Summary
Cette technique fournit une méthode pour récolter, normaliser et quantifier la croissance intracellulaire des bactéries pathogènes qui sont pré-cultivées dans les cellules hôtes naturels protozoaires avant infections de cellules de mammifères. Cette méthode peut être modifiée pour accueillir une grande variété de cellules hôtes pour la phase d'amorçage, ainsi que les types de cellules cibles.
Abstract
De nombreux agents pathogènes bactériens intracellulaires utiliser des protozoaires d'eau douce comme un réservoir naturel de la prolifération dans l'environnement. Legionella pneumophila, l'agent causal de la légionellose pneumonie, gagne un avantage sur les bactéries pathogènes cultivés in vitro lors de la première récolte de cellules de protozoaires avant l'infection des macrophages de mammifères. Ceci suggère que les facteurs de virulence importants peuvent ne pas être correctement exprimée in vitro. Nous avons développé un système souple pour l'amorçage L. pneumophila par son naturel protozoaire hôte Acanthamoeba castellanii avant l'infection de cellules de mammifères. La contribution d'un facteur de virulence peuvent être examinés en comparant la croissance intracellulaire d'une souche mutante de bactérie de type sauvage après l'amorçage protozoaire. Exprimant la GFP de type sauvage et mutant L. souches pneumophila sont utilisés pour infecter des monocouches de protozoaires dans une étape d'amorçage et a permis de franchir des étapes tardives de la croissance intracellulaire. Bactéries fluorescentes sont ensuite récoltées à partir de ces cellules infectées et normalisée par spectrophotométrie pour générer des nombres comparables de bactéries pour une infection ultérieure par les macrophages des mammifères. Pour la quantification, des bactéries vivantes sont surveillés après l'infection en utilisant la microscopie par fluorescence, cytométrie en flux, et par placage colonie. Cette technique met en évidence et repose sur la contribution de l'expression des gènes de la cellule hôte dépendant en imitant l'environnement qui seraient rencontrées dans un parcours d'acquisition naturelle. Cette approche peut être modifié pour tenir compte de toute bactérie qui utilise un hôte intermédiaire comme un moyen d'obtenir un avantage pathogène.
Introduction
De nombreux agents pathogènes bactériens ont adopté des stratégies généralisées pour exploiter les cellules hôtes pour la survie et la reproduction dans un compartiment intracellulaire. Dans de nombreux cas, les mécanismes pathogéniques sont similaires entre les protozoaires et les métazoaires cellules. Cependant, ces deux micro sont très différents et peuvent aboutir à l'expression différentielle des facteurs de virulence 1-4. La légionellose bactérie Legionella pneumophila est ubiquitaire associés à des environnements d'eau douce dans le monde 5. Surtout, L. pneumophila cultivé dans des cellules de protozoaires avant l'infection des monocytes humains obtenir un avantage pathogène, ce qui indique que les profils d'expression des gènes globales de la bactérie sortant d'une cellule de protozoaire est différente de celle de l'organisme cultivé in vitro en 6-8. Dans la nature, les amibes d'eau douce constituent des nutriments riches limites pour l'amplification rapide d'une bactérie envahissante. Acquisition humaines de L. pneumophila est le plus souvent attribuée à l'inhalation de gouttelettes d'eau contaminées qui contiennent la bactérie. Il est probable que ces gouttelettes port protozoaires associées aux cellules des bactéries; où les cellules de protozoaires sont plus résistants aux pratiques conventionnelles de traitement de l'eau 9,10. L'infection de macrophages alvéolaires pulmonaires produit d'une manière presque identique au cycle de vie intracellulaire de la bactérie dans les cellules hôtes protozoaires 11-13.
Afin de survivre et se reproduire dans les cellules eucaryotes, L. pneumophila utilise un système de sécrétion de type spécialisé IVb appelé Dot / Icm de livrer près de 300 «effecteurs des protéines dans le cytosol de la cellule hôte 14-16. Ces protéines effectrices collectivement fonctionner pour renverser les processus cellulaires afin de générer un compartiment de réplication permissive pour la bactérie 17,18. Suppressions dans l'un des 26 gènes qui composent le résultat transporteur Dot / Icm dans des souches défectueuses pour mult intracellulaireiplication 19-23. Historiquement, la suppression des différents gènes codant pour effectrices rarement abouti à des souches atténuées pour la croissance intracellulaire. Ce phénomène a été attribué à plusieurs hypothèses incluant la fonction de redondance et des copies paralogues des effecteurs.
