Summary
Dilim kültürleri gen ve farmakolojik tedirginliklerin tarafından embriyo gelişiminin manipülasyonu kolaylaştırır. Ancak, kültür koşullarının normal gelişim dilim azalır ortamında devam edebilirsiniz emin olmalısınız. Biz en az 24 saat süreyle devam etmek omurilikteki normalde gelişimi kolaylaştıran bir protokol göstermektedir.
Abstract
Dilim kültürleri hem farmakolojik ve gen manipülasyonu yoluyla embriyo gelişiminin manipülasyon kolaylaştırabilir. Bu düşük sistem olarak, sistemik ilaç uygulamaları nedeniyle potansiyel öldürücü yan etkilerin önüne alınabilir. Ancak, kültür koşulları dilim azaltılmış ortamında normal gelişimini devam sağlamalıdır. Biz özellikle spinal motor nöronların olduğunu, omurilik gelişimi üzerine odaklanmıştır. Biz sistematik en spinal motor nöronlarda doğmuştu hangi noktadan tavuk embriyo dilim kültür koşulları değişmiştir. In vivo kıyasla kültür periyodu ve bu motor nöronların hayatta pozisyon sırasında motor nöron sayısı ve türü ölçüldü. Serum türü ve nörotrofik faktörler kültür döneminde istendi bulundu ve en az 24 saat süreyle motor nöronların canlı tutmak ve bu motor nöronlar uygun pozisyonları göç etmelerine izin başardıkomurilik. Biz bu kültürü koşulları ve agaroz gömülü parçalanmış tavuk embriyoları kullanılarak embriyo dilim kültürü hazırlama metodolojisi sunmak ve vibratome kullanarak dilimlenmiş.
Introduction
Normal embriyo gelişimi sırasında, birçok farklı hücre tipleri geldikleri noktadan onlar sonunda olgun organizmada işleyecektir nereye göç gereken oluşturulur. Gelişmekte olan spinal kord içinde, öncü hücreler orta hatta ventriküler bölgesinde bulunan ve duyusal işleme ve motor çıkışları 1 için gerekli işlevsel nöral devrelerin entegre geçirmek gerekir postmitotik nöronlar ve glial hücrelerin birçok alt tipi oluşturmak vardır. Ekstremite kaslarının kasılması kontrol Spinal motor nöronlar kapsamlı araştırmalar yapılmış ve çok onların farklı alt oluşumunu tahrik molekülleri ve mekanizmaları bilinmektedir. Ancak, daha az motor nöronlar, göç ayırma ve sinaptik girişleri almak hangi mekanizmaların bilinmektedir.
Motor nöron alt kimlik hiyerarşik bir biçimde gelişimi sırasında elde edilir. Motor nöron alt kabaca i kabul edilebilirnto farklı sütunlar, onların akson projeksiyonları tarafından tanımlanır bölünmeler ve havuzlar. Eksenel, visseral veya ekstremite kasları birine Motor sütunları projesi aksonlar. Motor bölünmeler ventral veya dorsal kaslara 2 projelendirme bu içine yanal motorlu sütun (LMC) ve motor nöronları projelendirme uzuv ayırabiliriz. Bölünmeler içinde, motor nöron kümeleri ekstremite 2, 3 bireysel kasları için motor havuzu projesi adlandırılır. Bölünmüş kimlik Homeodomain transkripsiyon faktörleri Islet-1 (ventral öngörülmesi) ya da LHX-1 (dorsal olarak çıkıntı) 6 ifade ile karakterizedir Bacak verme motor nöronları, transkripsiyon faktörü Foxp1 4, 5 onların ifade ile tanımlanır. Gerçekten de, LHX-1 ekspresyonu, motor nöronlarının 7 uygun dorsal projeksiyonlar için gereklidir. Bu ayrımlardan Her omurilik içinde farklı mevkilere; ventral çıkıntılı motor nöronlar dorsal projecti medial ikamet gelmekng motor nöronlar. LMC Bu sonuçlar sözde LMCmedial (LMCm) ve LMClateral (LMCl) bölüme ayrılmış olan. Tümen ve motor havuzu organizasyonu iki aşamada 8 kazanılır. İlk aşamada, tümen segregasyon yanal moda medial karakteristik motor nöronların bir göç yoluyla elde edilir. LMCl hücreler LMCl nihai oturması konumu elde etmek için LMCm boyunca göç böylece LMCm hücreleri ve sonra üretilir. İkinci aşamada motor nöronların bir dorsal-ventral sıralama yoluyla, muhtemelen motor nöron havuzlarında bir bölünme ve kümeler içlerindeki motor nöronları alır. Katenin bağımlı klasik kaderin ailesinin üyeleri motor nöron organizasyonu 8-10 her iki aşamasında çok önemli olduğu gösterilmiştir. Ancak, kaderin işlevi hücre hareketi nasıl kontrol tam anlaşılamamıştır.
