade skivor för att följa utvecklingen av interneuron och projektion nervceller har varit inflytelserik i fortskrider vår förståelse av uppkomsten av organisationen inom cortex 16. I ryggmärgen, har motorneuron utveckling följts med odlingar av hela zebrafisk embryon 17. Emellertid är spinal motorneuron organisation i zebrafisk relativt enkel (på grund av avsaknaden av stora extremiteter muskler i fisk). De molekylära mekanismer som driver en hierarki av spinal motorneuron organisation under utvecklingen av högre ryggradsdjur är för närvarande dåligt känd. Odlingsbetingelser som underlättar neuron överlevnad och cellkroppen migration i kulturer embryo skiva av högre ryggradsdjur Därför krävs. För närvarande, har ryggmärgen slice kulturer av högre ryggradsdjur använts för att utsäde dissocierade neuroner ovanpå skivorna 12-14, undersöka fluorescensmärkta axoner i periferin av skivan18, eller stamcellstransplantation beteende i tidig ryggmärgen utveckling 19. Slice odlingsbetingelser för senare ryggmärg, särskilt de som upprätthåller motorneuron utveckling närvarande saknas.
Att försöka följa spinal neuronal utveckling, särskilt för spinala motoriska nervceller, undersökte vi olika odlingsbetingelser som kan främja motorneuron överlevnad och förvärvet av första beställning i motorn organisationen genom sidled migrering av nervceller. Inledande försök med steg 18 till steg 20 kycklingembryo ryggmärgen skivor visade sig fruktlösa, vi kunde inte hålla motoriska nervceller vid liv längre än ett par timmar och kunde inte påvisa generering av ett betydande antal LMCl celler under odling perioden (uppgifter ej visad). Vi undersökte därför slice kulturer för steg 24 embryon, ett tidpunkt när majoriteten av LMCl och LMCm nervceller har genererats, men när LMCl neuron migration är fortfarande i sin infancy (Figur 1a-c). Denna laterala migration av LMCl neuroner är i stort sett klar med steg 27, cirka 24 till 36 timmar senare (figur 1 df). Vår analys kan således förenklas till att kunna hålla nervceller vid liv och för att underlätta deras migrering i sidled in i ventrala hornet. Vi började våra experiment med relativt enkla odlingsbetingelser innehållande bara Hanks balanserade saltlösning med eller utan kycklingserum eller kycklingembryo-extrakt. I alla fall, även om vi kunde hålla LMC neuroner i segmentet, vi hittade lite bevis för LMCl neuroner bibehålls (åtminstone genom uttryck av Lhx-1). Vidare fann vi olämplig expression av gener, såsom HB9 i den dorsala ryggmärgen, en situation som aldrig sker in vivo (data visas ej). Således är dessa enkla odlingsbetingelser är inte lämpliga för utredning av förvärvet av motorneuron organisation.
Vi sökte därför mer komplexa conditions och som bas används en formulering som har publicerats för att underlätta överlevnaden av dissocierade embryonala kyckling kraniala motoriska nervceller. Detta tillstånd 20 (1% kycklingembryo extrakt, 1% Pen Strep, 0,35% L-glutamin, 0,1% 2-merkaptoetanol, 2% hästserum, 2% B27 komplement och 50 ng / ml ciliaryneurotrophic tillväxtfaktor (CNTF) i Neurobasal-medium (här kallad Guthrie medium) höll fler motoriska nervceller levande än de enklare medier. Dessutom gjorde det inte leda till falsk uttryck av transkriptionsfaktorer i den dorsala ryggmärgen. var dock överlevnaden av LMCl neuroner dålig (figur 1 gi, p). Vi varierade alltså vad vi anses vara viktiga faktorer i Guthrie medium, nämligen djuret ursprungsort serum koncentrationen av serum och koncentrationen av CNTF i mediet. Vi fann att förändra serum från häst serum Chick serum och en ökad koncentration av CNTF från 50 ng / ml till 100 ng / ml ökade avsevärt tHan överlevnad LMCl och LMCm celler och får även sin vandring in i den ventrala hornet över 24 timmar av odlingsbetingelser (figur 1 JL, s.). Det totala antalet motoriska neuroner, förhållandet LMCm till LMCl och, faktiskt, föreföll migrationen av LMCl cellerna i ventrala hornet liknar delar av embryon som hade fått utvecklas in ovo snarare än i segment kulturen (figur 1 ko, p). Därför tror vi att utifrån transkriptionsfaktor uttryck, celler antal och placering av motoriska nervceller, vår skiva odlingsbetingelser rekapitulera normala spinal motorneuron utveckling åtminstone under en 24 timmarsperiod.
