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Neuroscience

लेजर या न्यूरॉन्स घाव मस्तिष्क की चोट के बाद जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण के लिए एकल न्यूरॉन्स के समृद्ध आबादी का कब्जा Microdissection

Published: April 10, 2013 doi: 10.3791/50308
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Anesthesiology, University of Texas Medical Branch

Summary

हम वर्णन कैसे लेजर कब्जा microdissection (LCM) का उपयोग करने के लिए या घायल बाद जीन की अभिव्यक्ति विश्लेषण मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर और / या पूरे जीनोम प्रोटीन का उपयोग करने के लिए चूहे के मस्तिष्क के जमे हुए वर्गों से hippocampal न्यूरॉन्स एकल न्यूरॉन्स की समृद्ध आबादी प्राप्त.

Abstract

TBI के बाद लंबी अवधि के संज्ञानात्मक विकलांगता चोट प्रेरित हिप्पोकैम्पस - एक औसत दर्जे का टेम्पोरल लोब कि सीखने और स्मृति, और कार्यकारी समारोह के लिए महत्वपूर्ण है में क्षेत्र में neurodegeneration के साथ जुड़ा हुआ है. 1,2 इसलिए हमारे अध्ययन विशिष्ट neuronal जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित हिप्पोकैम्पस के अलग उपक्षेत्र में आबादी. लेजर पर कब्जा microdissection (LCM), Emmert - बक द्वारा 1996 में शुरू की तकनीक, एट अल. 3 एकल कक्षों के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण में उल्लेखनीय प्रगति के लिए अनुमति दी गई है और समृद्ध स्तनधारी मस्तिष्क जिसमें रूप में विषम ऊतकों से कोशिकाओं की आबादी कार्यात्मक सेल प्रकार के हजारों 4. हम LCM और एक अच्छी तरह से स्थापित घाव मस्तिष्क की चोट (TBI) के चूहे मॉडल के आणविक तंत्र कि TBI के रोगजनन आबाद की जांच का उपयोग करें. तरल पदार्थ टक्कर TBI के बाद दिमाग में पूर्व निर्धारित समय पर चोट के बाद हटा रहे हैं, तुरंत सूखी बर्फ पर जमे हुए है,और एक cryostat में सेक्शनिंग के लिए तैयार है. चूहे के दिमाग अक्टूबर और sectioned में एम्बेड किया जा सकता है तुरंत, या -80 पर कई महीनों संग्रहीत डिग्री सेल्सियस लेजर कब्जा microdissection के लिए सेक्शनिंग पहले. इसके अतिरिक्त, हम circadian लय पर TBI के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए LCM का उपयोग करें. इस के लिए, हम suprachiasmatic नाभिक से न्यूरॉन्स है कि स्तनधारी मस्तिष्क के मास्टर घड़ी होते कब्जा. यहाँ, हम LCM का उपयोग करने के लिए वास्तविक समय पीसीआर और / एक की पहचान (और घायल degenerating, फ्लोरो जेड - सकारात्मक, या रिहाई, फ्लोरो जेड नकारात्मक) न्यूरॉन्स और बाद जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए hippocampal न्यूरॉन्स के समृद्ध आबादी प्राप्त प्रदर्शित या पूरे जीनोम प्रोटीन. इन LCM सक्षम अध्ययन से पता चला है कि चूहे हिप्पोकैम्पस की anatomically अलग क्षेत्रों के चुनिंदा भेद्यता LCM द्वारा इन अलग - अलग क्षेत्रों से प्राप्त न्यूरॉन्स के विभिन्न आबादी के विभिन्न जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल में परिलक्षित होते हैं. हमारे एकल कोशिका अध्ययन, जहां से परिणामहम मर रहा है और आसन्न hippocampal न्यूरॉन्स जीवित transcriptional प्रोफाइल की तुलना, कि TBI के बाद कोशिका मृत्यु और अस्तित्व को नियंत्रित एक सेल अस्तित्व रिओस्तात के अस्तित्व का सुझाव.

Introduction

विषम ऊतकों के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण हमेशा समस्याग्रस्त किया गया है, यह स्तनधारी दिमाग है, जो लगभग 5000 विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में विशेष रूप से सच है 4 लेजर कब्जा (LCM) microdissection तकनीक, TBI के प्रभाव के जीनोमिक अध्ययन के विकास के लिए पहले vivo में जीन की अभिव्यक्ति के मस्तिष्क शामिल कोशिकाओं के एक मिश्रित आबादी में न केवल अलग neuronal सेल प्रकार की है, लेकिन यह भी glial और immunomodulatory कोशिकाओं का समर्थन करने का विश्लेषण पर आधारित थे. जिसके परिणामस्वरूप जटिल जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल इन विषम ऊतकों से प्राप्त किया, और चोट प्रेरित सेलुलर संकेतों के अक्सर विरोधाभासी पैटर्न 5 TBI के पूर्व नैदानिक ​​अध्ययन में प्रभावी सिद्ध चिकित्सकीय रणनीति के मानव नैदानिक ​​परीक्षणों में विफलता के लिए एक व्याख्या हो सकती है

