Summary
מאמר זה מתאר שיטת striaghforward ויעילה של intubating עכברים למדידת תפקוד הריאתי או החדרה ריאתי, שמאפשרת לעכברים להתאושש ולהיחקר בתקופות מאוחרות יותר. ההליך כרוך מקור אור סיב אופטי יקר שמאיר ישירות לקנה נשימה.
Abstract
הליך פשוט לצנרר עכברים למדידת תפקוד ריאתי הייתי כמה יתרונות במחקרים ארוכי טווח עם מספרים מוגבלים או בעלי חיים יקרים. אחת הסיבות לכך שזה לא נעשה באופן שגרתי יותר הוא שזה קשה יחסית, למרות שקיים מספר מחקרים שפורסם שמתארים דרכים להשגתה. במאמר זה אנו מדגימים הליך שמבטל אחד המכשולים העיקריים הקשורים באינטובציה זה, כי מלדמיין את קנה הנשימה במשך כל הזמן של אינטובציה. הגישה משתמשת במקור אור סיב אופטי 0.5 מ"מ המשמש כintroducer לכוון את הצינורית לקנה נשימת אינטובציה העכבר. אנחנו מראים שאפשר להשתמש בהליך זה כדי למדוד מכניקת ריאות בעכברים בודדים לאורך מסלול זמן של לפחות מספר שבועות. הטכניקה יכולה להיות מוגדרת עם חשבון ומומחיות יחסית קטנים, וזה יכול להיות באופן שגרתי הושג עם הכשרה מועטת יחסית. זה צריך MAKדואר מאפשר לכל מעבדה לשגרה לבצע אינטובציה זו, ובכך לאפשר מחקרים ארוכים טווח בעכברים בודדים, ובכך לצמצם את מספר העכברים הנדרשים ולהגדיל את הכח הסטטיסטי באמצעות כל עכבר כשליטה שלו.
Introduction
בשנת 1999, בראון ואח'. פרסם מאמר המתאר שיטה לאינטובציה של ריאת 1 עכבר. כגון טכניקה יש תועלת רבה בתפקוד הריאתי עושה חוזר או שטיפת רונכואלוואולרית בעכברים בודדים במחקרים ארוכי טווח 2. מאז אותו המאמר מקורי, יש כבר כמה עיתונים אחרים שתארו גישות שונות לאינטובציה העכבר 3-9. בעוד כל השיטות האלה יכולות לשמש בהצלחה, הם בדרך כלל דורשים הכשרה או בעלות ניכרת. אחד הנושאים העיקריים עם אינטובציה כזו היא שככל שמתקרבת לגישות צינורית אינטובציה החדרה ממתינה קנה הנשימה, הצינורית עוצמה חוסמת את האור ולכן ההדמיה של בו הוא צריך ללכת. לפיכך, ההכנסה הופכת לעיוורת בזמן הקריטי ביותר. במאמר זה אנו מראים כיצד פשוט וזולים למיגור בעיה להדמיה זו, ובכך להבטיח אינטובציה המוצלחת עם אימונים או מועטים יחסיתניסיון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה לנוהל
אחד צריך לקבל 1 ולהכין את הפריטים הבאים:
- קנולה. לאינטובציה של 20-35 עכברים גרמו, אנחנו משתמשים 1 אינץ או 1.5 ארוך, קטטר 20 המד הרביעי (BD Insylte, ניצוצות, MD או Jelco Optiva, קרלסבד, קליפורניה). קטטר סטרילי חדש יכול לשמש לכל עכבר, אבל גם צנתרים ניתן לעשות שימוש חוזר לאחר עיקור על ידי השרייה באתנול 70% בין הלילה. למרות שאף לא לוע קנה הנשימה של העכבר הוא נהלים סטריליים נאותים ניקיון, כולל שימוש בכפפות ומכשירים סטריליים, צריך להיות אחריו.
