Summary
אנו מתארים כיצד להשתמש microdissection לכידת הליזר (LCM) להשיג אוכלוסיות מועשרות של נוירונים ביפוקמפוס או נוירונים בודדים מחלקים קפוא של מוח החולדה הפצועה לניתוח ביטוי גנים בעקבות שימוש בזמן PCR הריאלי כמוני ו / או microarrays כל הגנום.
Abstract
לקות קוגניטיבית לטווח ארוך לאחר TBI משויכת לניוון מוחיה הנגרם פגיעה ביפוקמפוס, האזור באונה הטמפורלית מדיאלית שהיא קריטי ללמידה, זיכרון ותפקוד ביצועי. 1,2 לכן המחקרים שלנו להתמקד בניתוח של ביטוי גנים עצביים ספציפי אוכלוסיות באזורי משנה שונים של ההיפוקמפוס. הטכניקה של לכידת microdissection הליזר (LCM), הציגה בשנת 1996 על ידי Emmert-באק, et al., 3 אפשרה להתקדמות משמעותית בניתוח ביטוי גנים של תאים בודדים והעשירה את האוכלוסיות של תאים מרקמות הטרוגניות כמו המוח של יונקים המכיל אלף סוגי תאים פונקציונליים. 4 אנו משתמשים LCM ומודל מבוסס היטב חולדה של פגיעה מוחית טראומטית (TBI) לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס פתוגנזה של TBI. בעקבות נוזל כלי קשה TBI, מוח מוסרים בזמנים שנקבעו מראש, שלאחר פציעה, הוקפא מייד בקרח יבש,ומוכן לחתך בcryostat. את מוח החולדה יכול להיות מוטבע באוקטובר ונותח באופן מיידי, או לאחסן כמה חודשים ב-80 ° C לפני החתך ללכידת microdissection ליזר. בנוסף, אנו משתמשים LCM כדי לחקור את ההשפעות של TBI במקצבי יממה. לשם כך, אנו ללכוד נוירונים מגרעיני suprachiasmatic המכילים את השעון הראשי של המוח של היונקים. הנה, אנחנו מדגימים את שימוש LCM להשיג נוירונים בודדים מזוהים (נפצע ומתנוונת,-Jade חיובי Fluoro, או ללא פגע,-Jade שלילי Fluoro) ואוכלוסיות מועשרות של נוירונים ביפוקמפוס לניתוח ביטוי גנים לאחר מכן על ידי הזמן האמיתי PCR ו / או microarrays שלם הגנום. מחקרי LCM המותאמים אלה חשפו כי הפגיעות סלקטיבית של אזורים אנטומית שונים של היפוקמפוס העכברוש משתקפות בפרופילי ביטוי הגנים השונים של אוכלוסיות שונות של תאי עצב המתקבלים על ידי LCM מהאזורים שונים אלה. התוצאות ממחקרי התא הבודד שלנו, שםאנו משווים את פרופילי תעתיק מיתה וצמודה לשרוד נוירונים ביפוקמפוס, מרמזים על קיומו של ריאוסטט הישרדות תא המווסת את המוות של תאים והישרדות לאחר TBI.
