Summary
Bu teknik, önceki memeli hücrelerinin protozoal enfeksiyonlara karşı doğal ev sahibi hücrelerin önceden yetiştirilir bakteriyel patojenlerin hücre içi büyüme, hasat normalleştirmek ve ölçmek için bir yöntem sağlar. Bu yöntem, sahne emiş hem de hedef hücre tipleri için konukçu hücrelerin geniş bir çeşitliliği için modifiye edilebilir.
Abstract
Birçok hücre içi bakteriyel patojenler. Ortamında yayılması için doğal bir rezervuar olarak tatlı su protozoans kullanmak Legionella pneumophila, Lejyoner pnömoni etkeni, ilk önce memeli makrofajlar enfeksiyonu protozoon hücre hasat İn vitro kültür bakterileri üzerinde patojenik avantaj kazanır. Bu önemli virülans faktörleri düzgün vitro ifade edilemez olabileceğini düşündürmektedir. Biz priming L. için uysal sistemi geliştirdik memeli hücre enfeksiyonu doğal protozoon ana Acanthamoeba castellanii aracılığıyla pneumophila öncesinde. Herhangi bir virülans faktörünün katkısı protozoon priming sonra yabani tip bakteri bir mutant suşunun hücre içi büyüme karşılaştırılarak incelenebilir. GFP-ifade eden vahşi tip ve mutant L. pneumophila suşlarının astar adımda protozoon monolayers bulaştırmak için kullanılan ve hücre içi büyüme evrelerinde ulaşmasına izin verilir. Floresan bakteriler daha sonra bu enfekte hücrelerden hasat ve memeli makrofajlar içine bir sonraki enfeksiyon bakteri karşılaştırılabilir sayılar üretmek için spektrofotometri ile normalize edilir. Miktar için, canlı bakteri floresan mikroskobu, akım sitometri ve koloni plaklamayla kullanarak enfeksiyonu sonrası takip edilmektedir. Bu teknik vurgular ve doğal bir edinim güzergah karşılaşılan olacağını ortamı taklit ederek konak hücre bağımlı gen ifadesinin katkısı dayanır. Bu yaklaşım bir patojen avantajı sağlamak için bir araç olarak aracılık konak kullanan herhangi bir bakterinin karşılamak için değiştirilebilir.
Introduction
Çok sayıda bakteriyel patojenler intrasellüler kabinindeki yaşam ve çoğaltma için konak hücreleri istismar genelleştirilmiş stratejiler adapte etmişlerdir. Birçok durumda, patojenik mekanizmaların protozoon ve metazoan hücreleri arasındaki benzer. Bununla birlikte, bu iki mikro çok farklı olan ve virülans faktörü 1-4 arasında farklı ifade neden olabilir. Lejyoner hastalığı bakterisi Legionella pneumophila ubiquitously 5 dünya çapında tatlı su ortamları ile ilişkilidir. Önemlisi, L. pneumophila organizmanın 6-8 ekili in vitro daha farklı bir protozoon hücre çıkmadan bakterinin küresel gen ekspresyon profilleri düşündürecek şekilde, insan monosit patojenik bir avantaj elde enfeksiyon öncesinde protozoon hücreleri yetiştirilmektedir. Doğada, tatlısu amipler istilacı bakterinin hızlı amplifikasyon için zengin besin sınırları sağlamaktadır. L. İnsan edinimi pneumophila çoğunlukla bakteri içeren kirli su damlacıklarının solunması atfedilir. Büyük olasılıkla bu damlacıkları liman protozoon hücre ilişkili bakteriler olduğunu; protozoon hücre konvansiyonel su arıtma uygulamaları 9,10 karşı daha dayanıklı olduğu. 11-13 protozoan konak hücreleri içinde hücre içi bakterilerin yaşam döngüsünün ile hemen hemen aynı şekilde, akciğer alveolar makrofaj ilerler enfeksiyonu.
Hayatta kalmak ve ökaryotik hücrelerde çoğaltmak için, L. pneumophila Nokta / Icm konak hücre 14-16 sitozolüne yaklaşık 300 'efektör' proteinleri teslim olarak adlandırılan özel bir türü IVb salgı sistemini kullanır. Bu efektör proteinleri topluca bakterinin 17,18 için bir çoğaltma müsamahakâr bölmesi oluşturmak amacıyla hücresel süreçleri yıkmak için çalışır. Hücre içi mult için arızalı suşunun Nokta / Icm taşıyıcı sonucu ihtiva 26 genlerin herhangi delesyonlarıiplication 19-23. Tarihsel olarak, bireysel efektör gen kodlama bölgesinin silinmesi nadiren hücre içi büyüme için zayıflatılmış bir suşu ile sonuçlanmıştır. Bu olgu gereksiz fonksiyon ve etkileyiciler paralogous kopyaları dahil olmak üzere birçok hipotez isnat edilmiştir.
