विनयशील प्रोटोजोआ primed जीवाणु के साथ स्तनधारी सेल संक्रमणों
Summary
इस तकनीक में एक फसल, मानक के अनुसार और बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के intracellular विकास कर रहे हैं कि प्राकृतिक प्रोटोजोआ मेजबान कोशिकाओं में स्तनधारी कोशिकाओं के संक्रमण से पहले पूर्व की खेती की जाती है यों विधि प्रदान करता है. इस विधि भड़काना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मंच लक्ष्य सेल प्रकार के लिए एक मेजबान कोशिकाओं के एक विस्तृत विविधता को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
Abstract
कई intracellular बैक्टीरियल रोगज़नक़ों वातावरण में प्रसार के लिए एक प्राकृतिक जलाशय के रूप में मीठे पानी protozoans उपयोग लीजोनेला pneumophila, 'Legionnaires निमोनिया का प्रेरणा का एजेंट है, पर इन विट्रो सुसंस्कृत बैक्टीरिया है जब पहली बार प्रोटोजोआ कोशिकाओं स्तनधारी मैक्रोफेज की संक्रमण से पहले काटा रोगजनक लाभ लाभ. यह पता चलता है कि महत्वपूर्ण विषैलापन कारकों इन विट्रो में ठीक से व्यक्त नहीं किया जा सकता है. हम भड़काना एल के लिए एक विनयशील प्रणाली विकसित की है pneumophila के माध्यम से अपनी प्राकृतिक प्रोटोजोआ मेजबान Acanthamoeba castellanii स्तनधारी सेल संक्रमण पहले. किसी भी विषैलापन कारक के योगदान प्रोटोजोआ भड़काना के बाद जंगली प्रकार के बैक्टीरिया के लिए एक उत्परिवर्ती तनाव के intracellular वृद्धि की तुलना द्वारा जांच की जा सकती है. GFP व्यक्त जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती एल pneumophila उपभेदों के लिए एक भड़काना कदम में प्रोटोजोआ monolayers को संक्रमित करने के लिए उपयोग किया जाता है और intracellular विकास की देर चरणों तक पहुँचने की अनुमति दी. प्रतिदीप्त बैक्टीरिया तो इन संक्रमित कोशिकाओं से काटा जाता है और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा सामान्यीकृत स्तनधारी मैक्रोफेज में एक बाद के संक्रमण के लिए बैक्टीरिया की तुलना संख्या उत्पन्न. मात्रा का ठहराव के लिए, जीवित बैक्टीरिया के संक्रमण के बाद निगरानी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, प्रवाह cytometry, और कॉलोनी चढ़ाना द्वारा का उपयोग कर रहे हैं. इस तकनीक पर प्रकाश डाला गया है और वातावरण है कि एक प्राकृतिक अधिग्रहण मार्ग में सामना किया जाएगा नकल उतार द्वारा मेजबान सेल निर्भर जीन अभिव्यक्ति के योगदान पर निर्भर करता है. इस दृष्टिकोण के लिए किसी भी जीवाणु है कि एक रोगजनक लाभ पाने के लिए एक साधन के रूप में एक मध्यस्थ की मेजबानी का उपयोग करता है को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
Introduction
कई बैक्टीरियल रोगज़नक़ों सामान्यीकृत रणनीतियों और एक intracellular कम्पार्टमेंट में जीवित रहने की प्रतिकृति के लिए मेजबान कोशिकाओं का फायदा उठाने के लिए अनुकूलित किया है. कई मामलों में, रोगजनक तंत्र प्रोटोजोआ और metazoan कोशिकाओं के बीच इसी तरह के हैं. हालांकि, इन दो microenvironments बहुत अलग हैं और डाह कारकों 1-4 के अंतर अभिव्यक्ति में परिणाम कर सकते हैं. Legionnaires रोग जीवाणु लीजोनेला pneumophila सर्वत्र 5 दुनिया भर में मीठे पानी वातावरण के साथ जुड़ा हुआ है. महत्वपूर्ण बात, एल. pneumophila प्रोटोजोआ कोशिकाओं में खेती की जाती पहले मानव रोगजनक लाभ हासिल monocytes के संक्रमण के लिए सुझाव है कि जीवाणु एक प्रोटोजोआ सेल से बाहर निकलने के वैश्विक जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल में खेती की जाती है इन विट्रो जीव 6-8 की तुलना में अलग हैं. प्रकृति में, मीठे पानी में अमीबा एक हमलावर जीवाणु के तेजी से प्रवर्धन के लिए पोषक तत्व अमीर सीमीत प्रदान करते हैं. एल मानव अधिग्रहण pneumophइला सबसे अक्सर दूषित पानी बूंदों कि जीवाणु होते की साँस लेना के लिए जिम्मेदार ठहराया है. यह संभावना है इन बूंदों बंदरगाह प्रोटोजोआ बैक्टीरिया सेल से जुड़े, जहां प्रोटोजोआ कोशिकाओं अधिक पारंपरिक जल उपचार 9,10 प्रथाओं के लिए प्रतिरोधी रहे हैं. एक लगभग प्रोटोजोआ मेजबान 11-13 कोशिकाओं में जीवाणु के intracellular जीवन चक्र के समान तरीके में फेफड़ों वायुकोशीय मैक्रोफेज आय के संक्रमण.