Introduction
ניתוח ביטוי גנים ברקמות הטרוגניות תמיד היה בעייתי;. זה נכון במיוחד במוח של היונקים, שבה יש כ -5,000 סוגי תאים שונים 4 לפני התפתחות microdissection ליזר הלכידה (LCM) טכניקה, המחקרים גנטיים של ההשפעות של TBI in vivo התבססו על ניתוח של ביטוי גנים באוכלוסייה מעורבת של תאי מוח המורכבים, לא רק של סוגי תאים עצביים שונים, אלא גם בתמיכה במערכת חיסונית ותאי גליה. את פרופילי ביטוי הגנים המורכבים הנובעים מתקבלים מרקמות הטרוגניות אלה, ואת הדפוסים המתנגשים התדירים של אותות סלולריים פציעה מושרה, עשויים להיות הסבר אחד לכישלון בניסויים קליניים בבני אדם של אסטרטגיות טיפוליות הוכח כיעיל במחקרים טרום קליניים של TBI. 5
כדי להשיג הבנה ברורה של ביטוי גני פגיעה הנגרם באוכלוסיות חלשות של נוירונים ממותן העכברושpocampus, אמץ את הטכניקה של LCM, שפורסם לראשונה על ידי Emmert-אק et al. 3 לאחר מכן, אנחנו שונים ומותאמים טכניקת microdissection זה ללכידה יעילה של אוכלוסיות מועשרות של נוירונים ונוירונים בודדים ליצירת פרופילי mRNA באמצעות PCR זמן אמיתי כמוני וניתוח microarray . כדי לשמור על היושרה של mRNA בסעיפים קפוא של רקמת מוח לניתוח גנומי, אנחנו שונים פרוטוקולים קיימים לתיקון, צביעה ולכידה מהירה של תאי עצב מחלקי מוח חולדה קפואות. לזיהוי ולבידוד של תאי עצב ביפוקמפוס פצועים וגוססים, אנחנו גם אופטימיזציה טכניקת צביעת Fluoro-Jade לLCM. Fluoro-Jade אינו מבחין בין מוות של תאים אפופטוטיים ונימקים. לפיכך, בכל סוגי תאי עצב מנוון יכולים להיות מזוהים על ידי כתם. 6,7 זה
כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול המשמש במעבדה שלנו כדי לקבל ברכות של נוירונים גוססים או ששרדו בודדים, כמו גם תלמים המועשר populatiתוספות של סוגי תאים עצביים ברורים (כלומר CA1-CA3 נוירונים לניתוח ביטוי גנים לאחר TBI). ההליך לפגיעה מוחית כלי קשה נוזל שבוצעה במעבדתנו מתואר בפירוט בShimamura et al., 8 והוא דומה מאוד לפרוטוקול פציעת רוחב נוזל כלי הקשה לעכברים שפורסמו ביופיטר ידי Alder et al. 9 מאז טכניקת LCM יש נראה שיש לי מינימאלית או ללא השפעה על היושרה של DNA, RNA וחלבון ברקמות, זה כלי מצוין לניתוח מולקולרי וחלבונים מסוגי תאים מוגדרים.
Protocol
1. ניתוחים וכלי קשה נוזל TBI
- כל הניסויים בבעלי החיים הם ראשון שאושרו על ידי בעלי החיים והטיפול המוסדי הוועדה השתמש באוניברסיטת טקסס רפואי סניף, גלווסטון, טקסס והמכונים הלאומיים לבריאות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (8 Edition, המועצה הלאומית למחקר).
- חולדות (ספראג-Dawley גבר בוגרים שחולדות, 400-500 גרמו מתקבלות מנהרות ספק צ'ארלס, פורטלנד, מיין) הם שוכנו שניים לכלוב, וספקו מזון ומים כרצונך בביבר עם תנאים קבועים הבאים: מחזור האור (600 שעות ל1800 שעות), טמפרטורה (21 ° C עד 23 ° C), ושבוע אחד לחות (40% עד 50%) לפני שימוש.
- הרדם עכברים עם 4% isoflurane, לצנרר, ולאוורר מכאניים (נמים מדעיים; אנגליה מכשירים רפואיים חדשים, דוואי, MA) בחולדות עם 1.5-2.0% isoflurane בחמצן: האוויר (70:30) ותכין אותם לנוזל כלי קשה parasagittal פגיעה כפי שתוארה לעיל. 8, 10
- להקריב את החולדות בנקודת הזמן המתאימה לאחר פציעה תלויה בעיצוב ניסיוני. מהירות להסיר מוחות, להקפיא באופן מיידי על קרח יבש, ולאחסן ב -80 ° C בצינור מ"ל 50 או להמשיך מייד להטבעה באוקטובר לחתך קפוא.
2. תבתר והכתמה של מוח חולדה
- רקמת המוח שאינו נמצאים בשימוש באופן מיידי יכולה להיות כל זמן ב-80 מעלות צלזיוס למשך עד חודש אם נשמר בטמפרטורה קבועה. המוחין שהם קפואים ב-80 ° C, אז מופשר ל -20 מעלות צלזיוס במשך חתך, ולאחר מכן מחדש קפוא לא יניבו RNA איכות לאחר ההפשרה שנייה. ברגע שהמוח מופשר, רכוב באוקטובר ונותח, שקופיות צריכות להיות מוכתמות בתוך 24 שעות ומשמשות לLCM בתוך 30 דקות לשעה אחת של הכתמה. זה יבטיח RNA באיכות טובה. בעקבות LCM, תאים שנתפסו על כובעי LCM ניתן לאחסן במאגר תמוגה ב-80 ° C עד שבוע אחד, אבל צריך להיות מבודד RNA באופן מסודר על מנת להבטיח את האיכות הגבוהה ביותר. </ Li>
- לפני חתך המוח, נגב cryostat עם RNase-Zap ומנקה את המכחולים עם ETOH (להחליף את הלהב חד הפעמי בין כל מוח).