- כבל הסיב האופטי. אנו משתמשים ≈ 70 סנטימטר של כבל אופטי 0.5 מ"מ מאדמונד אופטיקה, אבל האורך הוא לא קריטי. חשוב לוודא סיבים יש מוחלק לקצה שלה, שכן לאחר חיתוך הכבל לאורך בתער, הקצה נשאר חד יחסית, וזה לא לוקח הרבה מאמץ כדי לחדור קיר של קנה הנשימה. עם זאת, זה אניקל מאוד להחליק קצה זאת על ידי לחיצה על סיבי 2 סנטימטר מקצה ואז עושה עיגולים קטנים לכמה שניות עם קצות הקצה לגעת בפיסת נייר 1000 לחרוק שמיר (ראה הדגמה בווידאו והאיור 1 של מקדונלד, et al. 10). הקצה השני מוחדר דרך פקק גומי. המטרה זו מושגת בקלות על ידי דחיפת 1 מחט 18-מד דרך הפקק, החדרת הסיב האופטי דרך קדח המחט, ואז משייכת המחט. פקק הגומי מחובר למקור אור הלוגן 150 ואט (למשל NCL-150, Volpi ארה"ב, או מכל מקור אחר, או אור, אפילו פחות מ 150 ואט). חשוב להקפיד להשתמש בפקק עשוי מגומי סיליקון (או חומר עמיד חום אחר), שכן גומי או פקק רגיל עלול לשרוף כשנמצאים כל כך קרוב למקור האור החם.
2. ביצוע אינטובציה
- ראה איורים 1 ו 2. הכנס כבל סיב אופטי לאhrough קטע קצר של צינור גומי סיליקון (≈ 0.8 המ"מ x 4 מ"מ מזהה OD, קול-פאלמר, EW-96410-13). לקשור את צינור הגומי הזה הדוק למדי, תוך מתן אפשרות לכבל הסיב האופטי להיות מותאם. החדרת צינורית סיליקון בנוחות בסוף luer של הצינורית פותרת את עמדת כבל הסיב האופטי בתוך הצינורית. להתאים את המיקום של כבל הסיב האופטי, כך שהוא מרחיב דרך צינורית ≈ 4 המ"מ מול קצה הצינורית.
- הנח את העכבר מורדם בתמיכה אנכית, הושעה על ידי השיניים החותכות העליונות שלו (איור 3). רוב החוקרים למצוא את ההדמיה הטובה ביותר עם הצד הגחוני של העכבר מול עצמם. מאוד בעדינות לשלוף את הלשון ולהחזיק באגודל ובאצבע מורה. האצבע האמצעית מונחת בין הצוואר וגוף פלסטיק. מתיחה על הלשון עם האצבע ואגודל משמשת כדי לפתוח את הפה, וליישר את דרך אינטובציה, את הזווית של הראש מותאמת עם האצבע האמצעית מאחורי הצווארמוצג באיור 3.
- באמצעות כבל הסיב האופטי כמקור אור והיכרויות, לדחוף אותו דרך מייתרי קול באופן חזותי. אם את המייתרים אינם גלויים, משוך בעדינות קשה על הלשון בעזרת אצבע האמצעית כתמיכה. כאשר הוכנס, לקדם את צינורית ≈ 5 מ"מ נוסף. ואז, נזהר מאוד שלא להעביר את הצינורית, לשלוף כבל הסיב האופטי. לשקר העכבר למטה ולאבטח את הצינורית עם חתיכת הסרט ולתמוך רכזת הצינורית על פיסת פלסטלינה (פלסטלינה), כפי שמוצג באיור 4.