आदेश में जीवित रहने के लिए और कोशिकाओं में दोहराने, एल pneumophila एक विशेष प्रकार IVB स्राव डॉट / ICM मेजबान सेल 14-16 की cytosol में लगभग 300 'effector' प्रोटीन देने के लिए करार दिया प्रणाली का उपयोग करता है. ये effector प्रोटीन सामूहिक सेलुलर प्रक्रियाओं पलट देना क्रम में 17,18 जीवाणु के लिए एक प्रतिकृति अनुमोदक डिब्बे उत्पन्न कार्य करते हैं. 26 जीन है कि डॉट / ICM intracellular mult के लिए दोषपूर्ण उपभेदों में ट्रांसपोर्टर परिणाम शामिल किसी में विलोपन19-23 iplication. ऐतिहासिक, व्यक्तिगत effector एन्कोडिंग जीन का विलोपन intracellular विकास के लिए तनु उपभेदों में शायद ही कभी हुई. इस घटना को अनावश्यक समारोह और effectors के paralogous प्रतियां सहित कई hypotheses के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है.
कुछ विषैलापन कारकों केवल सेल जुड़े मेजबान intracellular 24 विकास के संदर्भ में व्यक्त कर रहे हैं. हम युक्तिसंगत बनाया है कि अगर एक विशेष effector केवल प्रोटोजोआ संक्रमण के संदर्भ में व्यक्त की गई थी, तो effector के योगदान जब सुसंस्कृत थे दोनों इन विट्रो में एक तनाव जंगली प्रकार के साथ तुलना नहीं की सकता. एक replicative से एक transmissive चरण एल pneumophila बदलाव के रूप में यह 25 संस्कृति में स्थिर चरण में प्रवेश करती है. चरण स्विचन phenotype पोषक तत्व रिक्तीकरण intracellular विकास के दौरान सामना करना पड़ा है और 26 गतिशीलता के लिए flagella के विधानसभा के माध्यम से उदाहरण का प्रतिनिधित्व करता है. क्योंकि एल pneumophila अधिक INVA हैनिर्णायक और विषमय जब प्रोटोजोआ कोशिकाओं से काटा, हम एक परख है कि अधिक ईमानदारी रोगजनक जीवाणु के राज्य का प्रतिनिधित्व किया है, जब यह मेजबान मैक्रोफेज का सामना करना पड़ा विकसित करने की मांग की.