Kolumnar, tümen ve havuz kimliklerin edinimi ekstrinsik sinyalleri gerektirir desen intrinsitranskripsiyon faktörleri 11 c ifadesi. Ayrıca, tüm motor nöronların yaklaşık% 50 oranda motor nöron sağkalımı nörotrofik desteği sayesinde, daldan ekstrinsik sinyallerin gerektiren bir süreçtir, normal gelişim sırasında apoptozis ile ölürler. Böylece, motor nöron gelişme nispeten uzun bir timecourse üzerinde muhafaza edilmesi için uygun ortam gerektirir. Bu nedenle, motor nöron hayatta kalma korumak için omurilik kesit kültürlerinde üretme pratik uygun kültür koşulları açıklama gerektirmez. Önceki embriyo kesit kültürlerinde nöronal popülasyonları 12-14 dışsal ilave saflaştırılmış davranış takip için kullanılmıştır. Ancak, dilim kendi içinde in situ motor nöron sağkalım ve göç kolaylaştırmak bizim bilgi kültür koşullarına yayınlanmış değil. Biz saflaştırılmış sağkalım kolaylaştıran bir standart kültür koşulu değiştirilmiş, disosiye kranial motor nöronlar m kolaylaştırmak içinbir embriyo dilim kültürü sistemi içinde otor nöron gelişimi. Biz de kalan motor nöron konumlandırma izlenmekte ve motor nöron bölünmeler çoğunlukla normal pozisyonları kültür dönemi süresince edinilen olduğunu göstermektedir.
Protocol
1. Gerekli Çözümleri Yap
- 1 M Fosfat tamponu:. 109.4 g Na 2 HPO 4 ve 32 g NaH 2 PO 4 tartılır H 2 0, karıştırın ve 1 litre toplam hacmi için suda çözülür.
- Fosfat Salin (PBS) Tamponlanmış: 0.1 M Fosfat tamponu, 0.15 M NaCl hazırlayın. PBS 100 ml 10 embriyolardan dilim işlenmesi için yeterli olmalıdır.
- Agaroz: etrafında 70 Isı PBS çözeltisi ° C ve katı düşük ergime sıcaklığına agaroz ekleyin yavaş sürekli karıştırarak ilave ediniz. % 4 arasında bir nihai konsantrasyona (w / v) agaroz için çözelti edin. Bu çözelti 50 ml bir stok edin. Gerekli ° C kadar 48 tutulur bir su banyosunda bu çözümü bırakın. Deneyden sonra kullanılmayan herhangi agaroz çözüm birkaç hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
- Antikor blok çözeltisi: Bir nihai concentr fetal buzağı serumu ve Triton X-100 ekleme% 1 tirme (v / v) fetal buzağı serumu,% 0.1 (v / v) Triton PBS içerisinde X-100. Blok çözelti 10 ml kriyostat bölümlere 5 slaytların immun için yeterli olacaktır.
- Sabitleme: 0.75 mm NaOH,% 4 (w / v) paraformaldehid (DİKKAT) hazırlayın. 70 ile su arasında sabitleştirici ısı gerekli miktar hazırlamak için ° C, istenilen nihai konsantrasyon için konsantre NaOH eklemek katı çözülene kadar paraformaldehid ve karıştırılır. 4 ° C'ye kadar buz üzerinde serin Bu çözeltiye 10 ml embriyo dilimlerin 20 kuyu için yeterli olacaktır.
- Sakaroz Çözüm: 0.1 M fosfat tampon maddesi ihtiva eden bir% 30 (w / v) sakaroz çözeltisi 10 ml hazırlayın. Bu çözeltiye 10 ml embriyo dilimlerin 10 kuyu için yeterli olacaktır.
- % 70 (v / v) etanol. 30 ml su ile birlikte mutlak etanol, 70 ml seyreltin.