- ההליך בשלב 3 לא יכול להיות הפגין בקלות או אפילו למד, שכן הוא במבצע סולו. עם זאת, על ידי התאמות עדינות של המתיחה על הלשון והתמיכה מאחורי הראש כמעט כל מי שינסה את זה בקרוב תמצא את הדרך הנכונה למצב את העכבר כדי להמחיש את מייתרי קול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כהערכה של השיטה, השתמש ארבעה עכברי BALB / ג גבריים בן 20 בשבוע עם משקל ממוצע (± SEM) של 27.7 ± 0.40 גרם. הם למדו על חמישה שבועות רצופים, בי התנגדות הריאות נמדדה תוך שימוש במערכת כפי שתוארה קודם לכן 11. כל עכבר היה מורדם עם קטמין (100 מיקרוגרם / g BW) וxylazine (15 מיקרוגרם / g BW) בתמיסת מלח בהזרקת ה-IP. אז הם מחוברים לצינורות כמתוארים לעיל. אם יש ספק כלשהו אם הצינורית היא בקנה הנשימה ולא בוושט, זה יכול להיות מאומת באמצעות מראה שיניים קטן. שמור על המראה במקפיא, וכאשר יש צורך במקום מול רכזת luer של קטטר. אם הצנתר הוא בקנה הנשימה, נשימת הנשף תהווה מעובה נראה במראה.
לאחר אינטובציה, אנחנו מחוברים אז את העכברים להנשמה והתנגדות ריאות נמדדת העכברים מאווררים עם שיעור של 2 הרץ ונפח של 0.2 מיליליטר גאות, והתנגדות בדרכי נשימה tance נמדד על ידי שיטת חסימת השאיפה כפי שתואר קודם לכן 11. איור 5 מראה 5 מדידות שבועיות בכל אחד 4 עכברים. שחזור הוא מצוין, שהראה כי, לפחות במרווחים שבועיים, אין השפעת המדידה המוקדמת. זה עולה בקנה אחד עם הערכות שבועיות שדווחו בעבר של מכניקה ופרופילים סלולריים BAL בעכברים בודדים BALB / ג עם הליך קשה יותר ופוטנציאל טראומטי 2.
איור 1. פריטי תמונה מראים המשמשים לאינטובציה. כבל הסיב האופטי מוצג מוכנס לתוך פקק גומי סיליקון, עם חתיכה קטנה של צינור גומי סיליקון הקשורה ליד הקצה השני. פקק גומי סיליקון מחובר למקור האור, כפי שמוצג באיור 2.
איור 2. תמונה מראה פקק גומי מחובר למקור אור בקצה שני של כבל סיב האופטי המוחדר דרך צינורית אינטובציה. תמיכה פשוט לעמוד להחזיק את העכבר במהלך אינטובציה מוצגת גם בצד השמאל.
איור 3. שתי נקודתי מבט המראה את מיקומו של עכבר הכין עבור אינטובציה.
איור 4. נתון זה מראה עכבר מוכן לאוורור מונשם. הקלטת סביב הפה מסייעת לשמור על הצינורית ממנה לזוז. פיסה קטנה של פלסטלינה (פלסטלינה) מספקת מנוחה נוחה כדי לאבטח את רכזת הצינורית לחיבור למכונת ההנשמה.
איור 5. התנגדות ריאות מכל 4 עכברים (בצבעים שונים) נמדדה ב5 מרווחים שבועיים.
איור 6. הראה ששיא תרשים של לחץ דרך נשימה בעכבר מונשם אחד לאחר זריקות של 0.5, 0.75, ו 1 מ"ל. כל כרך נערך לשניות 20-40, לאחר מכן שוחרר לפני כן האינפלציה הבאה. למרות שעשוי להיות דליפה איטית מאוד לאחר התאוששות הרפית המתח, זה יהיה השפעה זניחה על אוורור או הערכה של תפקוד הריאתי מדידות דינמיות נורמלי. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההליך המתואר כאן יש מספר יתרונות. ראשית המנגנון הוא פשוט וזול יחסית .. הייצור של המכשיר אינו דורש שום כלים מיוחדים או ציוד יקר. השימוש בקטטר שמציג גם הוא מקור האור אומר שלעולם אינו רואה את פתיחת קנה הנשימה כintroducer מתקרב פתיחת קנה הנשימה. השימוש בintroducer 0.5 מ"מ משמש גם כדי למזער את הטראומה שעלולה להתרחש עם כניסה ראשונית של צינורית רחבה יותר. נשי לב שבדיקה אופטית דומה זמינה מספק מסחרי (Braintree Scientific, Braintree, MA). המכשיר שלהם משתמש במקור אור על מצברים וסיבים אופטיים.