Figur 1. a - c. Status generation LMC (Foxp1 färgning ib) och LMCl (Lhx-1 färgning i en) i första etappen 24. c är en sammanslagning av de två kanalerna. Mittlinjen visas som en streckad linje i en och D, visar V orienteringen av dorsoventral (D, V) axel av ryggmärgen d. -. F.. . Status för LMC (Foxp1 färgning i d) och LMCl (Lhx-1 färgning i e) organisation i steg 27 f är en sammanslagning av de två kanalerna g. -. I.. Lhx-1 (g) och Foxp1 (h) uttryck i delar av en skiva odlas i ett medium som stöder kraniell motorneuron cellöverlevnad (Guthrie medium vår "första medium" se referens 20). Lhx-1 inte längre uttrycks i motoriska nervceller, även om det finns en viss överlevnad LMC celler framgår av Foxp1 uttryck. D, V i (g) visar orienteringen av dorsoventral (D, V) axel av ryggmärgen. ML visar orienteringen av mediolateral (M, L) axel sPinal sladd j - l. LMCl celler (Lhx-1 i den ventrala horn i j) och LMC i allmänhet (Foxp1 i k) kan observeras i skivor odlade i medium innehållande 4% chick serum och 100 ng / ml CNTF. Observera att vissa LMCl celler påträffas i en lateral position i ventrala hornet. Pilen i (j) visar den laterala positionen för en del av de de LMCl cellerna. (L) är en sammanslagning av de två kanalerna m -. O.. Status av uttryck av Lhx-1 (m) och Foxp1 (n) i sektioner av ett embryo förvaras i ovo under skivan kulturen av embryot som visas i j. - l.. (O) är en sammanslagning av de två kanalerna. Sid. Kvantifiering av andelen LMCl (Foxp1 + ve / Lhx1 + ve) celler kontra LMC (Foxp1 + ve / Lhx1-ve) celler finns i slice kulturer i olika förhållanden compared att kontrollera embryon förvaras i ovo (som utgör 100%). Students t-test *** representerar p <0,01. Klicka här för att se större bild .
Discussion
Protokollet som beskrivs här möjliggör en kycklingembryo skiva som skall inkuberas under mer än en dag och samtidigt hålla motoriska neuroner vid liv och fortsätter att migrera under odlingsperioden. Att belysa förutsättningarna för att hålla motoriska nervceller vid liv, har vi identifierat flera viktiga egenskaper som krävs. Det verkar som upp till 4% kyckling serum är avgörande för överlevnaden av motoriska nervceller och ersätts med serum från en annan art tolereras inte. Intressant nog fann vi att närvaron av högre koncentrationer av serum var till skada för skivorna som de främjade överväxt av vävnad som leder till grova störningar i segmentet formen. Ännu viktigare, visade närvaron av cilliary neurotrofisk faktor också kritisk. Det är fortfarande en distinkt möjlighet att skivorna kan kunna odlas under betydligt längre perioder än 24 timmar, kanske tillåta visualisering av sensorisk afferent insignal till ryggmärgen. Dessutom, cultida förhållanden här kan också vara användbar för att skära kulturer i utvecklingsländerna hjärnstammen och mellanhjärnan / lillhjärnan.