न्यूरॉन्स की कमजोर आबादी में चूहा कूल्हे से चोट प्रेरित जीन की अभिव्यक्ति का एक स्पष्ट समझ प्राप्तpocampus, हम LCM की तकनीक, 3 1 Emmert बक एट अल द्वारा की सूचना दी. बाद में, हम संशोधित और अनुकूलित न्यूरॉन्स और mRNA रूपरेखा के लिए एकल न्यूरॉन्स मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर और माइक्रोएरे विश्लेषण का उपयोग करने की समृद्ध आबादी के कुशल पर कब्जा करने के लिए इस तकनीक microdissection अपनाया . जीनोमिक विश्लेषण के लिए मस्तिष्क के ऊतकों के जमे हुए वर्गों में mRNA की अखंडता को बनाए रखने के लिए, हम फिक्सिंग, धुंधला और जमे हुए चूहे के मस्तिष्क वर्गों से न्यूरॉन्स का तेजी से कब्जा के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल संशोधित. पहचान और घायल और मर hippocampal न्यूरॉन्स के अलगाव के लिए, हम भी Fluoro जेड LCM के लिए धुंधला हो जाना तकनीक अनुकूलित. Fluoro जेड apoptotic और परिगलित कोशिका मृत्यु के बीच भेद नहीं करता. इस प्रकार, degenerating न्यूरॉन्स के सभी प्रकार के दाग. 6,7 द्वारा पाया जा सकता है

यहाँ, हम हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल के लिए एकल मरने या जीवित न्यूरॉन्स के पूल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से समृद्ध populati के swaths प्राप्त प्रोटोकॉल का वर्णनons अलग neuronal सेल प्रकार (यानी TBI के बाद CA1 CA3 विश्लेषण जीन अभिव्यक्ति न्यूरॉन्स). तरल पदार्थ टक्कर मस्तिष्क चोट हमारी प्रयोगशाला में प्रदर्शन के लिए प्रक्रिया Shimamura एट अल., 8 में विस्तार से वर्णित है और बहुत पार्श्व द्रव टक्कर Alder एट अल द्वारा जौव में प्रकाशित चूहों के लिए चोट प्रोटोकॉल के लिए इसी तरह की है LCM तकनीक है के बाद से. 9 शाही सेना और ऊतकों में प्रोटीन, डीएनए की अखंडता पर कम या कोई प्रभाव नहीं दिखाया गया है, यह परिभाषित सेल प्रकार की आणविक और प्रोटीन के विश्लेषण के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है.

Protocol

1. शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं और द्रव TBI टक्कर

  1. सभी पशु प्रयोगों 1 संस्थागत पशु की देखभाल और प्रयोगशाला पशु (8 संस्करण, राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद) की देखभाल और उपयोग के लिए उपयोग समिति टेक्सास चिकित्सा शाखा Galveston, टेक्सास और स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के विश्वविद्यालय के द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं.
  2. चूहे (वयस्क पुरुष Sprague-Dawley चूहों, 400-500 छ विक्रेता चार्ल्स नदियों, पोर्टलैंड से प्राप्त, मेन) प्रति दो पिंजरे में रखे जाते हैं और भोजन और एक पशुवाटिका में पानी यथेच्छ इन शर्तों के साथ लगातार प्रदान: प्रकाश चक्र (600 घंटे के लिए 1800 ) घंटा, तापमान (21 डिग्री सेल्सियस 23 डिग्री सी), और नमी (40% से 50%) एक सप्ताह के उपयोग करने के लिए पहले.
  3. 4% isoflurane, नली लगाना, और यंत्रवत् हवादार के साथ चूहों anesthetize (Nemi वैज्ञानिक, नई इंग्लैंड मेडिकल उपकरण, Medway, एमए) ऑक्सीजन में 1.5-2.0 isoflurane% के साथ चूहों: हवा (70:30) और उन्हें तरल पदार्थ टक्कर parasagittal के लिए तैयार चोट के रूप में पहले से वर्णित है. 810,
  4. चोट के बाद उचित समय बिंदु प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर चूहों बलिदान. जल्दी दिमाग को निकालने के लिए, सूखी बर्फ पर तुरंत फ्रीज, और दुकान या ° एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में सी -80 पर तुरंत आगे बढ़ने के लिए जमे हुए सेक्शनिंग के लिए अक्टूबर में एम्बेड.