בעבודה הנוכחית, שבדקנו את ההליך עם מדידה חוזרת של מכניקת ריאות, אבל אינטובציה כזה באותה קלות יכולה לשמש כדי להחדיר כימיקלים או תאים לריאות, כפי שכבר תארה למסירה חוזרת של 12 LPS. בנוסף,דו"ח מוקדם עם הליך אינטובציה פרימיטיבית יותר תאר את היכולת לעשות BAL חזר בעכברים בודדים 2, וזה יהיה הרבה יותר פשוט בצע עם גישת אינטובציה החדשה.
בפועל, השיטה המתוארת כאן כבר למד בקלות לעמיתים, סטודנטים וטכנאים, שמעולם לא ניסו אינטובציה. למעשה, במהלך אימוני קבוצה, חלק מהתלמידים להיות בקיא מספיק אז ללמד חלק מהתלמידים האחרים שעוד לא ניסו את זה עדיין. שיטה זו ובכך יש יתרון משמעותי כפי שהוא מצמצם את מספר העכברים דרושים לאימון ואמור לאפשר פגיעה מינימאלית במחקרים חוזרים ונשנים.
בעושה אינטובציה, יש כמה עניינים מעשיים שיש לדווח עליהן. חשוב להיות עדין ככל האפשר עם הנסיגה של הלשון בפתיחה הראשונית של הפה. אם מלקחיים מוגנים משמשים זה קל לפגוע בלשון, וזה יכול לאהד למותו של העכבר. ללמוד קודם איך לעשות אינטובציה, דבר החשוב ביותר הוא שימוש באצבע מאחורי הצוואר כדי להתאים את הזווית של הראש כדי לאפשר הדמיה של פתיחת קנה הנשימה. כאשר נעשה בצורה נכונה, עם מתיחה מספיק על הלשון, מייתרי הקול יכולים בקלות לראות. זהו צעד ראשוני זו הדמיה שבדרך כלל דורש זמן הרב ביותר, שכן ברגע פתיחת קנה הנשימה הוא ראה, זה פשוט יחסית להכניס את כבל הסיב וקטטר תוך ורידים. בתחילה אם יש בעיה עם הדמיה זו, המתאמן הוא לעתים קרובות לא מושך בלשון, בכוח רב. הגדלת משיכה זה מעט תסדר את נתיב ההדמיה כך שניתן לראות את מייתרי קול. Hamacher, et al., תאר מערכת אינטובציה ייחודית עם 4 להדמיה מיקרוסקופיות. הווידאו המקוון שלהם של אינטובציה זה הוא מצוין ומאוד מאלף, למרות האמצעים של מיצוב הראש והצוואר הוא לא לגמרי ברור מvidאיו ודמות. בעוד המערכת הם מתארים נראה לעבוד בצורה יעילה מאוד, זה דורש מיקרוסקופ ייעודי. שימוש במערכת וההליך שאנו מתארים, מייתרי קול וקנה נשימת הפתיחה ניתן לראות בעין בלתי מזוינת. בתיאור המקורי שלנו של שיטה 10 זה, תארנו הליך להוסיף חרוט לצינורית אינטובציה. זה טריזי קונוס לתוך לוע העכבר הצר ומונע מהצינורית מוחדרת עמוק מדי. אנחנו גילינו שפלח זה הוא שימושי בהוראת סטודנטי ההליך, שכן הוא מאוד קל להכניס את הצינורית לקארינה או מעבר, אולי חודר דרך קיר דרכי נשימה. הוראות פשוטות כדי להמציא הטריז ניתן למצוא שבנייר. עם זאת, ברגע שמישהו לומד את ההליך מספיק טוב והיכן להציב את הצינורית, התאמה זו אינה נחוצה עוד.