Bazı virülans faktörü ancak konak hücre ile ilişkili hücre içi büyüme 24 bağlamında ifade edilmiştir. Bu, belirli bir efektör sadece protozoan enfeksiyonu bağlamında ifade edildi, daha sonra efektör katkısı hem in vitro olarak kültür edildi bir yabani tip soyla karşılaştırıldığında edilemeyeceğini rasyonalize. Bir replikatif bir aktarıcı aşamasına L. pneumophila geçişler bu kültür 25'de sabit faz girer gibi. Faz geçişi fenotipi intraselüler büyüme sırasında karşılaşılan ve motilite 26 kamçının montajı ile örneklendirilmiştir besin tükenmesi temsil eder. Çünkü L. pneumophila daha invaziv olanprotozoon hücre hasat zaman sive ve öldürücü, biz konak makrofajları karşılaştı daha sadık bakterinin patojen devletin temsil ettiği bir test geliştirmek için çalıştı.
Bu amaçla, ilk (priming hücre) ve ikinci (hedef hücre) evre enfeksiyonları için uygun herhangi bir ana karşılamak çok yönlü bir protozoon emişli analiz geliştirilmiştir. Enfeksiyon süreci istikrarlı bir şekilde yeşil floresan protein (GFP) eksprese bakterilerin kullanımı yoluyla uysal olduğunu. Protozoan Acanthamoeba castellanii için enfeksiyon modeli geniş alan 27 içinde kullanılan bir yöntem takip eder. Priming adım, L. için pneumophila suşlarının etiketli 'geçirgen' bakteri (Şekil 1A) üretmek için sıvı ortamda sabit faz in vitro yetiştirilmektedir. Bakteriler bir sonraki A. tek katmanlarını enfekte etmekte kullanıldığında castellanii 18 saat süreyle intrasellüler yaşam döngüsünün geç bir aşamasında elde etmek. Büyük vakuoller içerening bakterileri floresan mikroskobu (Şekil 1A) kullanarak bu kez noktada incelenebilir. Protozoan hücreler daha sonra lize edilir ve lizat alınan bakteri bir floresans plaka okuyucusu kullanılarak 512 nm'de emisyon için ölçülmüştür. Floresans hedef hücrelerin enfeksiyonu (Şekil 1, * Korelasyon Eğrisi) için çokluk-of-enfeksiyonu (İB) hesaplamak için optik yoğunluğu ile ilişkilidir. Invazyon (T 0) ve 18 saat işgal sonrası (T 18) sonra, hedef hücrelerin hücre içi bakteri temsil, floresan için ölçülür. Floresan mikroskobu ve akım sitometri ile izlenebilir, ve yaşayan sayı koloni sayesinde kaplama ölçülebilir. Astar assay hep wild-tip L. ile enfeksiyonların eşlik ediyor pneumophila ve Nokta / Icm tip IV sekresyon sistemi (Δ Dota) (Şekil 1A) kusurlu bir gerginlik. Bu önemlisi vahşi tip bir arasında doğrudan karşılaştırmalar için iç kontroller sağlarenfeksiyon işleminde kullanılan nd herhangi izogenik mutant soylar. Astarlama aşamasında avirulent Δ DotA suşu dahil in vitro kültürlenmiştir izogenik mutant soylar ile ilişkili olarak zayıflatılmış büyüme fenotipi gözlenmesi için bir eşik değeri belirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Astarlama Sahne Enfeksiyonlar için Legionella pneumophila Kültürlerin Hazırlanması
- Tüm L. Transform bir izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) kodlayan plazmid pAM239 ile ölçüm içinde kullanılabilir pneumophila suşları, yeşil flöresanlı protein (GFP) 28 indüklenebilir. Çizgi demir ve sistein üzerine bakteri suşları kömür maya özütü ağarı (CYEA) 6.25 ug / ml kloramfenikol (CM) (plazmid bakım için) ve 72 saat için inkübe edilir içeren tamponlu N-(2-Asetamido)-2-aminoetansülfonik asit (ACES) ilave 37 saat ° C.
- Desteklenmiştir ACES içine bakteri suşunun bir inokulum 6.25 mg / ml CM ve 1 mM IPTG ile (AYE) maya özü suyu tamponlu aktarın ve 37 orbital çalkalayıcı üzerinde sabit faz (O / N) yetiştirmek ° C.
- Floresans mikroskopisi kullanılarak in vitro kültürlerde GFP onaylayın. Bir kapak altında bir cam slayt üzerine kültür 10 ul aktarınkayma ve GFP uyarma / emisyon küp (AMG EVOS fl) ile 60X objektif kullanılarak görüntü.
- Steril H 2 O kullanılarak 1:10, in vitro kültür, her biri 100 ul alikot seyreltilir 1 mM IPTG ve 6.25 mg / ml cm ve su ile boş bir AYE 100 ul kullanarak medya olun. Spektrofotometre ile dilüsyonlarının OD600 ölçümleri (Bio-Rad Smart Spec Plus) atın. In vitro kültürün her biri için bir İçişleri Bakanlığı = 20 iyi bulaştırmak için hacim gerekli hesaplayın: V = [(amip seeded) x MOI] / [OD 600 x (seyreltme faktörü) x (sabit)] = [(1 X 10 6 ) x (20)] / [OD 600 x (10) X (1 x 10 6)] = 600 2/OD. Bakteri Konsantrasyon OD 600 olarak belirlenmiştir = 1.0 = 1 x 10 9 CFU / ml.
