En simpel metode til Mouse Lung Intubation

Summary

Denne afhandling beskriver et striaghforward og effektiv metode til intuberende mus for lungefunktionen målinger eller pulmonal instillation, der gør det muligt for musene at restituere sig og blive undersøgt på senere tidspunkter. Denne procedure indebærer en billig fiberoptiske lyskilde, der direkte belyser luftrøret.

Abstract

En simpel procedure at intubere mus for lungefunktionen målinger har flere fordele i forløbsundersøgelser med begrænsede numre eller dyre dyr. En af grundene til, at dette ikke er gjort mere rutinemæssigt, er, at det er forholdsvis svært, selv om der var adskillige offentliggjorte undersøgelser, der beskriver måder at opnå det. I denne rapport viser en procedure, der fjerner en af ​​de største hindringer forbundet med denne intubation, at visualisere luftrøret under hele tiden af ​​intubation. Den fremgangsmåde anvender en 0,5 mm fiberoptisk lyskilde, der fungerer som en indfører til at lede intubationskanyle i musen trachea. Vi viser, at det er muligt at anvende denne procedure til at måle lunge mekanik i individuelle mus i et tidsforløb på mindst flere uger. Teknikken kan sættes op med en relativt lille omkostning og ekspertise, og det kan rutinemæssigt udføres med en relativt lille træning. Det bør MAKE det muligt for alle laboratorier til rutinemæssig udføre denne intubation, hvorved forløbsundersøgelser i individuelle mus, hvilket minimerer antallet af nødvendige mus og forøgelse af statistisk styrke ved at anvende hver mus som sin egen kontrol.

Introduction

I 1999 publicerede Brown et al. Et dokument, der beskriver en fremgangsmåde til intubation af muselunge ^1. En sådan teknik har stor nytte i at gøre gentag lungefunktion eller bronkoalveolær udskylning i individuelle mus i longitudinelle studier ^2. Siden den oprindelige papir, har der været flere andre papirer, der har beskrevet forskellige tilgange til mus intubation ^3-9. Mens alle disse fremgangsmåder kan anvendes med succes, de normalt kræver betydelig træning og omkostning. Et af de vigtigste spørgsmål med en sådan intubation er, at når intubationskanyle tilgange nærmer luftrøret indtil indsættelsen, kanylen selv blokerer lyset og dermed visualisering af, hvor det skal gå. Således indsættelsen bliver blind på det mest kritiske tidspunkt. I dette papir vi vise, hvordan man enkelt og billigt fjerne denne visualisering problem for derved at sikre en vellykket intubation med relativt lidt uddannelse ellererfaringer.

Protocol

1. Forberedelse til Procedure

Man skal først indhente og forberede de følgende punkter:

1. Kanylen. Til intubation på 20-35 g mus, bruger vi et 1 eller 1,5 tommer lang, 20 gauge IV kateter (BD Insylte, Sparks, MD eller Jelco Optiva, Carlsbad, CA). Et nyt sterilt kateter kan bruges til hver mus, men katetre kan også genanvendes efter sterilisation ved iblødsætning i 70% ethanol natten over. Selv om hverken svælget eller luftrør af musen er sterile ordentlig renlighed procedurer, herunder anvendelse af sterile handsker og instrumenter, bør følges.
2. Det fiberoptiske kabel. Vi bruger ≈ 70 cm af 0,5 mm optisk kabel fra Edmund Optics, men længden er ikke kritisk. Det er vigtigt at sørge for fiberen har sin kant glattet, da efter opskæring kablet til længde med en barbermaskine, er kanten efterlades relativt skarp, og det tager ikke mange kræfter på at gennembore den tracheal væg. Men det ier meget let at udjævne denne kant ved at holde fiberen omkring 2 cm fra enden og derefter foretage små cirkler i nogle sekunder med kanterne af spidsen røre et stykke på 1000 grit smergellærred (se demonstration video og figur 1 i Macdonald et al. ^10). Den anden ende indsættes gennem en gummiprop. Dette opnås lettest ved først at skubbe en 18-gauge nål gennem proppen, indsætte den optiske fiber gennem nålen boringen, så nålen trækkes ud. Gummiproppen er forbundet med en 150 watt halogenlampe lyskilde (f.eks NCL-150, Volpi USA, eller en anden eller lyskilde, endda mindre end 150 watt). Det er vigtigt at sørge for at bruge en prop lavet af silikone gummi (eller et andet varmeresistent materiale), da almindelig gummi eller kork kan brænde når den er placeret så tæt på den varme lyskilde.