לבסוף, יש לציין כי יש לנו נבדקנו בהליך זה רק עם 20 גרם צינורית בעכברים בוגרים צעירים של כמה זנים. במצב זה, יש לנו תוקף שקנה הנשימה ומייתרי קול יכולים לספק חותם טוב סביב הצינורית עם לחצי אוורור רגילים, כלומר יש את דליפת אוויר מינימאלית של הריאות עם אוורור מכאני. איור 6 מציג תוצאות מcannulation ב עכבר C57BL / 6, שבו 3 פיתיונות מיובשים אוויר גובר (0.5, 0.75, ומ"ל 1) שמשו כדי לנפח את הריאות. זה ברור מנתון זה מהדלפות לחץ הן מינימאליות ללחץ נתיב אוויר של לפחות 15 CMH 2 O. עם זאת, אם משתמש באופן משמעותי צעירים יותר או מבוגרים יותר, או עכברי עכברים מזנים בעלי אנטומיה ריאה אחרת, ואז זה יהיה חכם כדי לאשר שיש דליפה מינימאלית. אם יש, אז ההליך עשוי לחייב שימוש בצינורית בגדלים שונה.
לסיכום, הליך אינטובציה מתאר כאן הוא זול לפברק ופשוט לשימוש, ואת זה צריך לאפשר רוב החוקרים וטכנאי מעבדה כדי ללמוד במהירות להצלחהלצנרר עכברים עם ניסיון מועט יחסית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אף אחד מהמחברים יש ניגודי עניינים כדי לגלות.
Acknowledgments
נתמך על ידי NIH HL-10342.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intubation cannula | BD Insylte, Sparks, MD or Jelco Optiva, Carlsbad, CA | 1-in.-long, 20-gauge intravenous (IV) catheter | |
| Fiber-optic cable | Edmund Optics, Barrington, NJ | #NT02-542 | Approximately 2-ft length of 0.5-mm optical fiber (Communication grade plastic fiber). The edge of the fiber end that is inserted into the trachea should be gently rounded by holding the fiber ≈2 cm from the end and then making small circles while dragging the tip for a few seconds on 1,000-grit emory paper. |
| Light Source | Volpi | NCL-150 | Although we use a 150-W halogen light source, any equivalent light source, even with much lower wattage can be used. |
| Aluminum tube | One inch O.D., with 1/16 inch wall. This may need to be change to fit whichever light source is used. | ||
| Rubber stopper | A #4 rubber stopper fits the 1 inch tube. | ||
| Small silicone rubber tube | Cole-Palmer | EW-96410-13 | A ≈1.5 cm piece of silicone rubber tubing (0.8 inner diameter, 4 mm outer diameter) |
| Angled support stand | Ours is constucted from plexiglass, but any material to which a thread or wire can be affixed to hold the mouse at an almost vertical angle can be use. |
References
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J. Appl. Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
- Walters, D. M., Wills-Karp, M., Mitzner, W. Assessment of cellular profile and lung function with repeated bronchoalveolar lavage in individual mice. Physiol. Genomics. 2, 29-36 (2000).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science / American Association for Laboratory Animal Science. 44, 52-55 (2005).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42, 222-230 (2008).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory Animals. 41, 128-135 (2007).
- Zhao, X., et al. A technique for retrograde intubation in mice. Lab Animal. 35, 39-42 (2006).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 8, 103-106 (2004).
- Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G. Video-assisted orotracheal intubation in mice. Laboratory Animals. 37, 204-206 (2003).
- Hastings, R. H., Summers-Torres, D. Direct Laryngoscopy in Mice. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science / American Association for Laboratory Animal Science. 38, 33-35 (1999).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J. Appl. Physiol. 106, 984-987 (2009).
- Ewart, S. L., Levitt, R. C., Mitzner, W. Respiratory system mechanics in mice measured by end-inflation occlusion. Journal of Applied Physiology. 79, 560-566 (1995).
- MacDonald, K. D., McKenzie, K. R., Mitzner, W., Zeitlin, P. L. Lung Mechanics in Heterozygous CF Mice after Repeated LPS Dosing. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 175 (4), A930 (2007).