2. Acanthamoeba castellanii kullanma Astarlama Sahne Enfeksiyon
- Korumak ve RT 175 cm 2 şişeler ATCC 712 PYG orta amipler yetiştirmek.
- Amipler cul medya değiştirinlıklar bakteriyel sıvı kültürleri başlamadan önce 24 saat. Aynı gün sıvı bakteri kültürleri başladı, toplamak ve bir hemasitometre kullanarak bir ışık mikroskobu hücreleri saymak.
- 1 x 10 6 hücre / ml 'lik bir nihai konsantrasyon için taze ortam ile amip seyreltin. Amipler 1 ml alikotları ile Tohum 12-iyi hücre kültürü plakaları RT O / N. bir tekrar pipet ve inkübe kullanarak
- İnkübasyondan sonra, 1 ml steril bir 10 ml PBS serolojik pipet ve bir kılavuz pipet yardımı ile 3x 12-iyi hücre kültür plakalarının kuyuların iyice yıkayın.
- PBS aspirasyon sonra, 1 mM IPTG ve her kuyuya 6.25 mg / ml cm ile enfeksiyon medya (ATCC 712 PYG medya eksi glukoz, pepton ve maya ekstraktı) 1ml ekleyin. 1 saat oda sıcaklığında plakalar inkübe edin.
- Bir MOI = 20 kuyu Infect. 5 dk (Eppendorf 5810R) için 400 x g'da santrifüjlenir plaka ve 5 dakika için bir 37 ° C su banyosu içinde yüzer. Bir 37 ° C, 18 saat süreyle% 5 CO2 kuluçka makinesi ile levha aktarın.
- Bakterilerin hücre parçalama ve hasat barındırmak için önce bir floresan mikroskop canlı hücre görüntüleme kullanarak enfeksiyonları onaylayın.
3. Hedef Hücre Sahne Enfeksiyon THP-1 hücreleri Tohum
- (Önceden sıvı bakteri kültürleri kurma bu süreç 24 saat başlayın). % 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal bovin serumu (FBS) ile RPMI 1640 ortamı içinde yakın konfluense için bir 75 cm 2 kültür şişeleri içinde THP-1 hücreleri, geliştirin.
- Hemasitometre kullanılarak süspansiyon hücreleri hesaplama, 1 x 10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda% 10 FBS ve 100 ng / ml forbol-12-miristat-13-asetat (PMA) ile RPMI 1640 ortamı içinde THP-1 hücreleri, seyreltik ve 12-iyi hücre kültürü plakaları üzerinde 1 ml alikotları plakası. 37, 48 saat süreyle inkübe plakaları ° C,% 5 CO2.
4. Astarlama Sahne Enfeksiyon sonra Hedef Hücre Sahne Enfeksiyon Bakteriler İşleme
- Astarlanmalıdır Amiblerden medya aspire.
- Bir parçalayıcımoebae 10 dakika boyunca oda sıcaklığında buz soğuk, steril ultra-filtre (UF) H 2 O ve inkübe 500 ul kullanarak.
- Havuz tipi süzün ve bir floresan plak okuyucu (Molecular Devices Spectramax İkizler EM) kullanılarak toplanmış lizatları her biri için bir E 512 nm ölçümü almak için uygun lizatları.
- - + 0.0019 calcOD 600 = 0.0008 (lizat plan E 512): havuzlanmış lizatları bir OD 600 ölçüm hesaplayın. Formül önceden OD 600 ve L. dilüsyonları D 512 nm ölçümleri her ikisi de doğrudan bir mukayese grafik ile belirlendi in vitro kültür durağan faz (Şekil 1 *) dan pneumophila yabani tip ifade GFP. Enfekte amip gibi aynı deney koşullarına tabi bulaşmamış amip lizatları, boş olarak kullanılan ve denkleme dahil bir düzeltme değeri (örneğin lizat arka plan) sağlanmaktadır. Hacmi gerekli tbir de bulaşabilir o bir İçişleri Bakanlığı = 20 her lizat havuzu için hesaplanır: V = [(THP-1 numaralı seribaşı) x MOI] / [calcOD 600 x (sabit)] = [(1 x 10 6) x (20)] / [calcOD 600 x (1 x 10 6)] = 20 / calcOD 600.
- PBS ile 3x THP-1 hücreleri yıkayın ve her kuyuya 1 ml taze RPMI 1640 (% 10 FBS) ekleyin. 37, 1 saat boyunca inkübe THP-1 hücreleri ° C,% 5 CO2.
- Havuzlanmış lizatları kullanarak İB hesaplanan de THP-1 hücreleri Infect. Kuyuların bir dizi akım sitometri analizi için bir negatif kontrol olarak hizmet bulaşmamış kalması için izin verin. Priming sahne İşleme az 30 dk içinde tamamlanması gerekmektedir. Lizatları enfeksiyondan önce bakteriyel gen ekspresyonu değişiklikleri sınırlamak için buz üzerinde tutulur.
- Plaka santrifüjleyin sıcaklığını yükseltmek için yüzer ve hazırlama aşamasında olduğu gibi kuluçkaya yatmaktadır.