Kanske den största möjliga nyttan i användningen av dessa villkor skiva kultur är att de underlättar möjligheten för farmakologiska manipulation av proteiners funktion och samtidigt minimera risken för negativa effekter på resten av embryot, som hjärtat. Ett stort antal inhibitorer och agonister av olika signalvägar kan användas för att bedöma migration av olika spinal neuron subtyper och, eventuellt, deras effekt på bildningen av lokala spinal kretsar under utveckling. Dessutom kan vissa genetiska störningar av protein uttryck, såsom de som använder sig av siRNA och morfolinogrupper oligonukleotider, lider av det faktum att de bara kan införas tidigt i utvecklingen (på grund av begränsningar i in ovo elektroporation förfaranden) och effekterna bara varar en kort period av time (typiskt en dag). Vår skiva kulturen startas i senare skeden och ger möjlighet att använda denna teknik senare i utveckling på skivning skede för att visa effekterna under kultur skiva.
Segmentet kultur-protokollet kan också ge visualisering av både spinal motor neuron samt rygg interneuron migration i realtid via time-lapse video mikroskopi. Detta kan uppnås med användning av faskontrastmikroskopi under vitt ljus eller genom användning av fluorescens avbildning. Om den senare tekniken skulle användas då införandet av fluorescerande markörer behövs. Detta kan uppnås antingen genom införande av fluorescerande färgämnen såsom Dil eller DiO via antingen retrograd märkning från lemmen eller anterograd märkning från ventrikeln eller in ovo elektroporering av konstruktioner för att driva fluorescerande proteiner i en undergrupp av neuroner.
Disclosures
Ingen av författarna har konkurrerande intressen eller intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi vill tacka Sharon Boast för många insiktsfulla diskussioner och B. Novitch för den typ gåva antikropparna till Foxp1. Detta arbete som finansieras av en STUDENTTILLVARO från Wellcome Trust att KCT och projektbidrag från Wellcome Trust till SRP (Grant referensnummer 094399/B/10/Z).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Henry Stewart Farms, UK | Fertilised Brown Bovan Gold Hen's eggs (Henry Stewart Farms, UK), stored at 14 °C until incubation | |
| 21 Gauge needle | BD-Microlance-3 | 304432 | |
| 5 ml syringe | BD Plastipak | 302187 | |
| #5 Dumont forceps | Roboz | RS 5045 | |
| Micro Dissecting scissors | Roboz | RS 5910SC | (3.5 in straight) |
| Embryo embedding moulds: Peel away moulds | Agar Scientific | G3764 | Pyramidal shaped 22 mm to 12 mm |
| Super glue | Power Flex, Loctite | ||
| Ethanol | SIGMA | 32221 | |
| Sodium di-hydrogen Phosphate, mono-hydrate | BDH | 102454R | |
| Di Sodium mono-hydrogen Phosphate | VWR/ BDH | 102494C | |
| Sodium Chloride | VWR/BDH | 27810.295 | |
| Low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10500-064 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| Sodium Hydroxide | FLUKA | 71689 | |
| Paraformaldehyde | VWR/BDH | 28794.295 | |
| Plastic disposable pasteur pipettes | ElKay Precision laboratory consumables | 127-P503-000 | Liquipette 3 ml volume |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170 | |
| Sucrose | SIGMA | S0389 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | SIGMA | S5761 | |
| Chicken Embryo Extract | Seralabs | CE650-J | |
| Penicillin/ Streptomycin solution | Gibco | 15070 | |
| L-Glutamine solution | Gibco | 25030 | |
| 2-mercapt–thanol | Gibco | 21985 | |
| Horse serum | Southern Group Labs | 9028B | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Neurobasal medium | Gibco | Cat ~ 2103 | |
| CilliaryNeurotrophic factor (CNTF) | R and D Systems | 557-NT-010 | |
| Chick Serum | SIGMA | C5405 | |
| Primary antibodies | were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank, with the exception of anti-foxP1 antibodies, which were a kind gift from Bennett Novitch of UCLA. Primary antibodies dilutions were Rabbit anti-FoxP1 (1/32000), Mouse anti-Lhx1/2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FoxP1 (1/1000). All antibodies were stored at 4 °C. |
||
| Secondary antibodies | Donkey anti-Guinea Pig (cy3) (1:1000) purchased from Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-Rabbit (Alexa Fluor 594) (1:1000) purchased from Invitrogen All antibodies were stored at 4 °C. |
||
| 24-well plate | Corning COSTAR | 3473 | ultralow attachment 24-well plate |
| O.C.T. | Tissue Tek, Sakura | 4583 | Optimum Cutting Temperature |
| Vectashield | Vector Labs | H1000 | Vectashield fluorescent mounting medium |
| Slides | Thermo Scientific | Superfrost-Plus positively-charged slides, 25 x 75 x 1.0 mm | |
| Cover Glass | VWR International | 631-0167 | 25x60 mm |
| Forced draft incubator: | Lyon Electric Company | kept humid by ensuring water levels always sufficient, maintained at 38 °C | |
| Cryostat | Brite, Huntingdon, UK | -36 °C | |
| Tissue Culture Incubator | DH Autoflow | Nuaire 38 °C, 5% CO2 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT1000-S | |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse E80i fluorescence microscope | |
| Digital Camera | Nikon | Nikon DS5M and Hamammatsu ORCA ER |
References
- Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: Inductive signals and transcriptional codes. Nature Reviews Genetics. 1 (1), 20-29 (2000).