2. सेक्शनिंग और चूहे के मस्तिष्क के धुंधला हो जाना

  1. मस्तिष्क के ऊतकों है कि तुरंत नहीं प्रयोग किया जाता है -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है एक महीने के लिए अगर एक निरंतर तापमान पर रखा. दिमाग है कि -80 में जमे हुए हैं डिग्री सेल्सियस, तो सेक्शनिंग के लिए ° -20 सी thawed, और उसके बाद फिर से जमे हुए गुणवत्ता शाही सेना 2 विगलन के बाद उपज नहीं करते. एक बार thawed मस्तिष्क, अक्टूबर में घुड़सवार और sectioned, स्लाइड 24 घंटे के भीतर दाग किया जाना चाहिए और धुंधला हो जाना के एक घंटे के लिए 30 मिनट के भीतर LCM के लिए इस्तेमाल किया. यह अच्छी गुणवत्ता की शाही सेना को सुनिश्चित करेगा. बाद LCM, LCM टोपी पर कब्जा कर लिया कोशिकाओं -80 डिग्री सेल्सियस पर lysis बफर में संग्रहीत किया जा सकता है एक सप्ताह तक के लिए है, लेकिन उच्चतम गुणवत्ता सुनिश्चित करने आरएनए एक समय पर ढंग से अलग किया जाना चाहिए./ Li>
  2. पहले मस्तिष्क सेक्शनिंग RNase जैप साथ cryostat पोंछे और ब्रश साफ ETOH (प्रत्येक मस्तिष्क के बीच डिस्पोजेबल ब्लेड की जगह) के साथ.
  3. 50 मिलीलीटर ट्यूब में -80 ° C फ्रीजर से मस्तिष्क पुनर्प्राप्त cryostat में तापमान -22 डिग्री सेल्सियस और ट्यूब में लगभग 10 मिनट के लिए पिघलना एक जगह है. ट्यूब और मंच पर जगह धुंध पर, उदर पक्ष से मस्तिष्क निकालें.
  4. एक रेजर ब्लेड का प्रयोग, मस्तिष्क टुकड़ा बस सेरिबैलम और ऑप्टिक chiasm अग्र भाग व्याख्यान चबूतरे वाला मस्तिष्क के पीछे हिस्से को हटा दें. अक्टूबर बढ़ते मध्यम (ऊतक टेक) के साथ एक cryomold भरें, और पूर्वकाल पक्ष के साथ मोल्ड में मस्तिष्क नीचे जगह. मस्तिष्क के ऊतकों बढ़ते मध्यम में फ्रीज करने के लिए जब तक यह सफेद रंग बदल जाता है (लगभग 10 मिनट) की अनुमति दें.
  5. अक्तूबर साथ मस्तिष्क पर रुक नमूना डिस्क (टिश्यू टेक). आचारण से मस्तिष्क निकालें. सिर में नमूना मस्तिष्क डालें और शिकंजा कस.
  6. एक disposa डालेंचाकू धारक में ble, कम प्रोफ़ाइल (फिशर साइंटिफिक) ब्लेड और लीवर कस नीचे.
  7. 20 सुक्ष्ममापी पर मस्तिष्क टुकड़ा करने की क्रिया के लिए अक्टूबर की बाहरी परत को हटाने शुरू करो. Hippocampal क्षेत्र तक पहुँच जाता है, 10 माइक्रोन डायल सेट. ऊतक खंड (फिशर साइंटिफिक) पर एक गिलास स्लाइड या प्लस गिलास स्लाइड रखने के द्वारा राज्याभिषेक धारावाहिक वर्गों ले लीजिए. स्लाइड -20 डिग्री सेल्सियस पर एक धुंधला हो RNase मुक्त रैक में संरक्षित कर रहे हैं जब तक सेक्शनिंग पूरा हो गया है.
  8. कांच के बने पदार्थ जहां ऊतक वर्गों संसाधित कर रहे हैं से सभी RNases को दूर करने के लिए, नीचे धुंधला हो कंटेनरों पोंछ और Eliminase (फिशर साइंटिफिक) के साथ सिलेंडरों स्नातक की उपाधि प्राप्त की और Milli क्यू पानी में कुल्ला. RNase मुफ्त पानी के साथ सभी समाधान तैयार है और फिल्टर cresyl (सिग्मा Aldrich) और वायलेट (histo रसायन) Fluoro जेड एक 0.2 सुक्ष्ममापी पहले फिल्टर का उपयोग करने के साथ दाग.
  9. आरटी पर मस्तिष्क वर्गों और 30 सेकंड के लिए पिघलना के 75% ETOH (1 मिनट) में तय.
  10. निर्धारण के बाद एक घायल न्यूरॉन्स का एलसीएम, RNase मुफ्त पानी (1 मिनट) में स्लाइड्स कुल्ला1% cresyl वायलेट (15-20 सेकंड) के साथ counterstain RNase मुफ्त पानी (2 × 30 सेकंड) में कुल्ला, Fluoro जेड (4 मिनट) के साथ दाग, RNase मुफ्त पानी (3 × 1 मिनट) में कुल्ला, 95% RNase मुक्त पानी (30 सेकंड), 100% ETOH (30 सेकंड), और xylene (2 × 3 मिनट) से बना ETOH साथ निर्जलीकरण.
  11. निर्धारण के बाद न्यूरॉन्स के swaths का एलसीएम, RNase मुफ्त पानी (1 मिनट) में स्लाइड्स कुल्ला, 1% cresyl वायलेट (1 मिनट) के साथ दाग के लिए, (3 × 1 मिनट) RNase मुफ्त पानी में कुल्ला करने के लिए, 95% के साथ निर्जलीकरण (2 × 30 सेकंड) ETOH, 100% (2 × 30 सेकंड) ETOH, और xylene (2 × 3 मिनट).
  12. एयर LCM करने से पहले 15 मिनट के लिए एक धूआं हुड में सभी वर्गों की सूखी. स्लाइड, अनुभाग पक्षों संग्रहीत किया जा कर सकते हैं, एक स्लाइड dessicant के साथ लाइन में खड़ा बॉक्स में, अगर वे कमरे से कमरे में स्थानांतरित करने की आवश्यकता है. हालांकि, इष्टतम परिणाम अगर LCM तुरंत बाद किया जाता है वर्गों सूख रहे हैं प्राप्त कर रहे हैं. LCM 30 मिनट से 1 घंटा तक सीमित होना चाहिए. अगले भाग में, हम पहले वर्णन कैसे कोशिकाओं के निरंतर swaths, जो ea है पर कब्जा करने के लिएsiest जो लोग इस तकनीक को सीख रहे हैं के लिए मास्टर करने के लिए. फिर हम वर्णन कैसे ठीक एकल न्यूरॉन्स पर कब्जा करने के लिए. हमारी प्रक्रिया में, हम फ्लोरो जेड degenerating न्यूरॉन्स के मार्कर के लिए मर उनके संबंध द्वारा न्यूरॉन्स की पहचान. Fluoro जेड नकारात्मक कोशिकाओं को न्यूरॉन्स जीवित माना जाता है.