- תחזר את המוח בצינור המ"ל 50 מ° C מקפיא -80; למקם אותו לתוך cryostat בטמפרטורה של -22 מעלות צלזיוס, והפשרה בצינור לכ 10 דקות. הסר את המוח מהצינור והמקום על הבמה בגזה, צד גחון למעלה.
- שימוש בסכין גילוח, פורס את המוח כדי להסיר את החלק האחורי של המוח פשוט המקורי למוח הקטן והחלק הקדמי בתצלובת האופטית. מלא cryomold עם מדיום הרכבת אוקטובר (הרקמות Tek), ולמקם את המוח לתוך התבנית עם הצד הקדמי כלפי מטה. אפשר להקפיא רקמת המוח בהרכבה הבינונית עד שהוא הופך לבן (כ 10 דקות).
- הקפא את דיסק הדגימה (הרקמות Tek) על המוח באוקטובר הסר את המוח מהעובש. הכנס את המוח לראש הדגימה ולהדק את הברגים.
- הכנס disposa, להב ble פרופיל הנמוך (הפישר סיינטיפיק) לתוך מחזיק הסכין ולהדק את הידית.
- בגין חיתוך המוח ב20 מיקרומטר להסיר את השכבה החיצונית של אוקטובר ברגע שאזור ההיפוקמפוס הוא הגיע, להגדיר חיוג מיקרון עד 10. איסוף חלקים סדרתיים עטרה ידי הצבת שקופית זכוכית או שקופיות בתוספת זכוכית על קטע הרקמה (הפישר סיינטיפיק). שקופיות נשמרות ב -20 ° C במתלה מכתימה RNase-חופשיה עד החתך הוא מלא.
- כדי להסיר את כל RNases מזכוכית שבו חלקי רקמת מעובד, לנגב את כל המכולות המכתימות וסיים עם גלילי Eliminase (הפישר סיינטיפיק) ולשטוף במים ש מילי. הכן את כל הפתרונים במי RNase חינם ולסנן הסגולים cresyl (סיגמא אולדריץ) וFluoro-ג'ייד (Histo-כימי) כתם עם 0.2 מיקרומטר לסנן לפני השימוש.
- להפשיר חלקי המוח בRT למשך 30 שניות ולתקן ב75% ETOH דקות (1).
- לLCM של תאי עצב פגוע בודד לאחר קיבוע, לשטוף שקופיות במי RNase חינם (דקות 1), Counterstain עם סגול cresyl 1% (15-20 שניות), לשטוף במי RNase חינם (2 × 30 שניות), עם כתם Fluoro-ג'ייד (4 דקות), לשטוף במי RNase חינם (3 × דקות 1), לייבש עם ETOH 95% עשויים ממים RNase חינם (30 שניות),% ETOH 100 (30 שניות), וקסילן (2 × 3 דקות).
- לLCM של אגודות של נוירונים לאחר קיבוע, לשטוף שקופיות במי RNase חינם (דקות 1), עם כתם סגול cresyl% 1 (דקות 1), לשטוף במי RNase חינם ל( 3 × דקות 1), לייבש עם 95% ETOH (2 × 30 שניות), 100% ETOH (2 × 30 שניות), וקסילן (2 × 3 דקות).
- אוויר יבש בכל החלקים מנדף למשך 15 דקות לפני LCM. שקופיות ניתן לאחסן, צדדים בסעיף למעלה, בשקופית תיבה מרופדת בdessicant, אם הם צריכים להיות מועברים מחדר לחדר. עם זאת, תוצאות אופטימליות מתקבלות אם LCM מתבצע מייד לאחר החלקים יבשים. LCM צריך להיות מוגבל מ30 דקות לשעה 1. בפרק הבא, יתארו תחילה כיצד לתפוס נתחים רציפים של תאים, אשר הם easiest לשלוט למי שלומדים את הטכניקה הזו. אז מתארים כיצד בדיוק כדי ללכוד תאי עצב בודדים. בנוהל שלנו, אנחנו מזהים נוירונים גוססים ידי זיקתם לFluoro-Jade-סמן של תאי עצב מנוון. תאים-Jade שליליים-Fluoro הונחו כלשרוד הנוירונים.
