Summary
Dit artikel beschrijft een striaghforward en efficiënte methode van intubatie muizen voor longfunctie metingen of pulmonale instillatie, die het mogelijk maakt de muizen om te herstellen en studeerde worden op latere tijdstippen. Deze procedure houdt een goedkope optische vezel lichtbron die direct verlicht de luchtpijp.
Abstract
Een eenvoudige procedure aan muizen gedurende longfunctie metingen intuberen zouden verscheidene voordelen in longitudinale studies waar weinig of dure dier. Een van de redenen dat dit niet meer routinematig gedaan is dat het relatief moeilijk, hoewel er een aantal gepubliceerde onderzoeken die manieren om dit te bereiken beschrijven. In dit artikel tonen een procedure die een van de belangrijkste hindernissen bij dit intubatie dat het visualiseren van de trachea gedurende de gehele tijd van intubatie elimineert. De methode gebruikt een 0,5 mm vezeloptische lichtbron die dient als een introducer de intubatiecanule direct in de muis trachea. We tonen aan dat het mogelijk is met deze procedure long mechanica in individuele muizen meten over een tijdsverloop van ten minste verscheidene weken. De techniek kan worden ingesteld met relatief weinig kosten en expertise, en het kan routinematig worden bereikt met relatief weinig training. Dit moet MAKE het mogelijk voor elk laboratorium om routinematig uitvoeren van deze intubatie, waardoor longitudinale studies in individuele muizen, om zo het aantal benodigde muizen en het verhogen van de statistische power met behulp van elke muis als zijn eigen controle.
Introduction
In 1999, Brown et al.. Artikel gepubliceerd beschrijft een werkwijze voor intubatie van de muizenlong 1. Een dergelijke techniek heeft veel nut in het doen van herhaalde longfunctie of broncho-alveolaire lavage in individuele muizen in longitudinale studies 2. Sinds die originele papieren, zijn er verschillende andere papieren die verschillende benaderingen beschreven om de muis intubatie 3-9. Terwijl al deze methoden kunnen met succes worden gebruikt, ze vereisen doorgaans aanzienlijke training of kosten. Een van de belangrijkste problemen met dergelijke intubatie is dat als de intubatiecanule benaderingen van de luchtpijp in afwachting inbrengen nadert, de canule zelf blokkeert het licht en daarmee de visualisatie van waar het moet gaan. Zo is de invoeging wordt blind op de meest kritieke tijd. In dit artikel laten we zien hoe eenvoudig en goedkoop deze visualisatie probleem te elimineren, waardoor wordt gewaarborgd succesvolle intubatie met relatief weinig training ofbieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de procedure
Men moet eerst het verkrijgen van en de voorbereiding van de volgende items:
- De canule. Voor intubatie van 20-35 g muizen, gebruiken we een 1 of 1,5 cm lang, 20 gauge IV katheter (BD Insylte, Sparks, MD of Jelco Optiva, Carlsbad, CA). Een nieuwe steriele katheter kan worden gebruikt voor elke muis, maar catheters kan ook worden hergebruikt na sterilisatie door onderdompeling in 70% ethanol nacht. Hoewel noch de keelholte of de luchtpijp van de muis steriel goede hygiëne, inclusief het gebruik van steriele handschoenen en instrumenten worden gevolgd.
- De glasvezelkabel. We gebruiken ≈ 70 cm van 0,5 mm optische kabel Edmund Optics, maar de lengte is niet kritisch. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de vezel heeft de rand afgevlakte, want na het snijden van de kabel op lengte met een scheermes, de rand blijft relatief scherpe, en het doet veel moeite niet te doorboren de tracheale wand. Echter iis heel gemakkelijk om dit rand glad door de aan vezels ongeveer 2 cm van het einde en dan het maken van kleine cirkels voor een paar seconden met de randen van de punt aanraken van een stuk van 1.000 korrel schuurpapier (zie demonstratie in de video en figuur 1 van Macdonald, et al.. 10). Het andere uiteinde wordt via een rubber stop. Dit wordt het gemakkelijkst bereikt door eerst een 18-gauge naald door de stop, het plaatsen van de optische vezel door de naald boring vervolgens de naald. De rubberen stop is verbonden met een 150 watt halogeen lichtbron (bijvoorbeeld NCL-150, USA Volpi of andere lichtbron of zelfs minder dan 150 watt). Het is belangrijk om ervoor te zorgen om een afdichting van silicone rubber (of ander hittebestendig materiaal) te gebruiken, omdat de gewone rubber of kurk kan branden wanneer zich zo dicht bij de hete lichtbron.