Certains facteurs de virulence ne sont exprimés dans le contexte de la croissance intracellulaire de la cellule hôte associée 24. Nous avons rationalisé que si un effecteur particulier a été exprimé que dans le contexte de l'infection protozoaire, la contribution de l'effecteur ne pouvait pas être comparée à une souche de type sauvage quand les deux ont été cultivées in vitro. L. pneumophila transitions d'une réplication à une phase de transmission en ce début de phase stationnaire dans la culture 25. Le phénotype commutation de phase représente l'épuisement des nutriments rencontrée lors de la croissance intracellulaire et est illustrée à travers l'ensemble de flagelles pour la mobilité 26. Parce que L. pneumophila est plus invasive et virulent lorsqu'il est récolté à partir des cellules de protozoaires, nous avons cherché à développer un test qui plus fidèlement représenté l'état pathogène de la bactérie quand il a rencontré macrophages de l'hôte.
À cette fin, nous avons développé un test d'amorçage protozoaire polyvalent qui peut accueillir n'importe quel hôte convenable pour les deux premiers (cellule d'amorçage) et deuxième infections scène (cellule cible). Le processus d'infection est traitable par l'utilisation de bactéries exprimant de manière stable la protéine fluorescente verte (GFP). Le modèle d'infection pour le protozoaire castellanii Acanthamoeba suit une méthodologie largement utilisée dans le domaine 27. Pour l'étape d'amorçage, L. pneumophila souches sont cultivées in vitro jusqu'à la phase stationnaire dans des milieux liquides pour produire portant la mention «transmetteurs» bactéries (figure 1A). Les bactéries sont ensuite utilisés pour infecter des monocouches de A. castellanii pendant 18 heures pour atteindre un stade tardif du cycle de vie intracellulaire. Grandes vacuoles contiennenttion des bactéries peuvent être visualisés à ce point dans le temps en utilisant la microscopie à fluorescence (figure 1A). Cellules sont ensuite lysées protozoaires et bactéries récupérées à partir du lysat sont mesurées pour l'émission à 512 nm en utilisant un lecteur de plaque à fluorescence. La fluorescence est corrélée avec la densité optique de calculer la multiplicité de l'infection (MOI) pour l'infection de cellules cibles (figure 1, la courbe de corrélation *). H après l'invasion (T 0) et 18 post-invasion (T 18), les cellules cibles sont quantifiés pour la fluorescence, ce qui représente des bactéries intracellulaires. La fluorescence peut être suivie en microscopie et cytométrie de flux, et les numérations viables peut être mesurée par placage colonie. Le test d'amorçage est toujours accompagnée par des infections de type sauvage avec L. pneumophila et une souche défectueux dans le système Dot / Icm de sécrétion de type IV (Δ DOTA) (figure 1A). Cela permet surtout de contrôle interne pour les comparaisons directes entre un type sauvagend des souches isogéniques mutantes utilisées dans le processus d'infection. L'inclusion de la souche virulente Δ Dota pendant la phase d'amorçage fixe un seuil pour l'observation des phénotypes de croissance atténués associés à isogéniques souches mutantes qui sont cultivées in vitro.
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Protocol
1. Préparation des cultures de Legionella pneumophila pour les infections phase d'amorçage
- Transformer tout L. pneumophila souches utilisées dans l'essai avec le plasmide pAM239, codant pour un isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inductible protéine fluorescente verte (GFP) 28. Strie sur les souches bactériennes de fer et de la cystéine complétée N-(2-acétamido)-2-aminoéthanesulfonique (ACES) tamponné gélose à l'extrait de levure de charbon (CYEA) contenant 6,25 mg / ml de chloramphenicol (CM) (pour le maintien du plasmide) et incuber pendant 72 heures à 37 ° C.
- Transférer un inoculum de la souche bactérienne en bouillon tamponné ACES complétées extrait de levure (AYE) avec 6,25 g / ml CM et 1 mM d'IPTG et cultiver jusqu'à la phase stationnaire (O / N) sur un agitateur orbital à 37 ° C.
- Confirmer l'expression de la GFP dans les cultures in vitro en utilisant la microscopie à fluorescence. Transférer 10 ul de la culture sur une lame de verre sous un couvercleglissement et de l'image en utilisant un objectif 60x avec excitation GFP / cube d'émission (AMG EVOS fl).