- Bir saat sonrası enfeksiyon, aspirasyon, ortamı çıkarın ve ekstraselüler bakteri kaldırmak için PBS ile 3x kuyuları yıkayın.
- Fre 1 ml ekleyinsh RPMI kuyuları için 1640 (% 10 FBS) ve inkübatör plaka döner. Hemen medya değişiminden sonra zaman zaman sıfır (T 0) olarak hizmet vermektedir. 37, 14-16 saat için THP-1 hücreleri, inkübe ° C,% 5 CO2.
5. Deneysel Analizi
5.1 Canlı hücre görüntüleme
Enfekte 10X bir floresan mikroskop (AMG EVOS fl) kullanarak kuyu veya 20X büyütme (Şekil 1A-D) Görüntü. Görüntüler priming sahne ve hedef hücre aşamasında enfeksiyonları enfeksiyon düzeylerini belirlemek için ya nitel ya da nicel mukayese edilebilir.
5.2 Flow sitometri
- Farklı enfeksiyonların emisyon zirveleri akış sitometrisi (FACS Calibur BD) ile mukayese edilebilir. Enfekte THP-1 hücreleri Trypsinize ve yavaşça bir pipetle PBS içinde karıştırılarak kuyulardan yıkayın.
- 2 1.800 xg'de 15 ml Falcon tüpleri ve pelet haline Havuzu gerginlik türüne göre hücrelermasa üstü santrifüj min.
- 1 ml PBS içinde askıya alınması ve pelet 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine aktarılır.
- 1,800 x g'de (Eppendorf 5424) de süspansiyonu santrifüjlenir ve 1 ml PBS içerisinde pelet yeniden askıya. Çıkan süspansiyonlar oldukça bulanık ise (OD 600 ≥ 1.0) onlar flowsitometri satırların tıkanmasını engellemek için ek PBS (1:3) oranında inceltilmiş olmalıdır.
- Akış sitometresinin eşitlendirmesinde ve örnek enjeksiyonlar arasındaki yıkama adımlar için filtrelenmiş steril PBS kullanın. Önceki hedef hücre enfeksiyon örnekleri enjeksiyon ile enfekte olmayan hedef hücrelerin ileri / yan dağılım çizilir.
- 488 nm lazer uyarma ve FL1 kanalı kullanarak her durum için 20.000 toplam etkinlik toplayın.
- Kapısı çekim sonrası hücre popülasyonlarının bulaşmamış hücreleri ve histogramda arsa floresan yoğunluğu (FlowJo) (Şekil 1E) dışlamak için.
5.3 CFU kaplama
- Verim o incelemekAkım sitometri için hasat hücre CFU plaklamayla f enfeksiyonu. Ultra-filtreli H 2 10 -1 O, 10 -2, 10 -3 örneklerinin seri dilüsyonları hazırlayın.
- 6.25 ug / ml Cm ile her bir seyreltme CYEA plaka 1/3 'üzerine Levha 20 ul.
- 72 saat için 37 ° C sıcaklıkta inkübe plakaları.
- Bir kürdan ve hücre sayıcı kullanarak kolonileri sayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bütün enfeksiyon süreci için tipik bir sonucu Şekil 1 'de özetlenmiştir. Vahşi tip L ile enfekte A.castellanii tek katmanlarını gösteren hücre flüoresanı mikrografikleri Canlı Astar aşamasında pneumophila Şekil 1A 'de gösterilmiştir. Priming adımın başarılı bir tedbirin bu İB de GFP etiketli bakteri ile doldurulan büyük vakuoller içeren konak hücrelerinin yaklaşık% 90 bir nüfusa yol açacak. 18 saat sonrası enfeksiyon, çoğu A. castellanii hücreleri maksimum bakteriyel yükleri elde ettik henüz nüfusun lizis düzeydedir. Işık mikroskobu altında başarılı bir astarlama enfeksiyonu yuvarlak ve müstakil amipler ortaya çıkaracaktır. Gentamisin [25 ug / ml] hücre dışı bakteri katkı ortadan kaldırmak için 30 dakika, 1 saat sonrası enfeksiyon kültür ortamına ilave edilebilir. Etkileyiciler Dot / Icm-aracılı translokasyon bakamam Δ dota mutant suşu, büyümek olmamalıIn vitro kültür içinde de vahşi tip suşu olarak flüorışı gerekli olsa da, A. ve castellanii, minimal flüoresans 18 saat sonrası enfeksiyon, bu suşu ile tespit edilmelidir. Amip düz görünür ve tek tabaka sağlam olmalıdır.