3. Microdissection לכידת הליזר (LCM)
LCM של אגודות של אוכלוסיות מועשרות של נוירונים ביפוקמפוס
- LCM מתבצע באמצעות מיקרוסקופ IIE PixCell עם דיודת ליזר אינפרא אדום (חי טכנולוגיות).
- התאם ג'ויסטיק המרכז למצב האנכי. לסובב ולנעול את מטרת 4X למקומו.
- הנח שקופית במרכז במת מיקרוסקופ ולשנות באופן ידני עד לאזור של ההיפוקמפוס הוא בתצוגה. השתמש בהתאמות להתמקד גסות ועדינות כדי להביא את התמונה אל מוקד.
- הפעל את צ'אק הוואקום על ידי לחיצה על כפתור הוואקום בבקר. לסובב ולנעול את מטרת 10X לתוך plאס. אתמקד שוב בהתאמות גסות ועדינות.
- טען CapSure מאקרו LCM הכיפות (חי טכנולוגיות) למודול CapSure הקלטת ועמדת כובע במיקום קו הטעינה. סובב את זרוע קאפ מיקום והמיקום סביב הכובע. הרם את זרוע השמת יתר כדי להסיר את כובע CapSure ממודול הקלטת.
- סובב את זרוע השמת יתר על השקופית ולהנמיך את הזרוע מעל השקופית; זה ימקם את הכובע לשקופית. התאם להתמקד בסדר ולהזיז את הג'ויסטיק כדי לבדוק אם תאים נמצאים בתוך העיגול השחור על הכובע. כל הלוכדת הסלולרית צריכה להיות בתוך העיגול השחור הזה.
- הגדר את פרמטרי הליזר. ראשית, לחץ על כפתור ליזר מאפשר בבקר. נקודת יעד הליזר תהיה גלויה כנקודה ורודה בשדה ראייה על צג המחשב.
- הגדר את גודל כתם ליזר לקטן (7.5 מיקרומטר) להתמקד הליזר ולהתאים את העצמה ומשך הזמן עד 65-75 mW, ל1.0-2.0 msec כצורך ללכוד תא אופטימלי.
- לטהרח הליזר, השתמש בג'ויסטיק כדי להזיז את נקודת הליזר לאזור שבו אין תאים להרים. אש הליזר באמצעות מתג האגודל. השתמש בג'ויסטיק כדי להזיז את נקודת הליזר בלבד מנקודת הפולימר המומסת ולבדוק אם טבעת כהה גלויה מקיפה אזור שבו ברור הליזר פוטר.
- כדי ללכוד תאים, השתמש בג'ויסטיק כדי להעביר את כתם הליזר על פני השטח של תאים ללכוד. אש הליזר באמצעות מתג האגודל. הזז את מוט ההיגוי בעת ירי הליזר כדי לתפוס שטח גדול של תאים. כאשר הליזר ירה הוא נמס סרט פולימר תרמופלסטי על כובע על פני השטח של תאי המטרה. הפולימר סופג את קרינת הליזר, ובכך שלא לשנות את רנ"א, דנ"א או החלבונים להבטיח את תקינותו של המדגם עבור יישומים מולקולריים עתידיים.
- לאחר שפטר את כל התאים של עניין, הרם את זרוע מיקום קאפ. התאים שנתפסו יפרידו מסעיף הרקמות ולדבוק בכובע CapSure. הרקמות והתאים שנותרו חסרים תהיינה מולניכר בו כלל בשדה הראייה. התאים בכובע גם ניתן לראות על ידי הצבת הכובע על חלק ריק של השקופית.
- הרם את זרוע השמת יתר ולסובב אותו לקאפ Unload תחנה. מנמיך את הכובע לתחנה ולסובב את זרוע מיקום קאפ חזרה למקומו הקודם.
- חלק את כלי החדרת CapSure לאורך הרציף ועל הכובע. הרם את הכלי מהפלטפורמה. הכובע יישאר מחובר. לגעת קל כובע למשטח הנקי CapSure לנקות את הרקמות לא רצויות.