- Diluer une aliquote de 100 ul de chaque culture in vitro en utilisant stérile à 1:10 H 2 O. Faites un blanc en utilisant 100 ul AYE médias avec 1 mM d'IPTG et 6,25 g / cm ml et l'eau. Prendre des mesures de DO600 les dilutions à l'aide d'un spectrophotomètre (Bio-Rad intelligente Spec Plus). Calculer le volume nécessaire pour infecter un bien à une MOI = 20 pour chaque culture in vitro: V = [(amibes tête de série) x MOI] / [OD 600 x (facteur de dilution) x (constant)] = [(1 X 10 6 ) x (20)] / [OD 600 x (10) x (1 x 10 6)] = 2/OD 600. Concentration des bactéries est déterminée comme DO600 = 1,0 = 1 x 10 9 UFC / ml.
2. Infection étape d'amorçage utilisant Acanthamoeba castellanii
- Maintenir et cultiver les amibes en milieu ATCC PYG 712 en 175 cm 2 flacons à température ambiante.
- Remplacez le support en cul amibestures 24 hr avant de commencer les cultures bactériennes liquides. Le même jour, liquides cultures bactériennes sont démarrés, recueillir et compter les cellules sur un microscope optique à l'aide d'un hémocytomètre.
- Diluer les amibes par du milieu frais à une concentration finale de 1 x 10 6 cellules / ml. Semences plaques de 12 puits de culture cellulaire avec des aliquotes de 1 ml de la amibes à l'aide d'une pipette à répétition et incuber à température ambiante O / N.
- Après incubation, laver les puits des plaques de 12 puits de culture cellulaire 3x avec 1 ml de PBS stérile à l'aide d'une pipette sérologique de 10 ml et une aide pipette manuelle.
- Après aspiration du PBS, ajouter 1 ml d'infection des médias (ATCC 712 médias PYG moins de glucose, peptone et l'extrait de levure) avec 1 mM d'IPTG et 6,25 pg / ml cm à chaque puits. Incuber les plaques à température ambiante pendant 1 heure.
- Infect puits à une MOI = 20. Centrifuger la plaque à 400 xg pendant 5 min (Eppendorf 5810R) et flotter dans un bain à 37 ° C de l'eau pendant 5 min. Placer la plaque à un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur pendant 18 heures.
- Confirmez les infections par imagerie des cellules vivantes sur un microscope à fluorescence avant d'accueillir la lyse des cellules et la récolte des bactéries.
3. Ensemencement des cellules THP-1 pour l'infection des cellules cibles étape
- (Commencez ce processus 24 heures avant la mise en place des cultures bactériennes liquides). Cultiver cellules THP-1 dans des flacons de 75 cm 2 à la culture quasi-confluence en milieu RPMI 1640 avec 10% de sérum de sérum fœtal bovin (FBS).
- Compter le nombre de cellules en suspension à l'aide d'un hémocytomètre, diluer les cellules THP-1 en milieu RPMI 1640 avec 10% de FBS et 100 ng / ml de phorbol-12-myristate-13-acétate (PMA) à une concentration de 1 x 10 6 cellules / ml , et la plaque en aliquotes de 1 ml sur des plaques 12 puits de culture cellulaire. Incuber les plaques pendant 48 heures à 37 ° C, 5% de CO 2.
4. Traitement des bactéries de l'infection des cellules cibles après l'étape de la phase d'amorçage des infections
- Aspirer les médias de la amibes désamorcée.
- Lyse l'unmoebae en utilisant 500 ul de glace froide, stérile ultra-filtrée (UF) H 2 O et incuber à température ambiante pendant 10 min.
- La piscine de l'lysats selon la souche de type et de prendre une mesure nm E 512 pour chacun des lysats agrégées en utilisant un lecteur de plaque à fluorescence (Molecular Devices Spectramax Gemini EM).
- Calculer une DO600 de mesure pour les lysats communs: calcOD 600 = 0,0008 (E 512 - fond lysat) + 0.0019. La formule a déjà été déterminée en traçant une comparaison directe des deux la DO 600 et les 512 E nm mesures de dilutions de L. pneumophila GFP de type sauvage exprimant phase stationnaire de la culture in vitro (Figure 1 *). Les lysats d'amibes non infecté, sous réserve des mêmes conditions expérimentales que l'amibe infectée, sont utilisés comme une vierge et a fourni une valeur de correction (fond lysat par exemple), qui a été incorporé dans l'équation. Le t volume nécessaireo infecter un bien à une MOI = 20 est calculé pour chaque pool lysat: V = [(THP-1 tête de série) x MOI] / [calcOD 600 x (constant)] = [(1 X 10 6) x (20)] / [calcOD 600 x (1 x 10 6)] = 20/600 calcOD.