3. लेजर कब्जा Microdissection (LCM)

Hippocampal न्यूरॉन्स की समृद्ध आबादी के swaths की एलसीएम

  1. LCM एक अवरक्त लेजर डायोड (जीवन टेक्नोलॉजीज) के साथ एक PixCell आईआईई माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है.
  2. ऊर्ध्वाधर स्थिति के लिए केंद्र जोस्टिक समायोजित. घुमाएँ और लॉक स्थिति में 4X उद्देश्य है.
  3. खुर्दबीन मंच के केंद्र में एक स्लाइड प्लेस और मैन्युअल रूप से समायोजित हिप्पोकैम्पस के क्षेत्र तक देखने में है. मोटे और ठीक ध्यान समायोजन का उपयोग करने के लिए ध्यान में छवि को लाने के लिए.
  4. नियंत्रक पर वैक्यूम बटन दबाकर निर्वात चक सक्रिय करें. Pl में 10X उद्देश्य घुमाएँ और लॉकइक्का. मोटे और ठीक समायोजन के साथ फिर से ध्यान दें.
  5. लोड CapSure कैसेट मॉड्यूल और स्थिति लोड लाइन की स्थिति पर एक टोपी में CapSure मैक्रो LCM टोपियां (जीवन टेक्नोलॉजीज). कैप प्लेसमेंट और टोपी के चारों ओर हाथ की स्थिति घुमाएँ. कैप नियुक्ति हाथ बढ़ा कैसेट मॉड्यूल से CapSure टोपी को हटा दें.
  6. स्लाइड पर कैप प्लेसमेंट हाथ घुमाएँ और हाथ स्लाइड पर कम नीचे, इस स्लाइड पर टोपी की जगह होगी. ठीक ध्यान समायोजित और जोस्टिक स्थानांतरित करने के लिए जाँच अगर कोशिकाओं टोपी पर काले वृत्त के अंदर हैं. सभी सेल कब्जा इस काले वृत्त के अंदर होना चाहिए.
  7. लेजर मापदंडों सेट. सबसे पहले, लेजर सक्षम नियंत्रक पर बटन दबाएँ. लेजर लक्ष्य स्थान कंप्यूटर मॉनीटर पर देखने के क्षेत्र में एक गुलाबी डॉट के रूप में दिखाई देता होगा.
  8. लेजर हाजिर छोटे आकार (7.5 सुक्ष्ममापी) सेट करने के लिए लेजर ध्यान केंद्रित करने और शक्ति और 65 के लिए अवधि को समायोजित - 75 मेगावाट 1.0-2.0 मिसे के लिए इष्टतम सेल पर कब्जा करने के लिए जरूरत के रूप में.
  9. तेलेजर सेंट, जोस्टिक का उपयोग करने के लिए एक ऐसा क्षेत्र है जहां लेजर हाजिर चाल कोशिकाओं उठाओ. लेजर आग अंगूठे स्विच का उपयोग कर रहा है. जॉयस्टिक का उपयोग करने के लिए लेजर हाजिर पिघल बहुलक स्थान से दूर जाने और जांच करने के लिए देखने के लिए अगर एक दृश्य अंधेरे अंगूठी चारों ओर एक स्पष्ट क्षेत्र है जहां लेजर निकाल दिया गया था.
  10. कक्षों पर कब्जा, जॉयस्टिक का उपयोग कोशिकाओं के क्षेत्र पर कब्जा करने के लिए लेजर हाजिर चाल. लेजर आग अंगूठे स्विच का उपयोग कर रहा है. जोस्टिक चाल जबकि लेजर गोलीबारी कोशिकाओं के एक बड़े क्षेत्र पर कब्जा. जब लेजर निकाल दिया है यह लक्ष्य कोशिकाओं की सतह को टोपी पर थर्माप्लास्टिक बहुलक फिल्म पिघला देता है. बहुलक लेजर विकिरण को अवशोषित कर लेता है, इस प्रकार शाही सेना डीएनए, प्रोटीन या भविष्य आणविक अनुप्रयोगों के लिए नमूना की अखंडता को सुनिश्चित करने के फेरबदल नहीं.
  11. ब्याज की सभी कोशिकाओं फायरिंग के बाद, कैप प्लेसमेंट हाथ उठा. कब्जा कर लिया कोशिकाओं ऊतक अनुभाग से अलग और CapSure टोपी का पालन करना होगा. शेष ऊतक और लापता कोशिकाओं विज़ होगादेखने के क्षेत्र में ible. स्लाइड के एक खाली हिस्से पर टोपी रखकर टोपी पर कोशिकाओं को भी देखा जा सकता है.
  12. कैप नियुक्ति हाथ उठा और इसे बारी बारी से करने के लिए कैप स्टेशन अनलोड. लोअर स्टेशन में टोपी और कैप प्लेसमेंट हाथ अपने पिछले स्थिति में पीछे घुमाएँ.
  13. मंच के साथ और टोपी पर CapSure सम्मिलन उपकरण स्लाइड. मंच से लिफ्ट उपकरण. टोपी संलग्न रहेगा. हल्के के CapSure स्वच्छ पैड टोपी दूर अवांछित ऊतक साफ छुओ.
  14. 0.5 मिलीलीटर RNase मुफ्त lysis RNAqueous माइक्रो अलगाव किट से प्राप्त बफर के 100 μl के साथ भरा ट्यूब में टोपी रखें. 30 सेकंड के लिए तुरंत भंवर टोपी कोशिकाओं lyse. 42 नमूनों में सेते ° सी डिग्री सेल्सियस -80 में 30 मिनट और फ्रीज के लिए जब तक शाही सेना अलगाव.