- הנח את הכובע לתוך צינור 0.5 מ"ל RNase-חופשי מלאים עם 100 μl של חיץ תמוגה מתקבל מקיט RNAqueous מייקר הבידוד. מייד מערבולת הכובע למשך 30 שניות לlyse התאים. דגירת הדגימות ב 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות והקפאה ב-80 ° C עד בידוד RNA.
LCM של יחיד FJ + נוירונים ביפוקמפוס
- כדי ללכוד תאים בודדים, טען CapSure HS LCM כובעים למודול הקלטת CapSure וpositiבכובע במיקום קו הטעינה. סובב את זרוע השמת יתר ולמקם אותו סביב הכובע. הרם את זרוע השמת יתר כדי להסיר את כובע CapSure ממודול הקלטת.
- הגדר את גודל כתם הליזר לקטן (7.5 מיקרומטר) להתמקד הליזר ולהתאים את כוח הליזר והמשך עד 65 mW -75 ל0.45-0.50 אלפית עבור לכידת תא אופטימלית של תאים בודדים.
- סובב את זרוע השמת יתר על השקופית ולהנמיך את הזרוע כלפי מטה לכיוון השקופית. זה יהיה מקום הכובע על השקופית. משטח כובע CapSure HS יושב גבוה מהמדגם במהלך LCM.
- השתמש בג'ויסטיק כדי להזיז את הליזר על FJ + תאים בודדים. כל התאים שנתפסו חייבים להיות בתוך הטבעת השחורה הקטנה על המכסה. אש הליזר באמצעות מתג האגודל.
- כאשר כל התאים בתוך שטח העיגול השחור כבר ירו בליזר, הרם את זרוע מיקום קאפ. התאים שנתפסו יפרידו מסעיף הרקמות ולדבוק CapSure HS הכובע.
- הנח שקופית אחרת במייקרולהתמודד במה ולאסוף FJ + תאים עד כובע HS מלא. הנח את הכובע לתוך צינור 0.5 מ"ל RNase-חופשי מלא ב40-50 μl של חיץ תמוגה. מייד מערבולת הכובע למשך 30 שניות לlyse התאים. דגירת הדגימות ב 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות והקפאה ב-80 ° C עד בידוד RNA.
4. בידוד RNA סה"כ מדוגמאות LCM (סעיף זה יהיה רק להיות מתואר במצגת וידאו)
- רנ"א סך מתאים מבודד באמצעות ערכת RNAqueous-Micro (Ambion) בעקבות הפרוטוקולים של היצרן. כל ריאגנטים ופתרוני שטיפה מסופקים בערכה זו. ההרכבה טרום רטובת מייקר מסנן המחסנית על ידי הוספת 30 μl של חיץ פתרון תמוגה למסנן. לאחר 5 דקות, סרכזת המסנן למשך 30 שניות ב -10,000 × גרם.
- הוסף 3 μl של תוסף LCM לlysate המדגם, פיפטה לערבב, וצנטריפוגה.
- הוסף 52% μl של ETOH 100 (1/2 נפח) לlysate המדגם; פיפטה לערבב, ולהעביר lysate למסנןעמודה.
- צנטריפוגה עמודת המסנן ב -10,000 × גרם לדקה 1 כדי לאגד את הרנ"א לעמודה. אם יש פקקים מרובים עבור מדגם אחד, כל הספין lysate דרך אותה העמודה בנפרד.
- השלם את הליך בידוד RNA כמתואר בערכת מייקר RNAqueous.
- בצע DNase טיפול ואיון DNase של דגימות LCM RNA כמתואר בערכה, להעביר את הרנ"א לצינור RNase-חופשי ולאחסן ב -80 ° C.
5. כימות רנ"א ויישומי מורד
הערכה של איכות וכימות RNA מתבצעת עם Agilent Bioanalyzer באמצעות ריאגנטים מקיט הפיק (Agilent Technologies, סנט קלרה, קליפורניה) בעקבות הפרוטוקול של היצרן.
- סה"כ RNA הוא נתח בAgilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). התוכנה מעריכה את הריכוז ואת תקינותו של מדגם RNA ידי הקצאת מספר Integrity RNA (רין) לכל מדגם f נעrom 1 עד 10. 1-5 מציינים RNA המושפל ו7-10 מציינים RNA באיכות טובה.