- Laver les cellules THP-1 3x avec du PBS et ajouter 1 ml de RPMI 1640 frais (10% de FBS) à chaque puits. Incuber les cellules THP-1 pendant 1 heure à 37 ° C, 5% de CO 2.
- Infecter les cellules THP-1 à l'aide de MOI calculé les lysats communs. Laisser un ensemble de puits pour se protéger du virus, servant de témoin négatif pour la cytométrie en flux. Traitement de la phase d'amorçage devrait être achevé en moins de 30 min. Les lysats sont conservés sur la glace pour limiter les changements dans l'expression génétique bactérienne avant l'infection.
- Centrifuger la plaque, flottent à augmenter la température, et incuber comme dans la phase d'amorçage.
- Une heure après l'infection, retirer le support par aspiration et laver les puits 3 fois avec du PBS pour éliminer les bactéries extracellulaires.
- Ajouter 1 ml fréquencesh RPMI 1640 (10% de FBS) dans les puits et retourner la plaque dans l'incubateur. Le temps immédiatement après le remplacement de support sert à zéro le temps (T 0). Incuber les cellules THP-1 pour les 14-16 heures à 37 ° C, 5% de CO 2.
5. Analyse expérimentale
5,1 imagerie des cellules vivantes
L'image des puits infectés à l'aide d'un microscope à fluorescence (AMG EVOS fl) au grossissement 10x ou 20x (figures 1A-D). Les images peuvent être comparées qualitativement ou quantitativement pour déterminer les niveaux d'infection à la fois dans la phase d'amorçage et les infections cibles cellulaires scène.
5.2 La cytométrie en flux
- Les pics d'émission des différentes infections peuvent être comparés par cytométrie en flux (BD FACS Calibur). Trypsiniser les infectés cellules THP-1 et doucement, lavez les puits en mélangeant dans du PBS avec une pipette.
- Piscine des cellules par la souche de type dans 15 ml tubes Falcon et le culot à 1800 xg pendant 2min dans la centrifugeuse de table.
- Suspendre les granules dans 1 ml de PBS et transférer à 1,5 ml microtubes.
- Centrifuger les suspensions à 1.800 x g (Eppendorf 5424) et remettre en suspension les culots dans 1 ml de PBS. Si les suspensions obtenues sont très turbide (DO 600 ≥ 1,0), ils doivent être dilués dans PBS supplémentaire (1:3) pour éviter le colmatage des lignes dans le cytomètre en flux.
- Utilisez une filtration stérile PBS pour l'équilibrage du cytomètre de flux et pour les étapes de lavage entre les injections de l'échantillon. Tracer la dispersion vers l'avant / latérale de cellules cibles non infectées avant l'injection d'échantillons cibles cellulaires d'infection.
- Recueillir 20.000 événements totales pour chaque condition en utilisant excitation à 488 nm laser et le canal FL1.
- Populations cellulaires Porte post-capture d'exclure les cellules non infectées et de l'intensité de fluorescence parcelle dans un histogramme (FlowJo) (figure 1E).
5.3 placage UFC
- O Examinez le rendementf infection par placage UFC de cellules récoltées pour la cytométrie en flux. Préparer des dilutions en série des échantillons dans ultrafiltrée H 2 O à 10 -1, 10 -2, et 10 -3.
- Planche 20 ul de chaque dilution sur 1/3 de la plaque CYEA avec 6,25 mg / ml CM.
- Incuber les plaques à 37 ° C pendant 72 heures.
- Compter les colonies à l'aide d'un cure-dent et compteur de cellules.