2. Het uitvoeren van de intubatie
- Zie figuren 1 en 2. Steek glasvezelkabel through een kort stuk van siliconen rubber slangen (≈ 0,8 mm ID x 4 mm OD, Cole-Palmer, EW-96410-13). Bind deze rubberen buis vrij strakke, terwijl u toch de glasvezelkabel aan te passen. Het plaatsen van de siliconenslang stevig in de Luer einde van de canule stelt de glasvezelkabel de positie in de canule. De positie van de glasvezelkabel zodat deze zich door de canule ≈ 4 mm voor de canule tip.
- Plaats de verdoofde muis op een verticale steun, opgehangen aan de bovenste snijtanden (figuur 3). De meeste onderzoekers vinden van de beste visualisatie met de ventrale zijde van de muis naar zichzelf. Heel voorzichtig trek de tong en houd met duim en wijsvinger. De middelvinger wordt tussen de hals en plastic steun. Tractie op de tong met de wijsvinger en duim wordt gebruikt om de mond open te doen, en om de intubatie pad recht te maken, wordt de hoek van de kop aangepast met de middelvinger achter de nekfiguur 3.
- Met de glasvezelkabel als lichtbron en introducer, schuiven door de gevisualiseerde stembanden. Indien de draden niet zichtbaar zijn, zachtjes harder te trekken op de tong met behulp van de middelvinger als ondersteuning. Wanneer geplaatst, verder te gaan de canule ≈ 5 mm. Dan, die zeer voorzichtig dat u de canule verplaatsen, trekt de glasvezelkabel. Liggen de muis en beveiligen de canule met een stuk tape en ondersteunen de canule hub op een stuk plasticine (klei), zoals weergegeven in figuur 4.
- De procedure in stap 3 niet gemakkelijk geleerd of zelfs worden aangetoond, aangezien het een solo operatie. Echter, door subtiele aanpassingen van de tractie op de tong en de steun achter het hoofd bijna alle die proberen dit snel vinden van de juiste manier om de muis te positioneren om de stembanden te visualiseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een evaluatie van de werkwijze, we vier 20 weken oude mannelijke BALB / c muizen gebruikt met een gemiddeld gewicht (± SEM) van 27,7 ± 0,40 g. Ze werden onderzocht op vijf opeenvolgende weken, waarbij de long werd gemeten met behulp van een systeem zoals eerder beschreven 11. Elke muis werd verdoofd met ketamine (100 ug / g BW) en xylazine (15 ug / g BW) in saline via IP injectie. Ze werden daarna geïntubeerd zoals hierboven beschreven. Als er enige twijfel of de canule in de luchtpijp en de slokdarm niet kan dit worden gevalideerd met een kleine tandheelkundige spiegel. Houden de spiegel in een vriezer en indien nodig plaats voor de Luer naaf van de katheter. Indien de catheter in de trachea, de uitgeademde lucht een zichtbare condensaat op de spiegel.
Na intubatie, we vervolgens verbinding met de muizen om de ventilator en gemeten longweerstand De muizen werden geventileerd met een snelheid van 2 Hz en getijdenenergie volume van 0,2 ml, en respiratoire weerstand afstand werd gemeten met de inspiratiefase occlusie werkwijze zoals eerder beschreven 11. Figuur 5 toont vijf wekelijkse metingen in elk van de 4 muizen. Reproduceerbaarheid is uitstekend, waaruit blijkt dat, althans in wekelijkse intervallen, is er geen effect van de voorafgaande meting. Dit is consistent met eerder gerapporteerde wekelijkse evaluaties van mechanica en BAL cel profielen in afzonderlijke BALB / c muizen met een moeilijker en potentieel traumatische procedure 2.
Figuur 1. Foto toont items gebruikt voor de intubatie. De glasvezelkabel wordt ingevoegd in een siliconen rubberen stop, met een klein stukje van siliconen rubber slangen verbonden de buurt van de andere kant. Een silicone rubber stopper is bevestigd aan de lichtbron zoals weergegeven in figuur 2.
Figuur 2. Afbeelding met rubber stopper aangesloten lichtbron met andere uiteinde van glasvezelkabel ingebracht via de intubatiecanule. Een eenvoudige drager staan de muis houden tijdens intubatie ook links weergegeven.