- רנ"א השלם ללא מושפל ישמש בזמן האמת PCR; מבחנים בודדים TaqMan או RT2 מערכי Profiler באמצעות כימיה Sybr ירוקה. RNA יכול לשמש גם לניתוח microarray-mRNA וניתוח microarray microRNA.
Representative Results
במחקר LCM הראשון שלנו, הצליח להראות כי אזורי משנה ברורים תפקודיים (CA1 וCA3) של ההיפוקמפוס החולדה יש פרופילי ביטוי גנים המשקפים את פגיעותם לאיור 8 TBI. 1A-1C מראה לכידת ליזר של נוירונים ביפוקמפוס פירמידה (CA1- CA3), הנוירונים משוננים gyrus ונוירונים SCN לפני, ואחרי LCM. לוכד נקי של פירמידה, גרגר או נוירונים SCN, בהתאמה, מוצג על מכסי מאקרו. איור 2A-2B ממחיש גוסס, Fluoro-Jade עצב פירמידליים חיובי ולשרוד נוירונים, Fluoro-Jade שליליים פירמידליים לפני ואחרי LCM. הלכידה הנקיה של למות או לשרוד נוירונים מוצגת על ידי צפייה בתאים שנתפסו על כובעי LCM.
לאחר LCM, רנ"א כלל יכול לשמש למגוון רחב של מחקרים מולקולריים כוללים ניתוח כמוני בזמן אמת PCR של ביטוי גנים באמצעות chemistries הירוק SYBR (האיור 3A) TaqMan או, הקטן focused מערכי PCR עם בדיקות SYBR ירוקות (איור 3 ב ') או שלמים מחקרי microarray הגנום (האיור 3C).
איור 1. microdissection לכידת הליזר של אגודות של אוכלוסיות תאים מוגדרים ממוח החולדה. סעיפי 10 מיקרומטר עטרה קפואים של מוח החולדה קבוע באתנול, מוכתם בכתם (סגול cresyl) nissl כתם ומוכן לLCM. הראה תמונות של היפוקמפוס העכברוש וגרעין suprachiasmatic לפני ואחרי LCM ותאים שנתפסו כדמיין על כובעי מאקרו. נוירונים פירמידת א 'מתת תחומי CA1-CA3 של ההיפוקמפוס החולדה. תאי גרגיר B. ברכס המשונן ביפוקמפוס. גרעיני suprachiasmatic ג Bilateral ממוקמים בכל צד של החדר השלישיוממוקם מעל chiasma האופטי. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. microdissection ליזר לכידתו של נוירונים בודדים מהיפוקמפוס העכברוש. המוצגים הם א מתנוונת, (צבעוני) CA3 נוירונים ביפוקמפוס-Jade חיובי Fluoro וב 'שורד,-Jade שלילי Fluoro (כתם) CA3 נוירונים לפני ואחרי LCM. תאים שנתפסו הם דמיינו. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. ניתוח ביטוי גנים של רנ"א כלל מבודד מהנוירונים ליזר שנתפסו. נתונים כמותיים א בזמן אמת PCR של ביטוי גני שעון יממה בSCN. Heatmap ב 'של ביטוי גנים בגוססים ולשרוד נוירונים ביפוקמפוס מראים ביטוי של גנים הקשורים לאפופטוזיס באמצעות מערכי PCR ממוקדים . ג Agilent ניתוח microarray כל הגנום של ביטוי גנים בתאי עצב ביפוקמפוס CA1-CA3 מחולדות שקבלו פציעה מדומה, TBI או TBI בתוספת וירוס adeno הקשורים siRNA רקומביננטי נועד ביטוי מציאה של גנים הנגרם על ידי פגיעה מוחית (תחמוצת חנקן עצבית synthase וגלוטתיון פראוקסידאז-1). לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
Discussion
טכניקת LCM זו אפשרה לנו לבצע התקדמות משמעותית בהבנת המנגנונים המולקולריים של TBI. 8,10,11,12,13 היינו החוקרים הראשונים לנצל טכניקה זו כדי להוכיח כי אזורי משנה שונים של היפוקמפוס העכברוש יש פרופילי ביטוי גנים ה לתאם עם הפגיעות סלקטיבית שלהם לפציעה. המחקרים שלנו הראו שאנחנו יכולים לכמת ביטוי גנים, בqPCR, מכמה כמו 10 תאי ליזר שנתפסו ושאנחנו יכולים לבצע ניתוח microarray הגנום מכמה כמו 600 תאים שנתפסו. LCM יהיה כלי חשוב במחקרים דומים באזורים אחרים במוח שידוע כי הם יהיו מעורבים בהפרעות נוירולוגיות ונוירופסיכיאטריות מגוונות. לדוגמה, מחקרים באמצעות LCM שפכו אור בפתוגנזה של מחלת פרקינסון בנוירונים של דופאמין substantia nigra, 14 ונעזרו מחקרי הגנום כל אפיון של הגרעין הנסמך, העוסקים במעגלי תגמול מעורבים בזההפרעות ubstance 15 התעללות.