यह अंत करने के लिए, हम एक बहुमुखी प्रोटोजोआ भड़काना परख कि दोनों (भड़काना सेल) 1 और 2 (लक्ष्य सेल) चरण संक्रमण के लिए कोई उपयुक्त मेजबान को समायोजित कर सकते हैं विकसित किया है. संक्रमण की प्रक्रिया stably हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त बैक्टीरिया के प्रयोग के माध्यम से विनयशील है. प्रोटोजोआ Acanthamoeba castellanii के लिए संक्रमण मॉडल एक 27 क्षेत्र में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया पद्धति का अनुसरण करता है. एल, भड़काना कदम के लिए pneumophila उपभेदों में इन विट्रो तरल मीडिया में स्थिर चरण की खेती लेबल 'transmissive' बैक्टीरिया (चित्रा 1 ए) का उत्पादन कर रहे हैं. जीवाणु अगले ए के monolayers को संक्रमित करने के लिए उपयोग किया जाता है castellanii intracellular जीवन चक्र के 18 घंटे के लिए एक देर मंच को प्राप्त करने के लिए. बड़े vacuoles होते हैंआईएनजी बैक्टीरिया इस समय प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1 ए) का उपयोग बिंदु पर देखे जा सकते हैं. प्रोटोजोआ कोशिकाओं तो और lysed lysate से बरामद बैक्टीरिया 512 एनएम का उपयोग कर एक प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर में उत्सर्जन के लिए मापा जाता है. प्रतिदीप्ति बहुलता लक्ष्य कोशिकाओं के संक्रमण (1 चित्र, * सहसंबंध वक्र) संक्रमण (MOI) की गणना करने के लिए ऑप्टिकल घनत्व के साथ सहसंबद्ध है. आक्रमण (0 टी) और 18 घंटे के बाद आक्रमण (18 टी) के बाद, लक्ष्य कोशिकाओं प्रतिदीप्ति के लिए मात्रा निर्धारित कर रहे हैं, intracellular बैक्टीरिया का प्रतिनिधित्व. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और प्रवाह cytometry द्वारा नजर रखी जा सकता है, और व्यवहार्य मायने कॉलोनी चढ़ाना के माध्यम से मापा जा सकता है. भड़काना परख हमेशा जंगली प्रकार एल के साथ संक्रमण के साथ है pneumophila और एक / डॉट ICM प्रकार चतुर्थ स्राव (Δ DotA) प्रणाली (चित्रा 1 ए) में दोषपूर्ण तनाव. यह महत्वपूर्ण बात यह है कि जंगली प्रकार के बीच प्रत्यक्ष तुलना के लिए आंतरिक नियंत्रण प्रदान करता हैएन डी किसी भी isogenic उत्परिवर्ती उपभेदों संक्रमण की प्रक्रिया में इस्तेमाल. असंक्रामक Δ DotA भड़काना चरण के दौरान तनाव का समावेश तनु है कि इन विट्रो में संवर्धित कर रहे हैं isogenic उत्परिवर्ती उपभेदों के साथ जुड़े विकास phenotypes की निगरानी के लिए एक सीमा सेट.
Protocol
Representative Results
Discussion
बैक्टीरियल जीन की अभिव्यक्ति कसकर जीवन चक्र प्रगति और आसपास के microenvironment में संकेतों की प्रतिक्रिया का एक संयोजन के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है. एल के रूप में इस तरह के Vacuolar रोगज़नक़ों pneumophila मेजब…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्रोटोजोआ सेल संक्रमण के लिए एक खाका उपलब्ध कराने के लिए डॉ. क्रेग रॉय और डॉ. Dario Zamboni धन्यवाद. पांडुलिपि के महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए डॉ. Lulu Cambronne, हम डा. जगदीप Obhrai, डॉ. Georgiana Purdy, डा. फ्रेड Heffron और उपकरणों और अभिकर्मकों के लिए टोड Wisner धन्यवाद. प्रवाह cytometry OHSU फ्लो साझा संसाधन सुविधा पर प्रदर्शन किया था. इस काम के हिस्से में ओरेगन और एक NIH अनुदान R21 AI088275 (EDC) के मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Reagent | |||
| chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | antibiotic |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| ACES | Sigma | A9758-1KG | media component |
| ATCC medium: 712 PYG | ATCC | growth media for protozoans | |
| 1X PBS | Fisher Scientific | SH30256FS | phosphate buffered saline |
| activated charcoal | Fisher Scientific | C272-212 | media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | media component |
| peptone | BD Diagnostics | 211677 | media component |
| agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | media component |
| L-cysteine, 99%+ | Acros organics | 173601000 | media supplement |
| Ferric nitrate nonahydrate | Fisher Scientific | I110-100 | media supplement |
| Equipment | |||
| EVOS fl | AMG | EVOS fl | fluorescence microscope |
| Smart Spec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | spectrophotometer |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 22627023 | bench top centrifuge |
| Repeater plus | Eppendorf | 22230201 | repeating pipette |
| SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | microplate reader | |
| Softmax Pro 5.3 | Molecular Devices | 0200-310 | microplate reader software |
| 5424 microfuge | Eppendorf | 22620401 | table top microcentrifuge |
| Fast-release pipette pump II | Scienceware | 379111010 | pipette aid |
| FACS Calibur | BD Bioscience | flow cytometer | |
| FlowJo 7.6.1 | FlowJo | license | flow cytometery software |
| 15 ml tube | BD Falcon | 352096 | polypropylene conical tube |
| 1.6 ml microfuge tube | Neptune | 3745.X | microcentrifuge tubes |
References
- Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues. Science. 259, 686-688 (1993).