L. barındıran Toplam lizatları pneumophila ve konak hücre artıkları hemen örnek bakteri konsantrasyonu hesaplamak için spektrofotometrik analiz tabi tutulur. MOI korelasyon eğrisi (Şekil 1 *) kullanılarak hesaplanabilir. Hedef hücrelerin gen ekspresyon profillerinin bütünlüğünü korumak için Parçalama işleminden sonra astarlanmalıdır bakteri 30 dakikadan az kullanılan bu tür enfeksiyon için hazırlıklı olmalısınız. Işlendikten sonra, daha önce enfekte, hedef hücreleri 14-18 saat boyunca inkübe edilir. Şekil 1B Floresans mikroskop protozoon astarlanmış yabani tip L. tarafından satın patojen üstünlüğü gösterilememiştir A. hedef hücre aşamasında enfeksiyonları pneumophila castellanii enfeksiyon öncesi in vitro kültürü ile sınırlı aynı suşu ile karşılaştırıldığında. Hedef hücre aşamada enfeksiyonları Bir yıkama kademesinden 1-2 saat sonrası enfeksiyon (hedef hücre-bağımlı) dahil edilmesi nedeniyle astar aşamasında daha az sağlamdır. Bu yedek ortamlar adım enfeksiyonu senkronize ve daha sonraki uygulamalarda arka plan floresan azaltılması, non-invaziv bakterilerin kaldırır. Şekil 1C-D tipik bir yabani tip L. floresan mikroskop göstermek bakteri İlk A. enfeksiyon yoluyla astarlanmalıdır vardır pneumophila iki aşamalı enfeksiyon senaryosu, erimiş protozoan hücreler hasat castellanii, korelasyon eğrisi kullanılarak belirlenebilir ve 14 saat için THP-1 makrofajlar bulaştırmak için kullanıldı.
Mikroskopi sonra, hücreler akış sitometrisi (FACS Calibur BD) için tripsinize edilir. Enfekte olmamış hücreler ileri ve yan dağılım için makine kalibre etmek için kullanılır. Her zorlanma ile Enfeksiyonlar süreçtir20.000 olayları ile ed kaydedildi. FlowJo 7.6.1 yazılım ham verileri analiz etmek için kullanılır. Tipik olarak, floresans (488 nm eksitasyon) ilk bulaşmamış hücre popülasyonunun arka plan floresan tanımlamak için yan dağılım karşı çizilir. Arsalar Bu nüfus ve floresan yoğunluğu ile toplam sayıları bir histogram olarak yeniden çizilen dışlamak için kapı vardır. Her bir bakteri hücre flüoresanı, sinyallerinin bir birim temsil eder, çünkü her bir hasta hücreye vaküoler yükün bir gösterimini verir. Bir yabani-tip enfeksiyon tipik bir arsa Şekil 1E 'de gösterilmiştir. Genel olarak, akış sitometrisi ile tespit enfekte hücrelerin nispi sayısını mikroskopi verileri ile karşılaştırıldığı zaman beklenenden daha düşüktür. Canlı hücre akım sitometri Ancak gerginlik farklarını algılamak kadar hassastır.
Toplam CFU en örneklerinde kantitasyonu akış sitometrisi ve daha sonraki kaplama için hazırlanmış hücreler seri dilüsyonları oluşturarak gerçekleştirilirCYEA medya. 37 saat sonra 72 ° C'de, tek koloniler belirgin ve sayım için yeterli seyrek olmalıdır.
Şekil 1. Protozoa emişli ve Legionella pneumophila kullanarak hedef hücre aşamasında enfeksiyonlar. A. Yabani tip veya tip IV sekresyon eksik (Δ Dota) L. pneumophila suşunun in vitro kültürü (küçük kare) aracılığıyla GFP ifade indüklenen ve A. bulaştırmak için kullanıldı MOI = 20, 18 saat boyunca castellanii mono tabakalar. Her L. ile enfeksiyonların Floresans mikroskop pneumophila suşu faz kontrast ve floresan mikroskop (AMG EVOS fl) bir 20X objektif ile E 512 nm floresan görüntüleri birleştirme gibi (büyük kare) gösterilir. Yeşil hilal intrasellüler vacuolesharbori temsilcisi olanng L. A. 18 saat hedef hücre sahne enfeksiyon pneumophila. B. GFP floresan mikroskop vahşi tip L. ile castellanii pneumophila protozoon emişli aşamada enfeksiyon (üst) veya kültür vitro (altta), İçişleri Bakanlığı = 10 her gösterilen korelasyon eğrisi (mavi *) türetilen denklemi kullanılarak hesaplanmıştır. hasat Eğri yabani-tip L. seri seyreltmeler kullanılarak üretilir pneumophila in vitro kültürün bir 18 saat gelen GFP ifade. A. bir astar sahne enfeksiyon C. Floresans mikrografı vahşi tip L. ile castellanii pneumophila vahşi tip L ile THP-1 makrofaj farklılaşan PMA bir 14 saat hedef hücre aşamasında enfeksiyon (A). D. Flüoresans mikroskobu olarak pneumophila (C) protozoon emişli aşamasında enfeksiyondan hasat. MOI = 20 kor elde edilen denklem kullanılarak hesaplandıilişkisi eğrisi (mavi *) gösterilmiştir. Gösterilen çerçeve faz kontrast ve protozoon astarlanmalıdır vahşi tip L. bulaşmış bulaşmamış THP-1 makrofaj (kırmızı) ve hücreleri karşılaştırarak flow sitometri veri (A). E. Histogram arsa olarak E512 nm floresan görüntü birleştirme olduğunu pneumophila (yeşil). Ölçek bar = 100 mikron. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakteriyel gen ekspresyonu sıkıca yaşam döngüsü ilerlemesi ve çevredeki mikroçevresindeki sinyallerine yanıt bir kombinasyonu yoluyla kontrol edilir. Böyle L. gibi vakuoler patojenler bir phagosome bölmesiz zaman pneumophila konak hücre kaynaklı işaretlerin bir sayıda yanıt verir. Konak hücre içinde besin tükenme kollektif bir sonucu olarak, bakteri, bir sonraki ana hücre 25 ile başarılı bir şekilde yayılması için gereken faktörler tarafından ifade dengeler. L. pneumophila verimli bir protozoan hücreler çeşitli parasitize için uyarlanmış ve bu nedenle bu işlem sürmek için efektör proteinlerin geniş bir katalog barındırır. Bu efektör proteinleri Nokta / Icm tip IVb salgı sistemi 16 ile enfeksiyon sırasında ana sitoplazma doğrudan transloke edilir. Efektör protein translokasyon kusurlu bir taşıyıcı içinde sonucu tamamen herhangi bir konak hücre tipi hücre içi büyüme feshini mutasyonların olarak gereklidir. Antikausly, özellikle efektör proteinleri bireysel olarak hücre içi silmeler nadiren büyüme zayıflama ile sonuçlanmıştır. Yaklaşık 300 efektör protein veya protein kodlama genomunun yaklaşık% 10 Nokta / Icm substratlar 14,15 olarak onaylanmıştır. Çeşitli hipotez paralogous kopyalarının varlığını ya da L. geniş konukçu kaynaklanan orthologous enzimlerin yatay toplama silmeler de dahil olmak üzere efektör için gözlemlenebilir fenotipleri eksikliği açıklamak için ortaya çıkmıştır pneumophila.
Çünkü L. protozoon hücreler (Şekil 1A-B) ön-kültürlü, in vitro kültür bakterileri protozoon konak çıkmadan bakterilerde aynı gen ekspresyonu profili belirgin gösteremez ki gerekçeli zaman pneumophila patojenik bir avantaj kazanır. Bu nedenle, belirli bir efektör protein ifadesi sadece tek hücreli hücreleri içinde hücre içi büyüme bağlamında indüklenebilir olabilir. Belirli bir efektör e uyarılmadığı iseSilinen efektör katkısı daha in vitro kültür sırasında Xpression, etkili bir geleneksel enfeksiyonu senaryo değerlendirmeye alınamamıştır. Enfeksiyon veya yayılması kurulması için önemli bir virülans faktörlerinden Fenotiplerinin yalnızca hücre yayılması hücre için izin uzamış enfeksiyonları tespit olacaktır. Bu nedenle, bir ardışık enfeksiyon bağlamında potansiyel virülans faktörü katkısı ölçebilir bir tahlil geliştirmeye çalıştılar. Doğal L. halinde pneumophila edinimi, bir insan konak bir protozoon hücre enfeksiyonu için astarlanmalıdır olan bir bakterinin karşılaşma olasılığının yüksek olduğunu; protozoans geleneksel belediye su arıtma uygulamaları 10 daha dirençli olabilir nerede.
Astarlı bakteriler yeterli miktarda kısmi saflaştırılması optimize etmek için, öncelikle L. görsel uysal baskı kurmuş IPTG indüklenebilir gfp u kullanarak pneumophilagfp odağı plazmid kaynaklı kopyalarını şarkı. Biz de yabani tip genomu indüklenebilir gfp IPTG tek bir kopyasını kromozomal ekleme oluşturulur. Her iki suş, in vitro ve enfeksiyon sırasında floresan olsa da, plazmid kaynaklı gfp yüksek kopya sayısı tahlil içinde aşağı uygulamalar için yeterli sinyal üretti. Biz kurduğu suyu kültürlü L. kullanarak Bir MOI = 20 pneumophila ağır A. bulaştırmak için yeterli oldu castellanii monolayers. Inkübasyon Onsekiz saat konak hücre lizis (Şekil 1A) bir aşamaya ulaşmadan büyük floresan Vakuollerin görselleştirmek için optimum olarak belirlenmiştir. Protozoa monolayers hücre kültürü plastik uymadığını ve bu nedenle kolayca yıkama adımları rahatsız olur. Diğer kaplar (6 ya da kuyu 24, 10 cm tabak) ile karşılaştırıldığında 12-iyi hücre kültür plakaları en kararlı mono tabakalar üretti. Çünkü L. pneumophila inci kullanılan enfeksiyon ortam içinde büyüyemezE emişli adım, biz ekstraselüler bakteri kaldırmak için herhangi bir yıkama kademesinden terk etmek seçti. Bu, büyük ölçüde, tek tabaka halinde enfekte amip verimi iyileştirir. Gentamisin da genellikle ekstrasellüler bakterileri öldürmek için kullanılır. Biz 25 mikrogram / ml 'nin üzerinde konsantrasyonlarda protozoon toksisite etkileri bulundu, ve 18 saatte emişli sahne enfeksiyon kurtarıldı toplam bakteri sayısı açısından herhangi bir farklılık bulunamadı. Protozoan hücre mono tabakasında parçalanması L. zarar vermeden, buz gibi soğuk ultra-filtre H2O, ozmotik konak hücre ödün bir çözücü ile gerçekleştirildi pneumophila. H2O stabil olmayan patojenler ile kullanılmak üzere adapte edilmiş ise,% 0.1 Triton X-PBS içinde 100 benzer sonuçlar ile amip lyse için de kullanılabilir.