ההטרוגניות עצבית מתבטאת ברמת הגנום 16 ועשויות לתרום לחוסר הצלחה של טיפולים ניסיוניים לTBI בניסויים קליניים. לכן, המטרה שלנו היא לנצל את הטכניקה הזאת כדי לחקור את האלמנטים קריטיים המשפיעים על הישרדות תאי עצב לאחר TBI. המחקר האחרון שלנו הגנום הפרופיל של גסיסה וצמודה לשרוד נוירונים ביפוקמפוס לאחר TBI הציע שריאוסטט סלולרי המשקף את היחס בין רמות הביטוי של גנים להישרדות תא מוות של תאים מווסת גורל תא לאחר TBI. מחקרים מתמשכים אלו יתרמו לעיצוב והפיתוח של אסטרטגיות pharmacotherapeutic שיכול להשפיע באופן חיובי ריאוסטט הישרדות התא. יתר על כן, אנו משתמשים כיום LCM לעקוב ולנטר את ההשפעות של טיפולים תרופתיים טיפוליים פוטנציאליים בנוירונים ביפוקמפוס לאחר TBI. לכן, המחקרים שלנו מראים כי טכניקות שניתנו זהירות RNase ללא טיפול וכמהשינויים של פרוטוקולים קיימים, ניתן להשיג דגימות RNA איכות גבוהות מLCM לניתוח ביטוי מדויק כמו גן.
עם זאת יש כמה חסרונות הקשורים בטכניקות LCM. לדוגמה, איסוף רק תאים עצביים ללא כל זיהום המיקרוגליאה יכול להיות כמעט בלתי אפשרי. בשכבת תאי הפירמידה של ההיפוקמפוס זה כבר העריך כי 95% מתאי נוירונים עם 90% מאוכלוסייה זו כתאי פירמידה וinterneurons 10%, מותיר אחוז קטן של סוגי התאים גלייה ואחרים. 8,17, 18 במחקרים שלנו אנו משתמשים Fluoro-ירקן צבע פלואורסצנטי כי תוויות נוירונים נפגע רק ברקמת המוח באופן ספציפי. כתם שונה שמהווה סמן לGFAP יהיה צורך להכתים המיקרוגליאה. איסוף רק 19 הגופות העצביות הבודדות המוכתמות Fluoro-הירקן מבטיח אוכלוסייה הומוגנית יותר של תאי עצב. בעיה נפוצה נוספת שעשויה לדרוש פתרון בעיות היא שהמעגל הוא לאלא מוגדר כאשר הליזר הוא ירה. במקרה זה, יש צורך לבדוק את גדרות הליזר ולהתאים את העצמה והמשך במידת צורך. כמו כן חשוב לוודא שהכובע מונח שטוח על הרקמות וישובה בצורה נכונה בזרוע. בהתייחסו למדריך הטכני LCM או מתקשר לתמיכה טכנית יהיה לפעמים יהיה צורך. בעקבות LCM ובידוד RNA, את האיכות של RNA צריכה להיות תמיד הוערכה באמצעות bioanalyzer לפני כל ניתוח ביטוי גנים.