Figuur 3. Twee perspectieven die de positie van de muis klaargemaakt voor intubatie.
Figuur 4. Deze figuur toont een geïntubeerde muis klaar voor de ventilatie. De tape rond de mond helpt de canule kan bewegen. Een stukje plasticine (klei) is een handige rust de canule hub veilig voor aansluiting op de ventilator.
Figuur 5. Longweerstand van elk van de 4 muizen (in verschillende kleuren) gemeten bij 5 tussenpozen van een week.
Figuur 6. Getoond is een grafiek record van luchtwegdruk in een geïntubeerde muizen na injectie van 0,5, 0,75 en 1 ml. Elk deel werd gedurende 20-40 sec, losgelaten daarvóór volgende inflatie. Hoewel er mogelijk een zeer traag lek na de spanningsrelaxatie herstel, zou dit te verwaarlozen effect op de normale ventilatie of beoordeling van dynamische longfunctie metingen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven procedure heeft verschillende voordelen. Eerst de inrichting is eenvoudig en relatief goedkoop .. De fabricage van de inrichting vereist geen speciaal gereedschap of dure apparatuur. Het gebruik van een katheter introduceert die ook de lichtbron betekent dat men nooit uit het oog van de tracheale opening als de inbrenger de tracheale opening nadert verliest. Het gebruik van een 0,5 mm introducer dient ook te minimaliseren trauma die zich kunnen voordoen met een initiële insertie van een grotere canule. We merken hier op dat een soortgelijke optische sonde is verkrijgbaar bij een commerciële leverancier (Braintree Scientific, Braintree, MA). Hun apparaat maakt gebruik van een batterij aangedreven lichtbron en optische vezel.
In dit werk, testten we de procedure met het nameten van long mechanica, maar zoals intubatie kunnen evengoed worden gebruikt om chemische of cellen doordringen in de longen, zoals is beschreven voor herhaalde afgifte van LPS 12. Bovendien eenvoorafgaand verslag met een meer primitieve intubatie beschreven procedure de mogelijkheid om herhaalde BAL te doen in individuele muizen 2, en dit zou veel eenvoudiger bereikt met de nieuwe intubatie aanpak.
In de praktijk is de hier beschreven methode is gemakkelijk onderwezen aan kerels, studenten en technici die nog nooit had geprobeerd intubatie. In feite, tijdens groepstrainingen, een deel van de leerlingen worden voldoende bekwaam om te onderwijzen dan sommige van de andere studenten die nog niet had geprobeerd. Deze methode heeft dus een groot voordeel omdat het minimaliseert het aantal muizen nodig voor werkwijzen en kunnen minimale schade in herhaalde studies.
In het doen van de intubatie, zijn er verschillende praktische problemen die moeten worden vermeld. Het is belangrijk om zo geleidelijk mogelijk de terugtrekking van de tong in de eerste opening van de mond. Als onbeschermde tang worden gebruikt is het gemakkelijk te verwonden de tong en kan deze lead de dood van de muis. In eerste leren hoe je de intubatie te doen, het belangrijkste is het gebruik van de vinger achter de nek om de hoek van het hoofd aan te passen aan de visualisatie van de tracheale opening mogelijk te maken. Wanneer correct gedaan, met voldoende grip op de tong, kan de stembanden goed te zien. Het is deze eerste stap visualisatie die meestal vereist de meeste tijd, want zodra de tracheale opening wordt gezien, is het relatief eenvoudig invoegen de vezelkabel en intraveneuze catheter. In eerste instantie als er een probleem is met deze visualisatie, wordt de stagiair vaak niet te trekken op de tong met voldoende kracht. Het verhogen van deze pull iets zal rechtzetten de visualisatie pad zodat de stembanden kan worden gezien. Hamacher, et al.. Beschreven een uniek systeem met intubatie microscopische visualisatie 4. Hun online video van deze intubatie is uitstekend en zeer leerzaam, hoewel de wijze van positioneren van de kop en de nek is niet geheel duidelijk uit de video en figuur. Terwijl het systeem beschrijven ze lijkt te werken zeer efficiënt, het vereist een speciale microscoop. Met het systeem en de procedure wordt beschreven, de stembanden en tracheale opening kan worden gezien met het blote oog. In onze oorspronkelijke beschrijving van deze werkwijze 10 beschreven we een procedure om een kegel aan de intubatiecanule. Deze conus wiggen in de smalle muis keelholte en voorkomt dat de canule tegen een te diep is ingebracht. We hebben gevonden dat deze wig is nuttig leren studenten de procedure, aangezien het zeer eenvoudig om de canule te voegen aan de carina of verder eventueel binnendringen via een luchtwegwand. Eenvoudige instructies om de wig te fabriceren is te vinden in die krant. Maar zodra iemand de procedure leert voldoende en waar de canule positioneren, wordt deze aanpassing niet meer nodig.