- Mahan, M. J., et al. Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 669-673 (1995).
- Rankin, S., Isberg, R. R. Identification of Legionella pneumophila promoters regulated by the macrophage intracellular environment. Infect. Agents Dis. 2, 269-271 (1993).
- Rankin, S., Li, Z., Isberg, R. R. Macrophage-induced genes of Legionella pneumophila: protection from reactive intermediates and solute imbalance during intracellular growth. Infect. Immun. 70, 3637-3648 (2002).
- Fields, B. S. The molecular ecology of legionellae. Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).
- Cirillo, J. D., et al. Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 67, 4427-4434 (1999).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S. Growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii enhances invasion. Infect. Immun. 62, 3254-3261 (1994).
- Faucher, S. P., Mueller, C. A., Shuman, H. A. Legionella pneumophila Transcriptome during Intracellular Multiplication in Human Macrophages. Front Microbiol. 2, 60 (2011).
- Kilvington, S., Price, J. Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure. J. Appl. Bacteriol. 68, 519-525 (1990).
- King, C. H., Shotts, E. B., Wooley, R. E., Porter, K. G. Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination. Appl. Environ. Microbiol. 54, 3023-3033 (1988).
- Horwitz, M. A. Formation of a novel phagosome by the Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 1319-1331 (1983).
- Horwitz, M. A. Phagocytosis of the Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil. Cell. 36, 27-33 (1984).
- Horwitz, M. A., Silverstein, S. C. Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes. J. Clin. Invest. 66, 441-450 (1980).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).
- Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638 .
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Front Microbiol. 2, 136 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Shin, S., Roy, C. R. Host cell processes that influence the intracellular survival of Legionella pneumophila. Cell Microbiol. 10, 1209-1220 (2008).
- Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
- Marra, A., Blander, S. J., Horwitz, M. A., Shuman, H. A. Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9607-9611 (1992).
- Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
- Segal, G., Shuman, H. A. Characterization of a new region required for macrophage killing by Legionella pneumophila. Infect Immun. 65, 5057-5066 (1997).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Haghjoo, E., Galan, J. E. Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi. Mol. Microbiol. 64, 1549-1561 (2007).
- Molofsky, A. B., Swanson, M. S. Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle. Mol. Microbiol. 53, 29-40 (2004).
- Hammer, B. K., Tateda, E. S., Swanson, M. S. A two-component regulator induces the transmission phenotype of stationary-phase Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 44, 107-118 (2002).
- Ninio, S., Zuckman-Cholon, D. M., Cambronne, E. D., Roy, C. R. The Legionella IcmS-IcmW protein complex is important for Dot/Icm-mediated protein translocation. Mol. Microbiol. 55, 912-926 (2005).
- Neild, A. L., Roy, C. R. Legionella reveal dendritic cell functions that facilitate selection of antigens for MHC class II presentation. Immunity. 18, 813-823 (2003).
- Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
- Huws, S. A., Smith, A. W., Enright, M. C., Wood, P. J., Brown, M. R. Amoebae promote persistence of epidemic strains of MRSA. Environ. Microbiol. 8, 1130-1133 (2006).