Doğrudan sonraki hedef hücre enfeksiyonları farklılıkları zorlanma zorlanma karşılaştırabilmek amacıyla, bir denklem 512 nm (Figür de GFP floresan emisyon ile 600 nm'de bakterilerin optik yoğunluk korelasyon elde edildie 1 *). Biz ökaryotik hücre lizatları gelen OD 600 ölçümlerde konakçı hücre enkaz büyük katkısı nedeniyle ölçümü için bir araç olarak floresans emisyon kullanmayı seçti. Bu yüksek arka plan aynı lizatları 512 nm'de emisyon gözlenen ihmal değerleri ile kıyaslanmıştır. OD 600 Değerleri = 1.0 = 1x10 9 CFU / ml L. önceden edildi floresan değerleri geniş bir aralık içindeki bakteri konsantrasyonunun hesaplanması için izin pneumophila,. Birçok organizma OD 600 CFU değerleri kurduk = floresans emisyon dayalı bir korelasyon eğrisinin nesil ile başka patojen için bu tekniği uygulamak için izin vereceğini 1.0. Biz), hedef hücre için müsait enfeksiyon astarlanmış bakteri verimi maksimuma çıkarmak ve 2) genel gen ekspresyonu p korumak için hasat ve müteakip enfeksiyonu arasındaki zamanı en aza indirmek 1 için tek hücreli hücrelerin parçalanması sırasında bakteriyel bir saflaştırma adımı önlemek için tercihatterns.
İn vitro kültür vahşi tip L değerine pneumophila 1 mM IPTG ile 18 saat süreyle GFP ifade oluşturuldu. Bu kültürün seri seyreltileri, temas açısı ölçümleri için kullanılmıştır. Elde edilen denklem kullanarak, hedef hücre enfeksiyonları rutin tutarlı çıktı değişken MOI evinde yapıldı. Bir İB 10 olan bir İB 20 (Şekil 1A-B) gelen enfeksiyonları ile karşılaştırıldığında toplam enfekte hücrelerin yaklaşık olarak 1/2 sayı üretilir. Biz bu testte üç hedef hücre ana test ettik; A. castellanii, mürin J774 makrofajlar ve insan PMA-diferansiye THP-1 makrofaj. Her durumda, ortaya çıkan enfeksiyon (Şekil 1C-D) İçişleri Bakanlığı aynı zamanda emiş enfeksiyon gibi güçlü değildi. Her iki hedef hücre enfeksiyon senkronize etmek ve hücre dışı bakteriler azaltmak için yapılır hedef hücre aşamasında enfeksiyon sırasında ek bir yıkama adımı, solunum olduğu belirlenmiştirBu gözlem için onsible. Bununla birlikte, deney dahili astar ve hedef hücre aşamasında enfeksiyonları için yabani tip suşu ile kontrol edilir önemlidir. Priming adımda ele Bakteriyel miktarlarda yerine sonradan enfeksiyonlar için sınırlayıcı, bu nedenle yalnızca tek bir hedef hücre tipi Deneme başına kullanılmalıdır.
Hedef hücre enfeksiyon kantitasyonu bu deneyde üç yöntem kullanılarak elde edilmiştir. Flüoresan mikroskobisi bir 20X amacı ile kullanılmıştır. L. yataklık vakuolü Görüntüleri pneumophila elle test her bir suş için çeşitli alanlardan sayıldı. Akım sitometrik analizi enfekte toplam hücre farklılıklar, hem de vaküoler yükün bir yaklaşım için hassas bir ölçümü sağlanmaktadır, daha yüksek bir floresan sinyalinin L. sayısının artması nedeniyle GFP sinyali katkısı ile korelasyon olduğu pneumophila hücreler. Seri seyreltme kaplama toplam sayısı için sayısal değerler verilmiştirAkım sitometri için toplanan hücre örneklerinin CFU kişi başına hacim. Topluca, bu yöntemler sıralı bir enfeksiyon senaryo tamamen uysal ve ölçülebilir sonuçlar için izin verir.