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Representative Results
Un résultat typique pour le processus d'infection ensemble est présenté dans la figure 1. Vivez micrographies de fluorescence de cellules représentant des monocouches de A.castellanii infectées par le type sauvage L. pneumophila pendant la phase d'amorçage est illustré à la figure 1A. Une mesure réussie de l'étape d'amorçage conduirait à une population d'environ 90% des cellules hôtes contenant de grandes vacuoles peuplées par des bactéries GFP étiquetés à cet MOI. A 18 heures après l'infection, la plupart A. castellanii cellules ont atteint un maximum charges bactériennes encore lyse de la population est minime. En microscopie optique, une infection d'amorçage réussi révélera amibes arrondi et détaché. Gentamycine [25 pg / ml] peut être ajouté au milieu de culture 30 min à 1 h après l'infection pour éliminer la contribution de bactéries extracellulaires. Le Δ DOTA souche mutante, qui ne peut pas soutenir Dot / Icm médiée par translocation d'effecteurs, ne devrait pas croître dansA. castellanii et bien que la culture in vitro devrait fluorescence ainsi que la souche de type sauvage, la fluorescence minimale devrait être détectés avec cette souche à 18 h après l'infection. Les amibes apparaissent à plat et la monocouche doit être intact.
Lysats totaux hébergeant L. pneumophila et les débris de cellules hôtes sont immédiatement soumises à une analyse spectrophotométrique afin de calculer la concentration de bactéries dans l'échantillon. MOI peut être calculée en utilisant la courbe de corrélation (Figure 1 *). Les cellules cibles doivent être préparés pour une telle infection que les bactéries apprêtées sont utilisés moins de 30 minutes après la lyse de préserver l'intégrité des profils d'expression génique. Une fois infecté, les cellules cibles sont incubées pendant 14-18 heures avant qu'ils ne soient traités. Micrographies de fluorescence dans la figure 1B montrent l'avantage acquis par pathogène protozoaire amorcé par type sauvage L. pneumophila dans les infections cibles cellulaires de l'étape A. castellanii par rapport à la même souche qui a été limitée à la culture in vitro avant l'infection. Infections cibles cellulaires scène sont moins robustes que la phase d'amorçage en raison de l'inclusion d'une étape de lavage 1-2 heures post-infection (cible dépendant des cellules). Cette étape de remplacement des médias supprime les bactéries non invasives, la synchronisation de l'infection et la réduction de la fluorescence de fond dans des applications ultérieures. Figures 1C-D montrent des micrographies de fluorescence d'un type de type sauvage L. scénario pneumophila infection à deux étages, où les bactéries sont tout d'abord amorcé par infection de A. castellanii, récolté à partir des cellules lysées protozoaires, quantifiée en utilisant la courbe de corrélation et utilisé pour infecter les macrophages THP-1 pendant 14 heures.
Après la microscopie, les cellules sont trypsinisées la cytométrie en flux (BD FACS Calibur). Les cellules non infectées sont utilisées pour calibrer la machine en marche avant et la diffusion latérale. Les infections par chaque souche sont des processused avec 20.000 événements enregistrés. FlowJo 7.6.1 logiciel est utilisé pour analyser les données brutes. Typiquement, la fluorescence (488 nm excitation) est d'abord relevée en dispersion latérale pour identifier la fluorescence de fond de la population de cellules non infectées. Les parcelles sont déclenchés pour exclure cette population et re-tracer un histogramme des chiffres totaux par rapport à l'intensité de fluorescence. Parce que chaque cellule bactérienne représente une unité de fluorescence, l'intensité du signal donne une représentation de la charge vacuolaire dans chaque cellule infectée. Un tracé typique d'une infection de type sauvage est illustré à la figure 1E. Dans l'ensemble, le nombre relatif de cellules infectées détectées par le cytomètre en flux est plus faible que prévu lors de la comparaison avec les données de microscopie. Cytométrie en flux en direct cellulaire est suffisamment sensible pour détecter les écarts toutefois contrainte.
Quantification du total de CFU dans les échantillons est effectuée en générant des dilutions en série des cellules préparées pour cytométrie en flux et le placage ultérieursur CYEA médias. Après 72 heures à 37 ° C, des colonies isolées devraient être évidents et assez rare pour le comptage.