2. Udførelse af Intubation

1. Se figur 1 og 2.. Indsæt fiberoptisk kabel through et kort stykke af siliconegummi rør (≈ 0,8 mm ID x 4 mm OD, Cole-Palmer, EW-96410-13). Binde denne gummislange temmelig stramt, mens det stadig tillader det fiberoptiske kabel, der skal justeres. Indsættelse af silikoneslanger stramt i Luer ende af kanylen fastsætter det fiberoptiske kabel position inde i kanylen. Justere positionen af ​​det fiberoptiske kabel, så den strækker sig gennem kanylen ≈ 4 mm foran kanylens spids.
2. Placer bedøvede mus på en lodret støtte, suspenderet ved dens øvre fortænder (figur 3). De fleste forskere finder den bedste visualisering med den ventrale side af musen mod sig selv. Meget forsigtigt trække ud tungen og holder med tommel-og pegefinger. Den midterste finger er anbragt mellem hals og plastunderlag. Trækkraft på tungen med pegefingeren og tommelfingeren anvendes til at åbne munden, og at rette intubation bane, er vinklen af ​​hovedet justeret med den midterste finger bag nakkenvist i figur 3.
3. Brug af fiberoptiske kabel som en lyskilde og introducerende, presse det igennem de visualiserede stemmebånd. Hvis kablerne ikke er synlige, skal du forsigtigt trække hårdere på tungen med langfingeren som støtte. Når den er indsat, fremme kanylen ≈ 5 mm yderligere. Så at være meget omhyggelig med ikke at flytte kanylen, trække fiberoptiske kabel. Ligge musen ned og fastgøre kanylen med et stykke tape og støtte kanylen navet på et stykke Modellervoks (modellerleret), som vist i figur 4.
4. Proceduren i trin 3 kan ikke let lært eller endog påvist, da det er en solo operation. Men ved subtile justeringer af trækkraft på tungen og støtte bag hovedet næsten alle, der forsøger dette snart finde den rigtige måde at placere musen til at visualisere stemmebånd.

Representative Results

Som en vurdering af den metode, anvendte vi fire 20 uger gamle BALB / c-mus med en gennemsnitlig vægt (± SEM) på 27,7 ± 0,40 g. De blev undersøgt på fem på hinanden følgende uger, hvor lungemodstand blev målt ved anvendelse af et system som tidligere beskrevet ^11. Hver mus blev bedøvet med ketamin (100 ug / g BW) og xylazin (15 ug / g BW) i saltvand via IP injektion. De blev derefter intuberet som beskrevet ovenfor. Hvis der er nogen tvivl om, hvorvidt kanylen er i luftrøret og ikke i spiserøret, kan dette blive valideret med en lille tand spejl. Hold spejlet i en fryser, og når det er nødvendigt sted foran Luer hub af kateteret. Hvis kateteret er i luftrøret, vil den udåndede luft danner en synlig kondensat på spejlet.

Efter intubation, er vi forbundet musene til ventilatoren og målte lungemodstand Musene blev ventileret med en hastighed på 2 Hz og tidal volumen på 0,2 ml, og respiratorisk resi ningen blev målt ved inspiratoriske okklusion metoden som tidligere beskrevet ^11. Figur 5 viser fem ugentlige målinger i hver af de 4 mus. Reproducerbarheden er fremragende, viser, at i det mindste med ugentlige intervaller, er der ingen virkning af den forudgående måling. Dette er i overensstemmelse med tidligere rapporterede ugentlige vurderinger af mekanik og BAL celle profiler i de enkelte BALB / c mus med en mere vanskelig og potentielt traumatisk procedure ^2.