Tot slot moeten we opmerken dat we alleen hebben deze procedure getest met de 20 g canule bij jonge volwassen muizen van een paar stammen. In deze situatie hebben we aangedrongen dat de trachea en stembanden kan een zeer goede afdichting rondom de canule met normale ventilatie druk en er dus een minimale luchtlekkage uit de long met mechanische ventilatie. Figuur 6 toont de resultaten van op infusen in een C57BL / 6 muis, waarbij 3 toenemende lucht bolussen (0,5, 0,75 en 1 ml) werden gebruikt om de longen te vullen. Het is duidelijk uit deze figuur dan druk lekken zijn minimaal voor een druk in de luchtwegen van ten minste 15 cmH 2 O. Echter, als men gebruik maakt van aanzienlijk jonger of ouder muizen of muizen van stammen met een andere long anatomie, dan zou het verstandig zijn om te bevestigen dat er een minimale lekkage. Zo ja, dan kan de procedure vereist gebruik van een verschillende grootte canule.
Kortom, de intubatie procedure te beschrijven is hier goedkoop te fabriceren en eenvoudig te gebruiken, en het moet in staat stellen de meeste onderzoekers en laboranten om snel te leren om met succesintuberen muizen met relatief weinig ervaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen van de auteurs om het even welke belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Ondersteund door NIH HL-10342.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intubation cannula | BD Insylte, Sparks, MD or Jelco Optiva, Carlsbad, CA | 1-in.-long, 20-gauge intravenous (IV) catheter | |
| Fiber-optic cable | Edmund Optics, Barrington, NJ | #NT02-542 | Approximately 2-ft length of 0.5-mm optical fiber (Communication grade plastic fiber). The edge of the fiber end that is inserted into the trachea should be gently rounded by holding the fiber ≈2 cm from the end and then making small circles while dragging the tip for a few seconds on 1,000-grit emory paper. |
| Light Source | Volpi | NCL-150 | Although we use a 150-W halogen light source, any equivalent light source, even with much lower wattage can be used. |
| Aluminum tube | One inch O.D., with 1/16 inch wall. This may need to be change to fit whichever light source is used. | ||
| Rubber stopper | A #4 rubber stopper fits the 1 inch tube. | ||
| Small silicone rubber tube | Cole-Palmer | EW-96410-13 | A ≈1.5 cm piece of silicone rubber tubing (0.8 inner diameter, 4 mm outer diameter) |
| Angled support stand | Ours is constucted from plexiglass, but any material to which a thread or wire can be affixed to hold the mouse at an almost vertical angle can be use. |
References
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J. Appl. Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
- Walters, D. M., Wills-Karp, M., Mitzner, W. Assessment of cellular profile and lung function with repeated bronchoalveolar lavage in individual mice. Physiol. Genomics. 2, 29-36 (2000).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science / American Association for Laboratory Animal Science. 44, 52-55 (2005).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42, 222-230 (2008).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory Animals. 41, 128-135 (2007).
- Zhao, X., et al. A technique for retrograde intubation in mice. Lab Animal. 35, 39-42 (2006).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 8, 103-106 (2004).
- Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G. Video-assisted orotracheal intubation in mice. Laboratory Animals. 37, 204-206 (2003).
- Hastings, R. H., Summers-Torres, D. Direct Laryngoscopy in Mice. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science / American Association for Laboratory Animal Science. 38, 33-35 (1999).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J. Appl. Physiol. 106, 984-987 (2009).
- Ewart, S. L., Levitt, R. C., Mitzner, W. Respiratory system mechanics in mice measured by end-inflation occlusion. Journal of Applied Physiology. 79, 560-566 (1995).
- MacDonald, K. D., McKenzie, K. R., Mitzner, W., Zeitlin, P. L. Lung Mechanics in Heterozygous CF Mice after Repeated LPS Dosing. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 175 (4), A930 (2007).