एकल FJ हिप्पोकैम्पस में न्यूरॉन्स की एलसीएम

  1. एकल कक्षों पर कब्जा करने के लिए, CapSure कैसेट मॉड्यूल और स्थिति में CapSure एचएस LCM टोपियां लोडपर लोड लाइन की स्थिति में एक टोपी. कैप प्लेसमेंट हाथ घुमाएँ और यह टोपी स्थिति. कैप नियुक्ति हाथ बढ़ा कैसेट मॉड्यूल से CapSure टोपी को हटा दें.
  2. लेजर हाजिर छोटे आकार (7.5 सुक्ष्ममापी) के सेट के लिए लेजर ध्यान केंद्रित करने और 0.45 0.50 इष्टतम सेल पर कब्जा करने के लिए एकल कक्षों के मिसे के लिए 65 -75 मेगावाट लेजर शक्ति और अवधि को समायोजित करने के लिए.
  3. स्लाइड पर घुमाएँ कैप प्लेसमेंट बांह और हाथ स्लाइड की ओर कम नीचे. यह स्लाइड पर टोपी जगह होगी. LCM दौरान Capsure एचएस टोपी सतह के नमूने से ऊपर उठाया बैठता है.
  4. जॉयस्टिक देखें का प्रयोग एकल FJ + कोशिकाओं पर लेजर को स्थानांतरित करने के लिए. सभी कोशिकाओं पर कब्जा कर लिया जा रहा है टोपी पर छोटे काले रिंग के अंदर होना चाहिए. लेजर आग अंगूठे स्विच का उपयोग कर रहा है.
  5. जब काले वृत्त क्षेत्र के भीतर सभी सेल लेजर के साथ निकाल दिया गया है, कैप प्लेसमेंट हाथ उठा. कब्जा कर लिया कोशिकाओं ऊतक अनुभाग से अलग और CapSure एचएस टोपी के लिए पालन करना होगा.
  6. माइक्रो पर एक और स्लाइड प्लेसचरण निपटने और FJ + कोशिकाओं को इकट्ठा एचएस टोपी तक भरा हुआ है. एक 0.5 मिलीलीटर RNase मुक्त lysis बफर के 40-50 μl के साथ भरा ट्यूब में टोपी रखें. 30 सेकंड के लिए तुरंत भंवर टोपी कोशिकाओं lyse. 42 नमूनों में सेते ° सी डिग्री सेल्सियस -80 में 30 मिनट और फ्रीज के लिए जब तक शाही सेना अलगाव.