- Kültür Ortamı:% 1 tavuk embriyo ekstresi,% 1 penisilin / streptomisin,% 0.35 L-glutamin,% 0.1 2-mercaptoeth eden bir çözelti hazırlayınanol,% 4 tavuk serumu,% 2 B27 eki ve 100 ng / ml ciliaryneurotrophic büyüme faktörü (CNTF) neurobasal ortam içinde seyreltilmiş tüm; buz üzerinde hazırlanmış ve aynı gün kullanılabilir. Kültür aracı maddesi 10 ml embriyo dilimlerin 20 kuyu için gereklidir.
2. Civciv Embriyo Hazırlık
- Sıra onlar 15 24 sahnelemeye geliştirmek ° C kadar 38 bir cebri kuvöz yatay uzun tarafı ile tavuklar yumurta döllenmiş. Bu, genellikle inkübasyon yaklaşık 4 gün gerektirir.
- Inkübasyonun ikinci gününde,% 70 etanole batırılmış bir kağıt mendil ile silerek yumurta kabuğu sterilize. Dikkatlice delip 5 ml enjektöre bağlanmış ve albümin 5 ml kaldırmak için 21 gauge iğne kullanılarak yumurta kabuğu düz ucunu. Kabuk açıldığında embriyonun zarar görmemesi Bu uzak kabuk embriyo düşürür. Kuluçka için yumurta dönün ve bir daha 2 gün boyunca bunları tasarlamak.
- Küntleşmiş dumont # 5 forseps c Kullanmaarefully delmek kabuğun üst orta ve kabuk 9 cm yaklaşık 2 çıkarın. Embriyo etrafında kesin ve dikkatli disseksiyon sırasında HBSS içinde embriyo ve yerde çıkarın. Embriyolar Hamburger ve Hamilton (1992), 15 e uygun aşamalı olmalıdır. Kullanılan tüm embriyolar aşama 24 yakın olmalıdır. Anormallik belirtisi gösteren herhangi bir embriyo atılmalıdır.
- Amniyon membran, Chorio-allantoik membranından, kafa ve iki dumont # 5 forseps kullanarak allantoisi çıkarın. Tüm iç organları kaldırmak için embriyo canı çıksın. Bunu yapmak için, mikro diseksiyon makas ile embriyonun ventral orta hat kesip forseps bir çift ile rostral gövde bölgenin etrafında embriyo tutun, bağırsak ve kalp rostral parçası kapmak ve kaudal çekin. Bu temiz bir şekilde yapılır ki önemlidir. Sen embriyo net Somitlerin görmek gerekir. Enine torasik vücut Döşeme alt ve üst ekstremite buds.Now arasında ikiye embriyo Cutmikrodisseksiyon makas kullanarak duvar.
3. Embriyo Dilim Hazırlama
- Su banyosundan agaroz çözüm çıkarın. Bir tek kullanımlık plastik 3 ml Pasteur pipet sol 5 cm kesilir.
- Hafifçe kuru bir Petri kabındaki diseksiyon çözüm ve yer beşiği embriyo dışarı iki forseps kullanarak disseke embriyonun lomber yarısını kaldırın. Pasteur pipeti kullanarak, embriyonun üstünde, agaroz 2 ml civarında pipet yaklaşık 0.5 ml kaldırmak ve sonra pipet içine embriyo dilim kadar emmek. Uzaklıkta plastik kalıp agaroz herhangi kabarcıkları tanıtmak için özen bir soyma embriyo ve agaroz aktarın. Yavaşça aşağı bakacak göğüs bölümü ile plastik kalıp agaroz altına embriyo indirin. Embriyo düz bir 21 gauge iğne kullanıyor yerleştirilmelidir. Dilimler de gelişmekte olan uzvun içerecektir ve önemli olduğunu agar embriyonun yönünüose bu izin verecektir. Agaroz ayarlamak için buz üzerinde tekne yerleştirin. Embriyo bu dönemde (2 dakika civarında) sırasında yönünü değiştirmek değil dikkat edin.
- Leica VT1000S vibratome (Hız 3, Frekans 4, 400 mikron kalınlığında dilimler) HBSS ile dolu dilimleme odası ile kurmak ve buz gibi soğuk su ile çevrili olmalıdır. Agaroz blok sonra süper yapıştırıcı ile vibratome platforma sıkıştı. Agaroz blok çevresindeki agaroz 1-3 mm embriyo parça bırakmak için bir jilet ile kesilmiş. Açık apikal ektodermal rigde ekstremite tomurcuğu bölümleri yer dilimler seçilir ve bu dilimleri ardından HBSS yerleştirilir. Genel olarak, embriyo başına sadece 1-2 uygun dilim vardır. Yavaşça iki iğne kullanılarak doku dilim etrafında agaroz çıkarın. Bu iyice ve dikkatlice yapılması esastır.