Figur 1. Billede, der viser elementer, der anvendes til intubation. Det fiberoptiske kabel er vist indsat i en siliconegummi prop, med et lille stykke af siliconegummi rør bundet nær den modsatte ende. En siliconegummi prop er fastgjort til lyskilden, som vist i figur 2.

">
Figur 2. Billedet viser gummiprop forbundet til lyskilde med anden ende af det fiberoptiske kabel indsættes gennem intubationsrør. En simpel støttebenet at holde musen under intubering er også vist til venstre.

Figur 3. To perspektiver viser placeringen af musen klargjort til intubation.

Figur 4. Denne figur viser en intuberet mus klar til ventilation. Båndet omkring munden hjælper med at holde kanylen i at bevæge sig. Et lille stykke Modellervoks (modellerleret) tilvejebringer en bekvem hvile at fastgøre kanylen hub til forbindelse til ventilatoren.

NDHOLDET "fo: keep-together.within-page =" altid ">
Figur 5. Lungemodstand fra hver af 4 mus (i forskellige farver) målt ved 5 ugentlige intervaller.

Figur 6. Vist er et diagram referat af luftvejstryk i en intuberet mus efter injektioner af 0,5, 0,75, og 1 ml. Hvert bind blev afholdt for 20-40 sec, derefter frigivet før derefter næste inflation. Selv om der kan være en meget langsom læk efter stress afslapning opsving, vil dette have ubetydelig effekt på normal ventilation eller vurdering af dynamiske lungefunktionen målinger. Klik her for at se større figur .

Discussion

Fremgangsmåden beskrevet her, har adskillige fordele. Først apparatet er enkel og relativt billig .. Fremstillingen af ​​apparatet kræver ingen specielle værktøjer eller dyrt udstyr. Anvendelsen af ​​et kateter indføres der også er lyskilden betyder, at man aldrig glemmer den tracheale åbning som indføreren nærmer sig den tracheale åbning. Anvendelse af en 0,5 mm indføringsorganet også tjener til at minimere traumer, der kan forekomme med en første insertion af et større kanyle. Vi bemærker her, at en lignende optisk sonde er tilgængelig fra en kommerciel leverandør (Braintree Scientific, Braintree, MA). Deres enhed bruger en batteridrevet lyskilde og optisk fiber.

I det foreliggende arbejde, testede vi proceduren med gentagen måling af lunge mekanik, men en sådan intubation lige så godt anvendes til at indpode kemikalier eller celler ind i lungen, som er blevet beskrevet til gentagen afgivelse af LPS ^12. Endvidere er enforudgående rapport med en mere primitiv intubation beskrevet evnen til at gøre gentagen BAL i individuelle mus ^2, og det ville være meget mere simpelt opnået med den nye intubation fremgangsmåde.

I praksis har den her beskrevne fremgangsmåde er blevet let lært at stipendiater, studerende og teknikere, der aldrig havde forsøgt intubation. I virkeligheden, i gruppe træning nogle af de studerende bliver tilstrækkeligt dygtige til så lære nogle af de andre studerende, der endnu ikke havde prøvet det. Denne fremgangsmåde har således en betydelig fordel, da det minimerer antallet af mus, der er nødvendige til og være så minimal skade i gentagne forsøg.