Figure 1. D'amorçage protozoaires et les infections cibles cellulaires scène à l'aide Legionella pneumophila. A. sauvage ou de type IV sécrétion déficiente (Δ DOTA) L. souches pneumophila ont été amenés à exprimer la GFP par culture in vitro (petites montures) et utilisé pour infecter A. monocouches castellanii de 18 heures à MOI = 20. Micrographies de fluorescence des infections par chaque L. pneumophila souche sont présentés (grandes trames) comme une fusion de contraste de phase et E 512 nm images de fluorescence avec un objectif 20X sur un microscope à fluorescence (AMG EVOS fl). Croissants verts sont représentatifs des intracellulaire vacuolesharboring L. pneumophila. B. GFP micrographies de fluorescence de 18 h stade de l'infection cible cellulaire de A. castellanii de type sauvage L. pneumophila récoltées à partir de l'infection protozoaire phase d'amorçage (en haut) ou en culture in vitro (en bas), où le MOI = 10 pour chaque a été calculée en utilisant l'équation dérivée de la courbe de corrélation montre (bleu *). La courbe a été produit en utilisant des dilutions en série de type sauvage de L. pneumophila exprimant la GFP de 18 h une culture in vitro. C. La fluorescence micrographie d'une infection étape d'amorçage de A. castellanii de type sauvage L. pneumophila comme en (A). D. micrographie par fluorescence d'une infection cible 14 h stade des cellules différenciées de PMA macrophages THP-1 de type sauvage L. pneumophila récolté à partir de la phase d'amorçage infection protozoaire dans (C). Le MOI = 20 a été calculée en utilisant l'équation dérivée de la corcourbe par rapport illustré (* bleu). Le cadre est représentée une fusion de contraste de phase et fluorescence E512 nm images comme dans (A). Histogramme E. de données de cytométrie de flux de comparaison non infectées macrophages THP-1 (rouge) et des cellules infectées par le protozoaire apprêté de type sauvage L. pneumophila (vert). Barre d'échelle = 100 um. Cliquez ici pour agrandir la figure.
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Discussion
L'expression du gène bactérien est étroitement contrôlée par une combinaison de la progression du cycle de vie et en réponse à des signaux du micro-environnement environnant. Vacuolaires pathogènes comme L. pneumophila répondre à une multitude de dérivés de cellules hôtes indices quand compartimenté dans un phagosome. Comme un résultat collectif de l'épuisement des nutriments dans la cellule hôte, la bactérie compense en exprimant les facteurs nécessaires à une bonne diffusion dans une cellule hôte après 25 ans. L. pneumophila adapté à parasiter efficacement une grande variété de cellules de protozoaires et recèle donc un vaste catalogue de protéines effectrices de conduire ce processus. Ces protéines effectrices sont transportés directement dans le cytoplasme hôte lors de l'infection par le système Dot / Icm de sécrétion de type IV b 16. Translocation de protéine effectrice est nécessaire, comme les mutations qui conduisent à un transporteur défectueux complètement suppriment la croissance intracellulaire dans n'importe quel type de cellule hôte. Curiously, suppressions individuelles en particulier des protéines effectrices rarement conduit à un affaiblissement de croissance intracellulaire. Près de 300 protéines effectrices, soit près de 10% du génome codant pour la protéine ont été validées comme Dot / Icm substrats 14,15. Plusieurs hypothèses ont émergé pour expliquer le manque de phénotypes observables pour les suppressions effectrices, y compris la présence de copies paralogues ou l'acquisition horizontale des enzymes orthologues résultant de la large gamme d'hôtes de L. pneumophila.
Parce que L. pneumophila gagne un avantage pathogène lors du pré-cultivée dans des cellules de protozoaires (figures 1A-B), nous avons pensé que des bactéries in vitro en culture ne serait pas afficher le profil d'expression génique même apparente chez les bactéries quittent l'hôte protozoaire. Par conséquent, l'expression de certaines protéines effectrices ne peut être induite dans le cadre de la croissance intracellulaire dans les cellules de protozoaires. Si un effecteur particulier n'a pas été induite par eXpression pendant la culture in vitro, de la contribution de l'effecteur ne peut pas être supprimé efficacement évaluée dans un scénario infection traditionnel. Phénotypes de facteurs de virulence importants pour l'établissement de l'infection ou la diffusion ne serait détecté des infections prolongées qui ont permis de cellule à cellule. Nous avons donc cherché à mettre au point un test capable de mesurer la contribution des facteurs de virulence potentiels dans le contexte d'une infection séquentielle. Dans le cas de L. naturelle pneumophila acquisition, il est probable que d'un hôte humain se heurterait à une bactérie qui avait été amorcée pour une infection protozoaire dans une cellule, où protozoaires peuvent être plus résistants aux traditionnelles pratiques municipales de traitement des eaux 10.