4. Ekimi Embriyo Dilimleri
- Gerektirmeyen için kültür çözeltisi, 500 ml (yukarıda açıklandığı gibi) ekleyin24-iyi ultra düşük eki tedavi doku kültürü plaka kuyu ed sayısı. Kuyuya HBSS çözüm dikkatlice dilimleri aktarın. Genel olarak, biz her iyi iki üç dilim var çalışın. 24 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C 'de doku kültürü kuluçka makinesi içinde 24 oyuklu plaka yerleştirin.
5. Immün için Dilimler Kesit
- Kültür döneminin ardından, embriyo dilim her kuyucuğa tamponsuz düzeltmenin 500 ul ekleyin ve 20 dakika boyunca buz üzerinde bırakın. Toplam çözelti daha sonra dikkatli bir şekilde çıkarılır ve PBS üç yıkamadan 5 dakika aralıklarla ile yerine getirilmektedir. Dilimler daha sonra 6 saat, yaklaşık dilimleri lavabo kadar, 4 ° C de sakaroz çözelti içinde kalır, ancak (örneğin gece boyunca) daha uzun bir süre bırakılabilir.
- 20 ° C'de ilave sakaroz çözeltisini kapalı dilimleri ve dab çıkarın ve yaklaşık 5 dk için yaklaşık 1 ml OCT muvazene Bir uzak soyma OCT-dolu plastik kalıp her dilim düz monte edin.Cihaz monte edildikten sonra, katılaşmaya kuru buz üzerinde dikey kalıpları yerleştirin.
- Kriyostat OCT içine monte blokları ve yaklaşık 20 dakika boyunca -24 ° C'de dengeye blok. Superfrost-Plus slayt üzerine monte 15 mm bölümleri ile her dilim kesin. Ihtiyaç duyulan ° C 'ye kadar Slaytlar -80 saklanabilir.
6. İmmünofloresan
- Odanın alt (biz otoklav bandı ile sabitlenir 1 veya 2 ml plastik pipetler kullanın) kaldırdı slaytlar ile nemlendirilmiş bir odasında düzenlenen yatay slaytlar PBS pipetle 1-2 ml. 20 5 dakika için PBS içinde bölümler inkübe ° C fazla OCT slayttan PBS çözeltisi çıkarın ve bölümleri üzerinden blok çözelti, 500 mL, 20 az 30 dakika inkübe edilir ve çıkarmak için ° C. Blok çözüm çıkarın ve hemen seyreltilmiş primer antikor 500 ml ekleyin ° C 18-22 saat boyunca 4 de inkübe slaytlar ekledi.
- Primer antikor çözüm çıkarın ve hemen oldusaat 20 5 dakika için üç kez 1 ml PBS ile slaytlar ° fazla birincil antikor çözeltisi kaldırmak için C. Bölümler üzerinde seyreltilmiş sekonder antikor, 500 ml ilave edilir. Slaytlar daha sonra 30 dakika boyunca 20 ° C'de bırakılır. İkincil antikor çözeltisi daha sonra çıkarılır ve sürgülü kapağı 20 ° C'de 3 kere PBS ile 5 dakika yıkanır
- Bu yıkamadan sonra, son PBS yıkama, dab aşırı PBS kaldırmak için slayt kenar kaldırmak, slaytlar vectashield iki damla ekleyin ve hafifçe kabarcık oluşumunu engeller, bölümler üzerinde bir cam lamel yatıyordu. Görüntüleme öncesi slayt kenarından blotting tarafından aşırı Vectashield çıkarın.
7. Görüntüleme
- Görüntü immunohistokimyasal bölümleri. Biz Hamammatsu ORCA ER dijital kamera ve 10 X 20X ve 40 X objektif lens ile donatılmış Nikon Eclipse E80i floresan mikroskop kullanın.