ישנם מספר סוגים של מכשירי ליזר ללכוד כיום בשוק, כולל חיתוך בליזר (חי טכנולוגיות, סאן יקה) וליזר catapulting מכשירים (Zeiss). מערכת LCM שלנו עובדת היטב עבור לכידת מספר קטן של תאים. מערכות תפוקה גבוהה יותר ואוטומטיות אחרות עשויות להיות מתאימות יותר להשגת מספר גדול יותר של תאים לניתוח גנומי ובמיוחד proteomic. אכן, LCM באמצעות המערכות האוטומטיות הללו יש פוטנציאל גדול לניתוח של יחסי הציבורביטוי otein בחוליות מזוהות או אוכלוסיות מועשרות של תאים. 20 יתר על כן, LCM יכול להקל על ניתוח ביטוי גנים של תאי immunolabeled, 21 מאפשרים לנו לחקור את ביטוי גנים בתאים מסוגים מוגדרים ללא תלות במורכבות ברקמות הטרוגניות ביותר. לפיכך, LCM הוא כלי מצוין למחקרים מולקולריים חדשניים של אוכלוסיות בודדות או מועשרות של תאים.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו ממומנת על ידי R01 NS052532 (לHLH), מודי הקרן, ומחלקת ההרדמה. אנו מודים לורי ולדינג, כריסטין Courteau אטלר וכריסטי פרי לסיוע העריכה שלהם, וכריסטי פרי לפריסה והפקה מצוינת של כל דמויות, השולחנות ועבודות האמנות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PixCell IIe Laser Capture Microscope | Life Technologies (Arcturus) | ||
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
| Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Capsure LCM caps | Applied Biosystems | LCM0211/LCM0214 | |
| Fluoro-Jade | Histo-chem Inc. | #1FJ | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma-aldrich | C5042-10G | |
| Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB pharmacy | ||
| RNase free barrier pipette tips | Fisher Scientific | 2123635, 212364, 212361, 21-236-2A | |
| Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies) Zeiss Laser Microdissection The PALM family Leica Microsystems |
|||
References
- Squire, L. R., Stark, C. E., Clark, R. E. The medial temporal lobe. Annual Review of Neuroscience. 27, 279-306 (2004).
- Bast, T. Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior. Rev. Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).
- Emmert-Buck, M. R., Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. From gene networks to brain networks. Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).
- Schouten, J. W. Neuroprotection in traumatic brain injury: a complex struggle against the biology of nature. Curr. Opin. Crit. Care. 13 (2), 134-142 (2007).
- Schmued, L. C., Albertson, C., Slikker, W. Fluoro-Jade: a novel fluorochrome for the sensitive and reliable histochemical localization of neuronal degeneration. Brain Research. 751 (1), 37-46 (1997).
- Ye, X., Carp, R. I., Schmued, L. C., Scallet, A. C. Fluoro-Jade and silver methods: application to the neuropathology of scrapie, a transmissible spongiform encephalopathy. Brain Res. Brain Res. Protoc. 8 (2), 104-112 (2001).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Mol. Brain Res. 17 (1), 47-61 (2004).
- Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice. J. Vis. Exp. (54), e3063 (2011).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., et al. Analysis of long-term gene expression in neurons of the hippocampal subfields following traumatic brain injury in rats. Neuroscience. 131 (1), 87-97 (2005).
- Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice. Exp. Gerontol. 41 (11), 1201-125 (2006).
- Hellmich, H. L., Garcia, J. M., et al. Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons. Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).
- Rojo, D. R., Prough, D. S., et al. Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury. PLoS One. 6 (8), e2311 (2011).
- Elstner, M., Morris, C. M., et al. Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson's disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death. Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).
- Chen, H., Liu, Z., et al. Genome-Wide Gene Expression Profiling of Nucleus Accumbens Neurons Projecting to Ventral Pallidum Using both Microarray and Transcriptome Sequencing. Front. Neurosci. 5, 98 (2011).
- Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Amaral, D. G., Ishizuka, N., Claiborne, B. Neurons, numbers and the hippocampal network. Prog. Brain Res. 83, 1-11 (1990).
- Zeng, Y. C., Bongrani, S., et al. Effect of long-term treatment with L-deprenyl on the age-dependent microanatomical changes in the rat hippocampus. Mech. Ageing Dev. 79 (2-3), 169-185 (1995).
- Schmued, L. C., Hopkins, K. J. Fluoro-Jade: novel fluorochromes for detecting toxicant-induced neuronal degeneration. Toxicol. Pathol. 28 (1), 91-99 (2000).
- Banks, R. E., Dunn, M. J., et al. The potential use of laser capture microdissection to selectively obtain distinct populations of cells for proteomic analysis-- preliminary findings. Electrophoresis. 20 (4-5), 689-700 (1999).
- Fend, F., Emmert-Buck, M. R., et al. Immuno-LCM: laser capture microdissection of immunostained frozen sections for mRNA analysis. Am. J. Pathol. 154 (1), 61-66 (1999).