Afin d'optimiser la purification partielle d'une quantité suffisante de bactéries apprêtées, nous avons d'abord créé une souche de L. visuelle traitable pneumophila en utilisant IPTG inductible gfp uchanter plasmide copies transmises du locus gfp. Nous avons également généré une insertion chromosomique seul exemplaire d'IPTG gfp inductible sur le génome de type sauvage. Bien que les deux souches fluorescence in vitro et lors de l'infection, le nombre élevé de copies du plasmide d'origine GFP produite de signal suffisante pour des applications en aval du dosage. Nous avons établi que l'utilisation de bouillon de culture L. pneumophila à une MOI = 20 était suffisante pour infecter massivement A. monocouches castellanii. Dix-huit heures d'incubation a été déterminée comme optimale pour visualiser de grandes vacuoles fluorescentes sans atteindre un stade de lyse cellulaire hôte (figure 1A). Monocouches de protozoaires ne sont pas respectées plastiques de culture cellulaire, et sont donc facilement perturbé par étapes de lavage. Plaques de 12 puits de culture cellulaire produit des monocouches les plus stables en comparaison avec d'autres navires (6 ou 24 puits, boîte de 10 cm). Parce que L. pneumophila peuvent pas grandir dans le milieu d'infection utilisée dans ee étape d'amorçage, nous avons choisi de renoncer à toute étape de lavage pour éliminer les bactéries extracellulaires. Cela améliore grandement le rendement de l'amibe infectée dans la monocouche. Gentamycine est également souvent utilisé pour tuer les bactéries extracellulaires. Nous avons constaté des effets toxiques à des concentrations supérieures protozoaires 25 pg / ml, et n'ont trouvé aucune différence dans le nombre total de bactéries récupérées à partir de l'infection au stade d'amorçage à 18 h. Lyse de la cellule protozoaire monocouche a été effectuée avec de la glace froid ultrafiltrée H 2 O, un solvant qui compromet osmotique de la cellule hôte sans nuire à L. pneumophila. Si adaptés pour être utilisés avec des agents pathogènes qui ne sont pas stables dans H 2 O, 0,1% de Triton X-100 dans du PBS peut être utilisé pour lyser les amibes avec des résultats similaires.
Afin de comparer directement souche à l'autre des différences dans les infections ultérieures de cellules cibles, une équation a été généré pour corréler la densité optique des bactéries à 600 nm avec une émission de fluorescence de la GFP à 512 nm (Figure 1 *). Nous avons choisi d'utiliser l'émission de fluorescence comme un moyen de quantifier en raison de l'importante contribution de débris cellule hôte en OD 600 mesures de lysats de cellules eucaryotes. Ce bruit de fond élevé contraste avec des valeurs négligeables observées pour l'émission à 512 nm à partir des mêmes lysats. Les valeurs de DO 600 = 1,0 = 1x10 9 UFC / ml ont été prédéterminé pour L. pneumophila, ce qui permet de calculer la concentration bactérienne dans un large intervalle de valeurs de fluorescence. De nombreux organismes ont établi des valeurs UFC pour DO600 = 1,0, ce qui permettrait d'appliquer cette technique à un autre pathogène grâce à la génération d'une courbe de corrélation basée sur l'émission de fluorescence. Nous avons choisi d'éviter une étape de purification bactérienne lors de la lyse des cellules de protozoaires, afin de 1) maximiser le rendement de bactéries amorcées disponible pour l'infection de cellules cibles et 2) minimiser le délai entre la récolte et l'infection ultérieure de préserver global p l'expression des gènesConstantes.
In vitro culture de type sauvage L. pneumophila a été amenée à exprimer la GFP pendant 18 heures avec 1 mM d'IPTG. Des dilutions en série de cette culture ont été utilisés pour les mesures spectrophotométriques. En utilisant l'équation dérivée, les infections de cellules cibles ont été systématiquement réalisée à taux variable MOI avec une production constante. Une MOI de 10 produit environ 1/2 le nombre total de cellules infectées par rapport aux infections qui ont reçu une MOI de 20 (figures 1A-B). Nous avons testé trois hôtes de cellules cibles avec ce dosage; A. castellanii, murins J774 macrophages humains et PMA-différenciées macrophages THP-1. Dans chaque cas, l'infection résultant n'a jamais été aussi solide que l'infection d'amorçage dans le même MOI (figures 1C-D). On a déterminé que ce que l'étape de lavage supplémentaire au cours de l'infection de cellule cible étape, qui est réalisée à la fois synchroniser l'infection des cellules cibles et de réduire les bactéries extracellulaires, est responsible pour cette observation. Néanmoins, il est crucial que l'expérience est au contrôle interne avec une souche de type sauvage à la fois pour l'amorçage et les infections cibles cellulaires scène. La quantité de bactéries récupérées dans l'étape d'amorçage est plutôt limitatif pour les infections ultérieures, donc qu'un seul type de cellule cible doit être utilisée par l'expérience.