Representative Results
Interneuron ve projeksiyon nöronları gelişimini takip etmek kültürlü dilimlerin kullanımını korteks 16 içindeki örgütlenmenin nesil anlayışımızı ilerlemesinde etkili olmuştur. Spinal kord, motor nöron gelişiminde bütün zebrafish embriyo kültürleri 17 kullanılarak takip edilmiştir. Ancak, zebrafish spinal motor nöron organizasyonu (balık büyük ekstremite kas eksikliği nedeniyle) nispeten basittir. Yüksek omurgalıların gelişimi sırasında spinal motor nöron örgüt hiyerarşisine sürücü moleküler mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Yüksek omurgalılarda embriyo dilim kültürlerde nöron hayatta kalması ve hücre gövdesi göç kolaylaştırmak Kültür koşulları dolayısıyla gereklidir. Şu anda, yüksek omurgalılar omurilik dilim kültürleri dilimleri 12-14 üstüne tohum disosiye nöronlar için kullanılmış, dilim periferinde floresan etiketli aksonlar araştırmak18, veya erken spinal kord geliştirme 19 progenitör hücre davranış. Özellikle daha sonra omurilik, motor nöron gelişimi eksik korumak olanlar için kültür koşullarını dilimleyin.
Spinal motor nöron, biz motor nöron sağkalım ve nöronların yanal göç yoluyla motorun organizasyonda ilk siparişin edinimi teşvik olabilir çeşitli kültür koşulları araştırılmıştır özellikle o, spinal nöronal gelişimi takip teşebbüs etmek. 20 civciv embriyo omurilik dilimleri aşamadan 18 kullanılarak gerçekleştirilen ilk çalışmalar sonuçsuz kaldı, biz birkaç saat daha uzun motor nöronların hayatta tutmak mümkün değildi ve kültür periyodu (veriler üzerinde LMCl hücrelerinin önemli sayıda üretimi göstermek koyamadık ) gösterilmemiştir. Bu nedenle sahne dilim kültürleri 24 embriyolar, LMCl ve LMCm nöronların çoğunluğu elde edilmiş bir timepoint araştırıldı, ancak LMCl nöron göçü kendi i hala olduğundanfancy (Şekil 1a-c). LMCl nöronların Bu yanal göçü sonra 24 ila 36 saat (Şekil 1 df) etrafında, sahne 27 tarafından büyük ölçüde tamamlandı. Bizim test böylece nöronlar canlı tutmak ve ventral boynuz yanal göç kolaylaştırmak için güçlü olmak için basitleştirilmiş olabilir. Biz veya tavuk serumu veya tavuk embriyo özü olmadan sadece Hank'in dengeli tuz çözeltisi içeren nispeten basit kültür koşulları ile deneyler başladı. Bu dilim içinde LMC nöronlar korumak mümkün olsa da, tüm durumlarda, bu LMCl nöronların muhafaza edilme az sayıda kanıt bulundu (en az LHX-1 ifadesi ile). Ayrıca, bu tür dorsal spinal kord HB9 gibi genlerin uygunsuz ekspresyonu in vivo (veriler gösterilmemiştir) meydana asla bir durum bulundu. Böylece, bu basit kültür koşullarında motor nöron örgütün edinimi soruşturma için uygun değildir.
Biz böylece daha karmaşık conditio dışarı aradıns ve bir baz disosiye embriyonik tavuk kranial motor nöronların hayatta kolaylaştırmak için yayınlanmış olan bir formül kullanılır gibi. Bu durum, 20 (neurobasal ortam içinde% 1 piliç embriyo ekstresi,% 1 Pen Strep,% 0.35 L-glutamin,% 0.1 2-merkaptoetanol,% 2 at serumu,% 2 B27 eki ve 50 ng / ml ciliaryneurotrophic büyüme faktörü (CNTF) (burada Guthrie orta denir) daha basit ortamından daha canlı daha motor nöronları tutmak yaptı. Ayrıca, dorsal spinal kord transkripsiyon faktörlerinin sahte ifadesi yol açmamıştır. Ancak, LMCl nöron sağkalım (Şekil 1 gi, zayıftı s). Bu nedenle biz Guthrie, orta, serum kaynaklı yani hayvan serum konsantrasyonu ve ortam içinde CNTF konsantrasyonu önemli etkenler olarak düşünülen arasında değişmektedir. bulduk ki at serumu gelen serum değişen Civciv serum ve 50 ng / ml ila 100 CNTF konsantrasyonunda bir artışa ng / ml esasen t artmışo LMCl ve LMCm hücrelerinin hayatta kalma ve aynı zamanda kültür koşulları 24 saat (Şekil 1 jl, s) üzerinde ventral boynuz geçişini izin verilir. Motor nöronlar, LMCl ve LMCm oranı toplam sayısı, gerçekten de ventral boynuz içine LMCl hücre göçü (Şekil in ovo ziyade, kesit kültürü gelişmesine izin edilmiş embriyoların bölümleri oldukça benzerdir 1 ko, p). Böylece, bu transkripsiyon faktörü ekspresyonu, hücre sayısı ve motor nöronların konumuna dayalı, bizim dilim kültür koşullarında en az 24 saat boyunca normal bir spinal motor nöron gelişimini özetlemek inanıyorum.