- Landmesser, L. Distribution Of Motoneurons Supplying Chick Hind Limb Muscles. Journal of Physiology-London. 284, 371-389 (1978).
- Romanes, G. J. The motor pools of the spinal cord. Progress in Brain Research. 11, 93-119 (1964).
- Dasen, J. S., De Camilli, A., Wang, B., Tucker, P. W., Jessell, T. M. Hox repertoires for motor neuron diversity and connectivity gated by a single accessory factor, FoxP1. Cell. 134 (2), 304-316 (2008).
- Rousso, D. L., Gaber, Z. B., Wellik, D., Morrisey, E. E., Novitch, B. G. Coordinated actions of the forkhead protein Foxp1 and Hox proteins in the columnar organization of spinal motor neurons. Neuron. 59 (2), 226-240 (2008).
- Tsuchida, T., Ensini, M., et al. Topographic organization of embryonic motor-neurons defined by expression of limhomeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
- Kania, A., Johnson, R. L., Jessell, T. M. Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb. Cell. 102 (2), 161-173 (2000).
- Price, S. R., Garcia, N. V. D., Ranscht, B., Jessell, T. M. Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins. Cell. 109 (2), 205-216 (2002).
- Demireva, E. Y., Shapiro, L. S., Jessell, T. M., Zampieri, N. Motor Neuron Position and Topographic Order Imposed by β- and γ-Catenin Activities. Cell. 147 (3), 641-652 (2011).
- Bello, S. M., Millo, H., Rajebhosale, M., Price, S. R. Catenin-Dependent Cadherin Function Drives Divisional Segregation of Spinal Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (2), 490-505 (2012).
- Haase, G., Dessaud, E., et al. GDNF acts through PEA3 to regulate cell body positioning and muscle innervation of specific motor neuron pools. Neuron. 35 (5), 893-905 (2002).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods in Cell Biology. 51 (51), 109-124 (1996).
- Hotary, K. B., Tosney, K. W. Cellular interactions that guide sensory and motor neurites identified in an embryo slice preparation. Developmental Biology. 176 (1), 22-35 (1996).
- Krull, C. E., Tosney, K. Embryo slices and strips: Guidance and adhesion assays in the avian embryo. Methods in Cell Biology: New Methods in Avian Embryology. Bronner-Fraser, M. 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. San Diego. 97-113 (2008).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. (Reprinted From Journal Of Morphology, Vol. 88, 1951). Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Rakic, P. A century of progress in corticoneurogenesis: From silver impregnation to genetic engineering. Cerebral Cortex. 16, I3-I17 (2006).
- Bingham, S. M., Sittaramane, V., Mapp, O., Patil, S., Prince, V. E., Chandrasekhar, A. Multiple mechanisms mediate motor neuron migration in the zebrafish hindbrain. Dev. Neurobiol. 70 (2), 87-99 (2010).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Developmental Dynamics. 236 (12), 3514-3523 (2007).
- Das, R. M., Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium. J. Vis. Exp. (62), e3920 (2012).
- Barnes, S. H., Price, S. R., Wentzel, C., Guthrie, S. C. Cadherin-7 and cadherin-6B differentially regulate the growth, branching and guidance of cranial motor axons. Development. 137 (5), 805-814 (2010).