4. LCM नमूनों से कुल शाही सेना अलगाव (यह खंड सिर्फ वीडियो प्रस्तुति में वर्णित किया जाएगा)

  1. से कुल शाही सेना कोशिकाओं RNAqueous माइक्रो निर्माता प्रोटोकॉल का पालन किट (Ambion) का उपयोग अलग है. सभी अभिकर्मकों और धोने के समाधान इस किट में प्रदान की जाती हैं. पूर्व गीला फिल्टर lysis समाधान बफर के 30 μl जोड़कर माइक्रो फिल्टर कारतूस विधानसभा. 5 मिनट के बाद 30 सेकंड के लिए +१०,००० × छ पर फिल्टर अपकेंद्रित्र.
  2. नमूना lysate LCM additive के 3 μl जोड़ें, पिपेट मिश्रण, के लिए और अपकेंद्रित्र.
  3. नमूना lysate 100% ETOH (1/2) की मात्रा का 52 μl विंदुक मिश्रण है, और फिल्टर lysate हस्तांतरणस्तंभ.
  4. 10,000 × छ पर 1 मिनट के लिए फिल्टर स्तंभ अपकेंद्रित्र करने के लिए कॉलम शाही सेना बाइंड करने के लिए. अगर वहाँ एक नमूना के लिए कई टोपियां रहे हैं, एक ही स्तंभ के माध्यम से प्रत्येक lysate अलग स्पिन.
  5. आरएनए अलगाव प्रक्रिया पूर्ण रूप में RNAqueous माइक्रो किट में वर्णित है.
  6. प्रदर्शन DNase उपचार और LCM शाही सेना के रूप में किट में वर्णित नमूनों की DNase निष्क्रियता, RNase मुक्त एक ट्यूब और -80 पर दुकान डिग्री सेल्सियस के लिए शाही सेना हस्तांतरण

5. आरएनए मात्रा और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग

शाही सेना गुणवत्ता और मात्रा का ठहराव का आकलन एक Agilent Bioanalyzer पिको किट (टेक्नोलॉजीज, सांता क्लारा, CA) से अभिकर्मकों निर्माता प्रोटोकॉल के बाद का उपयोग करने के साथ किया जाता है.

  1. कुल शाही सेना एक Agilent 2100 Bioanalyzer (टेक्नोलॉजीज) पर विश्लेषण किया है. सॉफ्टवेयर और प्रत्येक नमूना लेकर च एक शाही सेना वफ़ादारी संख्या (Rin) बताए द्वारा आरएनए नमूना की अखंडता एकाग्रता का मूल्यांकनरॉम 1 से 10. 1-5 अपमानित शाही सेना को इंगित करता है और 7-10 अच्छी गुणवत्ता शाही सेना को इंगित करता है.
  2. व्यक्ति TaqMan assays या RT2 profiler arrays SYBR हरी रसायन शास्त्र का उपयोग, गैर अपमानित बरकरार आरएनए वास्तविक समय पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. आरएनए mRNA माइक्रोएरे विश्लेषण और microRNA माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है.

Representative Results

हमारी पहली LCM अध्ययन में, हम चूहे हिप्पोकैम्पस की कि कार्यात्मक अलग उपक्षेत्र (CA1 और CA3) दिखाने के लिए सक्षम थे जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल कि उनके TBI 8 चित्रा 1A-1C जोखिम को प्रतिबिंबित hippocampal पिरामिड न्यूरॉन्स की लेजर पर कब्जा से पता चलता है (CA1 CA3), दांतेदार गाइरस से पहले और LCM के बाद और न्यूरॉन्स SCN न्यूरॉन्स. साफ़ कब्जा पिरामिड ग्रेन्युल, या SCN न्यूरॉन्स, क्रमशः, मैक्रो टोपियां पर दिखाया जाता है चित्रा 2A-2B दिखाता Fluoro जेड सकारात्मक पिरामिड न्यूरॉन्स मर रहा है, और पहले और बाद में LCM, Fluoro जेड नकारात्मक पिरामिड न्यूरॉन्स जीवित. मरने या न्यूरॉन्स जीवित साफ कब्जा LCM टोपियां पर कब्जा कर लिया कोशिकाओं को देखने के द्वारा दिखाया गया है.

LCM के बाद, कुल आरएनए जीन की अभिव्यक्ति के मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण TaqMan या SYBR हरी chemistries (चित्रा 3A), छोटे केंद्रित का उपयोग सहित आणविक अध्ययन के एक विविध सरणी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैSYBR हरे (3B चित्रा) जांच या पूरे जीनोम माइक्रोएरे अध्ययन (चित्रा -3 सी) के साथ पीसीआर arrays sed.