Ved at gøre det intubation, er der flere praktiske spørgsmål, som bør nævnes. Det er vigtigt at være så skånsom som muligt med tilbagetrækning af tungen i den indledende åbning af munden. Hvis ubeskyttede pincet anvendes, er det let at såre tungen, og dette kan Lead ihjel af musen. I første lære at gøre det intubation, er det vigtigste anvendelse af fingeren bag nakken for at justere vinklen af ​​hovedet for at muliggøre visualisering af tracheale åbning. Når det gøres korrekt, med tilstrækkelig trækkraft på tungen, kan stemmebånd let ses. Det er denne første visualisering trin, der sædvanligvis kræver mest tid, for når først den tracheale åbning ses, er det relativt enkelt at indsætte fiberkabel og intravenøst ​​kateter. I første omgang, hvis der er et problem med denne visualisering, bliver eleven ofte ikke trække på tungen med tilstrækkelig kraft. Forøgelse denne pull lidt vil rette visualisering vej, så stemmebåndene kan ses. Hamacher, et al. Beskrives et unikt intubation system med mikroskopisk visualisering ^4. Deres online video af denne intubation er fremragende og meget lærerigt, selvom midlerne til at placere hoved og hals ikke er helt klart af den vidEO og fig. Mens systemet de beskriver synes at fungere meget effektivt, kræver en målrettet mikroskop. Brug af systemet og procedure beskriver vi, stemmebånd og luftrør åbning kan ses med det blotte øje. I vores oprindelige beskrivelse af denne metode ^10, beskrev vi en fremgangsmåde til at tilføje en kegle til intubationsrør. Denne membran kiler ind i smalle mus svælg og forhindrer kanylen i at blive indsat for dybt. Det har vist sig, at denne kile er nyttig undervise studerende proceduren, da det er meget nemt at indsætte kanylen til carina eller ud, eventuelt trænger gennem en luftvej væg. Enkle instruktioner til at fabrikere kilen kan findes i dette dokument. Men når først der lærer fremgangsmåden tilstrækkeligt godt, og hvor at placere kanylen, er denne tilpasning ikke længere nødvendig.

Endelig skal vi bemærke, at vi kun har testet denne procedure med 20 g kanyle i unge voksne mus af et par stammer. I denne situation, har vi bekræftet, at luftrøret og stemmebånd kan tilvejebringe en meget god tætning omkring kanylen med normale ventilation tryk, dvs at der er minimal luftgennemstrømning ud af lungen med mekanisk ventilation. Figur 6 viser resultater fra den kanylering i en C57BL / 6 mus, hvor 3 stigende luft boli (0,5, 0,75 og 1 ml) blev anvendt til at puste lungerne. Det fremgår af denne figur end tryklækager er minimale for en luftvejstrykket på mindst 15 CMH ₂ O. Men hvis man bruger væsentligt yngre eller ældre mus, eller mus fra stammer med en anden lunge anatomi, så det ville være klogt at bekræfte, at der er minimale utætheder. Hvis der er, kan proceduren derefter kræve en anden størrelse kanyle.

Sammenfattende er det intubation procedure beskriver her billigt at fremstille og enkel at bruge, og det skulle gøre det muligt fleste efterforskere og laboranter til hurtigt at lære med succesintubere mus med relativt lidt erfaring.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Intubation cannula	BD Insylte, Sparks, MD or Jelco Optiva, Carlsbad, CA		1-in.-long, 20-gauge intravenous (IV) catheter
Fiber-optic cable	Edmund Optics, Barrington, NJ	#NT02-542	Approximately 2-ft length of 0.5-mm optical fiber (Communication grade plastic fiber). The edge of the fiber end that is inserted into the trachea should be gently rounded by holding the fiber ≈2 cm from the end and then making small circles while dragging the tip for a few seconds on 1,000-grit emory paper.
Light Source	Volpi	NCL-150	Although we use a 150-W halogen light source, any equivalent light source, even with much lower wattage can be used.
Aluminum tube			One inch O.D., with 1/16 inch wall. This may need to be change to fit whichever light source is used.
Rubber stopper			A #4 rubber stopper fits the 1 inch tube.
Small silicone rubber tube	Cole-Palmer	EW-96410-13	A ≈1.5 cm piece of silicone rubber tubing (0.8 inner diameter, 4 mm outer diameter)
Angled support stand			Ours is constucted from plexiglass, but any material to which a thread or wire can be affixed to hold the mouse at an almost vertical angle can be use.