Şekil 1. a - c. LMC nesil Durumu (in Foxp1 boyamab) ve LMCl (evre 24. a) LHX-1 boyanması. c İki kanal bir birleştirme olduğunu. Orta hatta bir ve D bir noktalı çizgi olarak gösterilir, V omurilik dorsoventral (D, V) ekseninin yönünü gösterir d -. F. . LMC (d Foxp1 boyanma) ve LMCl (e LHX-1 boyanması) aşamasında 27 de organizasyon Durum f iki kanal bir birleştirme olduğunu g -. I. LHX-1 (g) ve Foxp1 (h) (Guthrie, orta, bizim "başlangıçta orta" referans 20) kranial motor nöron hücre sağkalım destekleyen bir ortamda kültüre bir dilim bölümlerde ifade. Foxp1 ifade ile kanıtlandığı LMC bazı hücrelerin hayatta kalma olmasına rağmen LHX-1 artık, motor nöronlar olarak ifade edilir. (G) içinde D, V, omuriliğin dorsoventral (D, V) ekseninin yönünü göstermektedir. ML s mediyolateral (M, L) ekseni yönü göstermektedirPinal kablosu j - l. LMCl hücreleri (j ventral boynuz içinde LHX-1) ve genel olarak LMC (k Foxp1)% 4 civciv serum ve 100 ng / ml CNTF içeren medyumda kültüre dilimler halinde görülmektedir. Bazı LMCl hücreleri ventral boynuz bir lateral pozisyonda bulunan unutmayın. De ok (j) LMCl Bazı hücrelerin yanal konumu gösterir. (L) iki kanal bir birleştirme olduğu m -. O. L - LHX-1 (m) ve j gösterilen embriyonun dilim kültürü sırasında ovo tutulur bir embriyo bölümlerinde Foxp1 (n) ifadesi durumu. (O) iki kanal bir birleştirme olduğunu. S. LMCl yüzdesi (Foxp1 + ve / Lhx1 + ve) LMC karşı hücreleri (Foxp1 + ve / Lhx1-ve) farklı koşullar altında kesit kültürlerinde bulunan hücrelerin kantitasyonu covo (ki% 100 temsil) tutulur embriyoların kontrol etmek ompared. Student t-testi *** p <0.01 temsil eder. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Discussion
Burada açıklanan protokol, bir tavuk embriyo dilim motor nöronların canlı kalmasını sağlar ve kültür dönemi sırasında göç etmeye devam ederken, birden fazla gün için inkübe edilmesini sağlar. Motor nöronlar canlı tutmak için şartları aydınlatılmasına, biz gerekli bazı temel özellikleri belirledik. O kadar 4% civciv serum motor nöronlar ve farklı türlerden serum ile onun yerine hayatta kalması için kritiktir tolere değil gibi görünüyor. İlginçtir, biz serum yüksek konsantrasyonlarda varlığı, dilim şeklinde brüt bozulmalara yol açan doku büyümesi olarak terfi dilimleri için zararlı olduğunu bulmuşlardır. Daha da önemlisi, cilliary nörotrofik faktörün varlığı da önemli rol oynadı. Bu dilimler hatta omuriliğe duyusal afferent girdi görselleştirme sağlayan, sadece 24 saat çok daha uzun süre kültüre edilmesi mümkün olabilir o ayrı bir olasılık kalıyor. Buna ek olarak, kültürBurada Ture koşulları da gelişmekte olan beyin sapı ve orta beyin / beyincik kültürleri dilim yararlı olabilir.