चित्रा 1
चित्रा 1. लेजर चूहा मस्तिष्क से परिभाषित सेल आबादी के swaths कब्जा microdissection. जमे हुए चूहे के मस्तिष्क के 10 सुक्ष्ममापी राज्याभिषेक वर्गों इथेनॉल में तय कर रहे हैं, एक nissl (बैंगनी cresyl) दाग के साथ दाग और LCM लिए तैयार है. दिखाया hippocampal दांतेदार गाइरस में पहले और बाद में LCM और मैक्रो टोपियां पर कब्जा कर लिया visualized के रूप में कोशिकाओं चूहे हिप्पोकैम्पस के CA1 CA3 उपक्षेत्रों से ए पिरामिड न्यूरॉन्स. बी ग्रेन्युल कोशिकाओं चूहे हिप्पोकैम्पस और suprachiasmatic नाभिक की तस्वीरें हैं. सी. द्विपक्षीय suprachiasmatic नाभिक तीसरे निलय के दोनों तरफ स्थितकी और ऑप्टिक chiasma ऊपर स्थित है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. लेजर चूहे हिप्पोकैम्पस से एकल न्यूरॉन्स के कब्जा microdissection दिखाया गया है. ए degenerating, Fluoro जेड पॉजिटिव (दाग) hippocampal CA3 न्यूरॉन्स और बी सरवाइविंग, Fluoro जेड नकारात्मक (अस्थिर) CA3 न्यूरॉन्स से पहले और LCM के बाद कर रहे हैं. कब्जा कर लिया कोशिकाओं कल्पना कर रहे हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3 चित्रा 3. जीन कुल शाही सेना की अभिव्यक्ति विश्लेषण लेजर कब्जा न्यूरॉन्स से अलग है. ए मात्रात्मक SCN में वास्तविक समय पीसीआर circadian घड़ी जीन की अभिव्यक्ति के डेटा मर रहा है और जीवित hippocampal न्यूरॉन्स दिखा apoptosis से संबंधित ध्यान केंद्रित पीसीआर arrays का उपयोग जीन की अभिव्यक्ति में जीन की अभिव्यक्ति के बी हीटमैप सी. पूरे जीनोम जीन की अभिव्यक्ति के चूहों कि दिखावा चोट प्राप्त, TBI या TBI प्लस एक रीकॉम्बीनैंट siRNA एडिनो - जुड़े जीन की पछाड़ना अभिव्यक्ति मस्तिष्क चोट (neuronal नाइट्रिक ऑक्साइड से प्रेरित करने के लिए तैयार किए वायरस से hippocampal CA1 CA3 न्यूरॉन्स में माइक्रोएरे विश्लेषण Agilent synthase और glutathione peroxidase-1). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Discussion

इस LCM तकनीक हमें सक्षम है TBI के आणविक तंत्र को समझने में महत्वपूर्ण प्रगति कर 8,10,11,12,13 हम पहली बार इस तकनीक का उपयोग करने के लिए दिखाना है कि चूहे हिप्पोकैम्पस की अलग उपक्षेत्र जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल जांचकर्ताओं थे कि उनकी चोट के लिए चयनात्मक भेद्यता के साथ सहसंबंधी. हमारे अध्ययन से पता चला है कि हम जीन की अभिव्यक्ति यों qPCR द्वारा सकता है, के रूप में कुछ के रूप में 10 लेजर कब्जा कोशिकाओं से और है कि हम कम से कम 600 कोशिकाओं के रूप में कब्जा कर लिया से जीनोम चौड़ा माइक्रोएरे विश्लेषण प्रदर्शन कर सकता है. LCM अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों है कि विविध तंत्रिका विज्ञान और neuropsychiatric विकारों में फंसा हो जाना जाता है की इसी तरह के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण उपकरण होगा. उदाहरण के लिए, का उपयोग करते हुए अध्ययन LCM substantia nigra, 14 की dopamine न्यूरॉन्स में पार्किंसंस रोग के रोगजनन में प्रकाश डाला है और सहायता प्राप्त जीनोम चौड़ा नाभिक accumbens की रूपरेखा अध्ययन, जो इनाम एस में फंसा सर्किट में शामिल हैubstance सेवन विकारों. 15

Neuronal विजातिता जीनोम 16 स्तर पर परिलक्षित होता है और नैदानिक ​​परीक्षणों में TBI के लिए प्रयोगात्मक उपचार की सफलता की कमी के लिए योगदान कर सकते हैं. इस प्रकार, हमारे लक्ष्य के लिए इस तकनीक का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण TBI के बाद neuronal अस्तित्व को प्रभावित तत्वों की जांच की है. हमारे हाल के जीनोम चौड़ा मर रहा है और आसन्न TBI के बाद hippocampal न्यूरॉन्स जीवित की रूपरेखा अध्ययन का सुझाव दिया है कि एक सेलुलर रिओस्तात है कि कोशिका मृत्यु जीन सेल अस्तित्व की अभिव्यक्ति के स्तर के अनुपात को दर्शाता TBI के बाद सेल भाग्य को नियंत्रित. ये चल रही पढ़ाई और pharmacotherapeutic रणनीति है कि सकारात्मक सेल अस्तित्व रिओस्तात को प्रभावित कर सकते हैं के डिजाइन और विकास के लिए योगदान देगा. इसके अलावा, हम वर्तमान में LCM का उपयोग करने के लिए ट्रैक और TBI के बाद hippocampal न्यूरॉन्स में संभावित चिकित्सकीय दवा उपचार के प्रभाव की निगरानी. इस प्रकार, हमारे अध्ययन यह देखते हुए कि सावधान RNase मुक्त हैंडलिंग तकनीक और कुछ का प्रदर्शनमौजूदा प्रोटोकॉल के संशोधन, यह सटीक मात्रात्मक विश्लेषण जीन अभिव्यक्ति LCM से उच्च गुणवत्ता शाही सेना के नमूने प्राप्त करने के लिए संभव है.