La quantification de l'infection de la cellule cible a été atteinte en utilisant trois méthodes dans cet essai. La microscopie à fluorescence a été utilisé avec un objectif 20X. Images de vacuoles hébergeant L. pneumophila ont été manuellement à compter de plusieurs champs pour chaque souche testée. L'analyse par cytométrie en flux a fourni une mesure sensible des différences dans les cellules infectées au total, ainsi que d'une approximation de la charge vacuolaire, où un plus grand signal de fluorescence a été corrélée avec la contribution du signal de la GFP des nombres croissants de L. cellules pneumophila. Ensemencement par dilution de série fourni des valeurs quantitatives pour le nombre totalde volume par UFC dans les échantillons cellulaires prélevés pour la cytométrie en flux. Collectivement, ces méthodes permettent des résultats pleinement maniables et quantifiables dans un scénario de l'infection séquentielle.
Le test d'amorçage est très polyvalent et convient pour une adaptation à tout agent pathogène bactérien qui utilise des protozoaires d'eau douce comme un environnement intermédiaire 29,3. Le choix de la cellule cible peut être pris pour s'adapter à la voie d'infection naturelle par l'agent pathogène particulier. Surtout, un modèle d'infection séquentielle peuvent être utilisés pour examiner des souches mutantes qui ne présentent pas de croissance à un phénotype dans un modèle d'infection traditionnelle à l'aide de bactéries in vitro en culture. Profilage transcriptionnel chez les bactéries cultivés in vitro pour des facteurs de virulence présumés pourraient révéler des différences importantes dans le profil d'expression dans l'hôte infecté intermédiaire. Cela pourrait ouvrir une nouvelle ligne d'investigation pour la fonction des protéines non caractérisées et leur contribution au naturelvoies d'infection.
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Disclosures
Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Craig Roy et le Dr Dario Zamboni pour fournir un modèle pour les infections de cellules de protozoaires. Nous remercions le Dr. Jagdeep Obhrai, le Dr Georgiana Purdy, le Dr Fred Heffron et Todd Wisner pour l'équipement et les réactifs, le Dr Lulu Cambronne à l'examen critique du manuscrit. La cytométrie en flux a été réalisée à l'installation de débit OHSU cytométrie de ressources partagées. Ce travail a été financé en partie par une subvention de la Fondation pour la recherche médicale de l'Oregon et une subvention du NIH R21 AI088275 (EDC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | antibiotic |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| ACES | Sigma | A9758-1KG | media component |
| ATCC medium: 712 PYG | ATCC | growth media for protozoans | |
| 1X PBS | Fisher Scientific | SH30256FS | phosphate buffered saline |
| activated charcoal | Fisher Scientific | C272-212 | media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | media component |
| peptone | BD Diagnostics | 211677 | media component |
| agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | media component |
| L-cysteine, 99%+ | Acros organics | 173601000 | media supplement |
| Ferric nitrate nonahydrate | Fisher Scientific | I110-100 | media supplement |
| Equipment | |||
| EVOS fl | AMG | EVOS fl | fluorescence microscope |
| Smart Spec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | spectrophotometer |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 22627023 | bench top centrifuge |
| Repeater plus | Eppendorf | 22230201 | repeating pipette |
| SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | microplate reader | |
| Softmax Pro 5.3 | Molecular Devices | 0200-310 | microplate reader software |
| 5424 microfuge | Eppendorf | 22620401 | table top microcentrifuge |
| Fast-release pipette pump II | Scienceware | 379111010 | pipette aid |
| FACS Calibur | BD Bioscience | flow cytometer | |
| FlowJo 7.6.1 | FlowJo | license | flow cytometery software |
| 15 ml tube | BD Falcon | 352096 | polypropylene conical tube |
| 1.6 ml microfuge tube | Neptune | 3745.X | microcentrifuge tubes |
References
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