Belki de bu dilim kültür koşullarında kullanımında büyük potansiyel yararı da kalbi olarak embriyo geri kalanı üzerinde olumsuz etkiler, potansiyeli en aza indirgerken, protein fonksiyonu farmakolojik manipülasyon imkanı kolaylaştırmak olduğunu. Farklı sinyal yolunun inhibitörleri ve agonistleri çok sayıda farklı spinal nöronların alt göçü, ayrıca, gelişme sırasında lokal spinal devre oluşumu etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. Ayrıca, bu tür siRNA'lar ve morfolino oligonükleotid kullanımı yaptığınız gibi protein ekspresyonu bazı genetik tedirginlikler, sadece erken gelişme olarak tanıtılan (ovo elektroporasyon işlemlerinde kısıtlamalar nedeniyle) ve için etkileri sadece son gerçeği muzdarip tim kısa bir süree (genellikle bir gün). Bizim dilim kültürü ileriki aşamalarında başladı ve dilim kültür döneminde etkilerini görmek için dilimleme aşamada sonraki gelişimi bu teknolojiyi kullanma imkanı tanıyor.
Kesit kültürü protokolü de hem spinal motor nöron yanı sıra zaman atlamalı video mikroskobu aracılığıyla gerçek zamanlı olarak dorsal interneuron göç görselleştirme izin verebilir. Bu beyaz ışık altında ya da floresan görüntüleme kullanımı ile faz kontrast mikroskobu kullanılarak elde edilebilir. İkinci teknik sonra kullanılacak olursa floresan etiketler getirilmesi gereklidir. Bu ventrikülden veya nöronların bir alt kümesi içinde floresan proteinleri sürücü yapıları ovo elektroporasyon içinde uzuv veya anterograd etiketlemeden retrograd etiketleme ya üzerinden bu tür Dii veya Dio olarak floresan boyalar tanıtılması yoluyla elde edilebilir.
Disclosures
Yazarların hiçbiri ilgi veya çıkar çatışması rakip var.
Acknowledgments
Biz Foxp1 için antikorların tür hediye için birçok anlayışlı tartışmalar ve B. Novitch için Sharon övünme teşekkür etmek istiyorum. KCT için Wellcome Trust bir öğrencilik ve Wellcome Trust SRP (Hibe referans numarası 094399/B/10/Z) bir proje hibe tarafından finanse edilen bu çalışma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Henry Stewart Farms, UK | Fertilised Brown Bovan Gold Hen's eggs (Henry Stewart Farms, UK), stored at 14 °C until incubation | |
| 21 Gauge needle | BD-Microlance-3 | 304432 | |
| 5 ml syringe | BD Plastipak | 302187 | |
| #5 Dumont forceps | Roboz | RS 5045 | |
| Micro Dissecting scissors | Roboz | RS 5910SC | (3.5 in straight) |
| Embryo embedding moulds: Peel away moulds | Agar Scientific | G3764 | Pyramidal shaped 22 mm to 12 mm |
| Super glue | Power Flex, Loctite | ||
| Ethanol | SIGMA | 32221 | |
| Sodium di-hydrogen Phosphate, mono-hydrate | BDH | 102454R | |
| Di Sodium mono-hydrogen Phosphate | VWR/ BDH | 102494C | |
| Sodium Chloride | VWR/BDH | 27810.295 | |
| Low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 10500-064 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| Sodium Hydroxide | FLUKA | 71689 | |
| Paraformaldehyde | VWR/BDH | 28794.295 | |
| Plastic disposable pasteur pipettes | ElKay Precision laboratory consumables | 127-P503-000 | Liquipette 3 ml volume |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170 | |
| Sucrose | SIGMA | S0389 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | SIGMA | S5761 | |
| Chicken Embryo Extract | Seralabs | CE650-J | |
| Penicillin/ Streptomycin solution | Gibco | 15070 | |
| L-Glutamine solution | Gibco | 25030 | |
| 2-mercapt–thanol | Gibco | 21985 | |
| Horse serum | Southern Group Labs | 9028B | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Neurobasal medium | Gibco | Cat ~ 2103 | |
| CilliaryNeurotrophic factor (CNTF) | R and D Systems | 557-NT-010 | |
| Chick Serum | SIGMA | C5405 | |
| Primary antibodies | were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank, with the exception of anti-foxP1 antibodies, which were a kind gift from Bennett Novitch of UCLA. Primary antibodies dilutions were Rabbit anti-FoxP1 (1/32000), Mouse anti-Lhx1/2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FoxP1 (1/1000). All antibodies were stored at 4 °C. |
||
| Secondary antibodies | Donkey anti-Guinea Pig (cy3) (1:1000) purchased from Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-Rabbit (Alexa Fluor 594) (1:1000) purchased from Invitrogen All antibodies were stored at 4 °C. |
||
| 24-well plate | Corning COSTAR | 3473 | ultralow attachment 24-well plate |
| O.C.T. | Tissue Tek, Sakura | 4583 | Optimum Cutting Temperature |
| Vectashield | Vector Labs | H1000 | Vectashield fluorescent mounting medium |
| Slides | Thermo Scientific | Superfrost-Plus positively-charged slides, 25 x 75 x 1.0 mm | |
| Cover Glass | VWR International | 631-0167 | 25x60 mm |
| Forced draft incubator: | Lyon Electric Company | kept humid by ensuring water levels always sufficient, maintained at 38 °C | |
| Cryostat | Brite, Huntingdon, UK | -36 °C | |
| Tissue Culture Incubator | DH Autoflow | Nuaire 38 °C, 5% CO2 | |
| Vibratome | Leica | Leica VT1000-S | |
| Microscope | Nikon | Nikon Eclipse E80i fluorescence microscope | |
| Digital Camera | Nikon | Nikon DS5M and Hamammatsu ORCA ER |
References
- Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: Inductive signals and transcriptional codes. Nature Reviews Genetics. 1 (1), 20-29 (2000).