लेकिन वहाँ कुछ LCM तकनीक के साथ जुड़े नुकसान कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, किसी भी microglia संदूषण के बिना केवल neuronal कोशिकाओं एकत्रित लगभग असंभव हो सकता है. हिप्पोकैम्पस के पिरामिड सेल परत में यह अनुमान लगाया गया है कि इस आबादी का 90% के साथ कोशिकाओं के 95% न्यूरॉन्स pyramidal कोशिकाओं और 10% interneurons glial और अन्य प्रकार की कोशिकाओं के एक छोटे प्रतिशत छोड़ने 8,17 हैं, 18 हमारे अध्ययन में हम Fluoro जेड एक फ्लोरोसेंट रंजक है कि विशेष रूप से मस्तिष्क के ऊतकों में ही घायल न्यूरॉन्स लेबल का उपयोग करें. एक अलग दाग कि GFAP के लिए एक मार्कर है microglia दाग करने के लिए आवश्यक हो सकता है 19 केवल Fluoro जेड दाग एकल neuronal निकायों एकत्रित न्यूरॉन्स की एक अधिक समरूप जनसंख्या सुनिश्चित होगा. एक अन्य आम समस्या है कि समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है कि एक चक्र नहीं हैटी परिभाषित जब लेजर निकाल दिया है. यदि ऐसा होता है, यह लेजर सेटिंग्स की जाँच के लिए और आवश्यक के रूप में शक्ति और अवधि को समायोजित करने के लिए आवश्यक है. इसके अलावा यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि टोपी फ्लैट ऊतक पर रखा जाता है और हाथ में सही ढंग से बैठा. LCM तकनीकी मैनुअल का हवाला देते हुए या तकनीकी सहायता बुला कभी कभी आवश्यक हो जाएगा. LCM और शाही सेना अलगाव के बाद, शाही सेना की गुणवत्ता हमेशा एक bioanalyzer का उपयोग कर किसी भी जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण करने से पहले मूल्यांकन किया जाना चाहिए.

वर्तमान में बाजार पर लेजर पर कब्जा उपकरणों के कई प्रकार के होते हैं लेजर (जीवन टेक्नोलॉजीज, Leica माइक्रोसिस्टम्स) काटने और लेजर उपकरणों (Zeiss) catapulting सहित. हमारे LCM प्रणाली कोशिकाओं के छोटे संख्या पर कब्जा करने के लिए अच्छी तरह से काम करता है. अन्य उच्च throughput और अधिक स्वचालित प्रणाली और विशेष रूप से प्रोटिओमिक जीनोमिक विश्लेषण के लिए बड़ा कोशिकाओं की संख्या प्राप्त करने के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है. दरअसल, इन स्वचालित प्रणाली का उपयोग LCM जनसंपर्क के विश्लेषण के लिए महान क्षमता हैपहचान की कोशिकाओं या कोशिकाओं के समृद्ध आबादी में otein अभिव्यक्ति 20. इसके अलावा, LCM जीन immunolabeled कोशिकाओं, 21 हमें परिभाषित प्रकार की कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए भले ही सबसे विषम ऊतकों में जटिलता की अनुमति की अभिव्यक्ति विश्लेषण की सुविधा कर सकते हैं. इस प्रकार, LCM कोशिकाओं के एकल या समृद्ध आबादी की अत्याधुनिक आणविक अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है.

Disclosures

लेखकों को घोषणा की कि वे ब्याज की कोई संघर्ष है.

Acknowledgments

यह काम R01 (HLH) NS052532, मूडी फाउंडेशन, और एनेस्थिसियोलॉजी विभाग द्वारा वित्त पोषित है. हम लॉरी बोल्ड, क्रिस्टीन Courteau बटलर और उनके संपादकीय सहायता के लिए क्रिस्टी पेरी, और लेआउट और सभी आंकड़े, टेबल, और कलाकृति के उत्कृष्ट उत्पादन के लिए पेरी क्रिस्टी धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PixCell IIe Laser Capture Microscope Life Technologies (Arcturus)
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies
RNAqueous Micro- Kit Life Technologies (Ambion) AM1931
Agilent 6000 Pico Kit Agilent Technologies 5067-1513
Capsure LCM caps Applied Biosystems LCM0211/LCM0214
Fluoro-Jade Histo-chem Inc. #1FJ
Cresyl Violet Acetate Sigma-aldrich C5042-10G
Xylene (Histological grade) Fisher Scientific X3P-1GAL
Ethanol 200 proof (Histological grade) UTMB pharmacy
RNase free barrier pipette tips Fisher Scientific 2123635, 212364, 212361, 21-236-2A
Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies)
Zeiss Laser Microdissection The PALM family
Leica Microsystems

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References

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Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (74), e50308, doi:10.3791/50308 (2013).

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