Emişli tahlil oldukça çok yönlüdür ve çevresel bir ara 29,3 olarak tatlı su protozoans kullanan herhangi bir bakteriyel patojen uyum için uygundur. Hedef hücrenin seçimi, özel bir patojenden için doğal enfeksiyon yol uyacak şekilde karşılanabilmektedir. Önemli olarak, sıralı bir enfeksiyon modelinde in vitro kültür içinde bakteri kullanılarak geleneksel bir enfeksiyon modeli içinde bir büyüme fenotipi olan mevcut değildi mutant soylar incelemek için kullanılabilir. Varsayılan virülans faktörlerinden İn vitro kültür bakterileri Transkripsiyonlu profilleme enfekte arakonak ifade profilinde önemli farklılıklar ortaya koyabilir. Bu doğal etmek uncharacterized proteinler ve katkı fonksiyonu için soruşturma yeni bir hat açabilirenfeksiyon yolları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Biz protozoon hücre enfeksiyonları için bir şablon sağlamak için Dr Craig Roy ve Dr Dario Zamboni ederim. Yazının eleştirel yaklaşım Dr Lulu Cambronne; Biz Dr Jagdeep Obhrai, Dr Georgiana Purdy, Dr Fred Heffron ekipman ve reaktifler için Todd Wisner ederim. Flow sitometri OHSU Akış Sitometri Paylaşımlı Kaynak tesisi yapıldı. Bu eser Oregon ve bir NIH hibe R21 AI088275 (EDC) Tıbbi Araştırma Vakfı tarafından bir bursla kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | antibiotic |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| ACES | Sigma | A9758-1KG | media component |
| ATCC medium: 712 PYG | ATCC | growth media for protozoans | |
| 1X PBS | Fisher Scientific | SH30256FS | phosphate buffered saline |
| activated charcoal | Fisher Scientific | C272-212 | media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | media component |
| peptone | BD Diagnostics | 211677 | media component |
| agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | media component |
| L-cysteine, 99%+ | Acros organics | 173601000 | media supplement |
| Ferric nitrate nonahydrate | Fisher Scientific | I110-100 | media supplement |
| Equipment | |||
| EVOS fl | AMG | EVOS fl | fluorescence microscope |
| Smart Spec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | spectrophotometer |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 22627023 | bench top centrifuge |
| Repeater plus | Eppendorf | 22230201 | repeating pipette |
| SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | microplate reader | |
| Softmax Pro 5.3 | Molecular Devices | 0200-310 | microplate reader software |
| 5424 microfuge | Eppendorf | 22620401 | table top microcentrifuge |
| Fast-release pipette pump II | Scienceware | 379111010 | pipette aid |
| FACS Calibur | BD Bioscience | flow cytometer | |
| FlowJo 7.6.1 | FlowJo | license | flow cytometery software |
| 15 ml tube | BD Falcon | 352096 | polypropylene conical tube |
| 1.6 ml microfuge tube | Neptune | 3745.X | microcentrifuge tubes |
References
- Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues. Science. 259, 686-688 (1993).
- Mahan, M. J., et al. Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 669-673 (1995).
- Rankin, S., Isberg, R. R. Identification of Legionella pneumophila promoters regulated by the macrophage intracellular environment. Infect. Agents Dis. 2, 269-271 (1993).
- Rankin, S., Li, Z., Isberg, R. R. Macrophage-induced genes of Legionella pneumophila: protection from reactive intermediates and solute imbalance during intracellular growth. Infect. Immun. 70, 3637-3648 (2002).
- Fields, B. S. The molecular ecology of legionellae. Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).
- Cirillo, J. D., et al. Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 67, 4427-4434 (1999).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S. Growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii enhances invasion. Infect. Immun. 62, 3254-3261 (1994).
- Faucher, S. P., Mueller, C. A., Shuman, H. A. Legionella pneumophila Transcriptome during Intracellular Multiplication in Human Macrophages. Front Microbiol. 2, 60 (2011).
- Kilvington, S., Price, J. Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure. J. Appl. Bacteriol. 68, 519-525 (1990).
- King, C. H., Shotts, E. B., Wooley, R. E., Porter, K. G. Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination. Appl. Environ. Microbiol. 54, 3023-3033 (1988).
- Horwitz, M. A. Formation of a novel phagosome by the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 1319-1331 (1983).
- Horwitz, M. A. Phagocytosis of the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil. Cell. 36, 27-33 (1984).
- Horwitz, M. A., Silverstein, S. C. Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes. J. Clin. Invest. 66, 441-450 (1980).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).
- Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638 Forthcoming.
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Front Microbiol. 2, 136 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Shin, S., Roy, C. R. Host cell processes that influence the intracellular survival of Legionella pneumophila. Cell Microbiol. 10, 1209-1220 (2008).
- Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
- Marra, A., Blander, S. J., Horwitz, M. A., Shuman, H. A. Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9607-9611 (1992).
- Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
- Segal, G., Shuman, H. A. Characterization of a new region required for macrophage killing by Legionella pneumophila. Infect Immun. 65, 5057-5066 (1997).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Haghjoo, E., Galan, J. E. Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi. Mol. Microbiol. 64, 1549-1561 (2007).
- Molofsky, A. B., Swanson, M. S. Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle. Mol. Microbiol. 53, 29-40 (2004).
- Hammer, B. K., Tateda, E. S., Swanson, M. S. A two-component regulator induces the transmission phenotype of stationary-phase Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 44, 107-118 (2002).
- Ninio, S., Zuckman-Cholon, D. M., Cambronne, E. D., Roy, C. R. The Legionella IcmS-IcmW protein complex is important for Dot/Icm-mediated protein translocation. Mol. Microbiol. 55, 912-926 (2005).
- Neild, A. L., Roy, C. R. Legionella reveal dendritic cell functions that facilitate selection of antigens for MHC class II presentation. Immunity. 18, 813-823 (2003).
- Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
- Huws, S. A., Smith, A. W., Enright, M. C., Wood, P. J., Brown, M. R. Amoebae promote persistence of epidemic strains of MRSA. Environ. Microbiol. 8, 1130-1133 (2006).