- Landmesser, L. Distribution Of Motoneurons Supplying Chick Hind Limb Muscles. Journal of Physiology-London. 284, 371-389 (1978).
- Romanes, G. J. The motor pools of the spinal cord. Progress in Brain Research. 11, 93-119 (1964).
- Dasen, J. S., De Camilli, A., Wang, B., Tucker, P. W., Jessell, T. M. Hox repertoires for motor neuron diversity and connectivity gated by a single accessory factor, FoxP1. Cell. 134 (2), 304-316 (2008).
- Rousso, D. L., Gaber, Z. B., Wellik, D., Morrisey, E. E., Novitch, B. G. Coordinated actions of the forkhead protein Foxp1 and Hox proteins in the columnar organization of spinal motor neurons. Neuron. 59 (2), 226-240 (2008).
- Tsuchida, T., Ensini, M., et al. Topographic organization of embryonic motor-neurons defined by expression of limhomeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
- Kania, A., Johnson, R. L., Jessell, T. M. Coordinate roles for LIM homeobox genes in directing the dorsoventral trajectory of motor axons in the vertebrate limb. Cell. 102 (2), 161-173 (2000).
- Price, S. R., Garcia, N. V. D., Ranscht, B., Jessell, T. M. Regulation of motor neuron pool sorting by differential expression of type II cadherins. Cell. 109 (2), 205-216 (2002).
- Demireva, E. Y., Shapiro, L. S., Jessell, T. M., Zampieri, N. Motor Neuron Position and Topographic Order Imposed by β- and γ-Catenin Activities. Cell. 147 (3), 641-652 (2011).
- Bello, S. M., Millo, H., Rajebhosale, M., Price, S. R. Catenin-Dependent Cadherin Function Drives Divisional Segregation of Spinal Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (2), 490-505 (2012).
- Haase, G., Dessaud, E., et al. GDNF acts through PEA3 to regulate cell body positioning and muscle innervation of specific motor neuron pools. Neuron. 35 (5), 893-905 (2002).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods in Cell Biology. 51 (51), 109-124 (1996).
- Hotary, K. B., Tosney, K. W. Cellular interactions that guide sensory and motor neurites identified in an embryo slice preparation. Developmental Biology. 176 (1), 22-35 (1996).
- Krull, C. E., Tosney, K. Embryo slices and strips: Guidance and adhesion assays in the avian embryo. Methods in Cell Biology: New Methods in Avian Embryology. Bronner-Fraser, M. 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. San Diego. 97-113 (2008).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. (Reprinted From Journal Of Morphology, Vol. 88, 1951). Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
- Rakic, P. A century of progress in corticoneurogenesis: From silver impregnation to genetic engineering. Cerebral Cortex. 16, I3-I17 (2006).
- Bingham, S. M., Sittaramane, V., Mapp, O., Patil, S., Prince, V. E., Chandrasekhar, A. Multiple mechanisms mediate motor neuron migration in the zebrafish hindbrain. Dev. Neurobiol. 70 (2), 87-99 (2010).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Developmental Dynamics. 236 (12), 3514-3523 (2007).
- Das, R. M., Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium. J. Vis. Exp. (62), e3920 (2012).
- Barnes, S. H., Price, S. R., Wentzel, C., Guthrie, S. C. Cadherin-7 and cadherin-6B differentially regulate the growth, branching and guidance of cranial motor axons. Development. 137 (5), 805-814 (2010).
