Summary
שכבת פני שטח glycocalyx / אנדותל האנדותל היא למד באופן אידיאלי באמצעות מיקרוסקופ intravital. מיקרוסקופיה Intravital טכני מאתגרת באיבר מרגש כגון ריאות. אנחנו מדגימים איך brightfield סימולטני ומיקרוסקופיה ניאון ניתן להשתמש כדי להעריך את עובי שכבת פני שטח האנדותל שבנע בחופשיות,
Abstract
Glycocalyx אנדותל הוא שכבה של proteoglycans וglycosaminoglycans הנלווה המצפה את חלל כלי הדם. בחי, glycocalyx הוא hydrated מאוד, ויצר שכבת האנדותל משמעותית משטח (ESL) שתורמת לשמירה על תפקוד האנדותל. כglycocalyx האנדותל הוא לעתים קרובות סוטה במבחנה והוא אבד במהלך טכניקות קיבוע רקמות הרגילות, מחקר של ESL דורש שימוש במיקרוסקופ intravital. כדי להתקרב לפיסיולוגיה המורכבת ביותר של microvasculature מכתשיים, הדמית intravital ריאה מבוצעת באופן אידיאלי על ריאות באופן חופשי אל לב. הכנות אלה, עם זאת, בדרך כלל סובלות מחפץ תנועה נרחבת. אנחנו מדגימים איך מיקרוסקופיה intravital סגור חזה של ריאת עכבר שנע בחופשיות, יכולה לשמש למדידת תקינות glycocalyx באמצעות הדרה של ESL dextrans משקל המולקולרי שכותרת-fluorescently הגבוה ממשטח אנדותל. טכניקה זו אינה התאוששות אחרי ניתוח, שדורשתbrightfield בו זמנית והדמית ניאון של ריאת העכבר, מאפשרים תצפית אורך של microvasculature subpleural ללא עדות לגרימת פציעת ריאות בלבול.
Introduction
Glycocalyx אנדותל הוא שכבה תאית של proteoglycans וglycosaminoglycans הנלווה המצפה את כלי דם אינטימה. בחי, glycocalyx הוא hydrated מאוד, ויצר שכבת האנדותל משמעותית משטח (ESL), המסדירה מגוון רחב של פונקציות אנדותל כולל חדירות נוזלי 1, נויטרופילים אנדותל- הידבקות 2, וmechanotransduction של 3 מאמץ גזירת נוזל.
מבחינה הסטורית, glycocalyx היה מוערך בשל aberrance בהכנות בתרבית תאים 4, 5 והשפלתה במהלך קיבוע רקמה הסטנדרטי ועיבוד 6. השימוש הגובר 7 של מיקרוסקופיה intravital (במיקרוסקופ vivo, IVM) שעלה בקנה אחד עם עניין מדעי מוגבר בחשיבות של ESL לתפקוד כלי דם במהלך מחלה ובריאות. ESL הוא בלתי נראה למיקרוסקופ אור ולא יכול להיות מתויג בקלותvivo, בהתחשב בנטייה של קטיני ניאון glycocalyx מחייבים לגרום להתלכדות RBC 8 ותסחיפי ריאות קטלניים (תצפיות שלא פורסמו). גישות עקיפות אחדות לכן פותחו להסיק עובי ESL (ובהרחבה, יושרת glycocalyx) במיטות שאינן נעות וסקולריים כגון microcirculations cremasteric וmesenteric. טכניקות אלו כוללות מדידה של הבדלים במהירות במחזור microparticle כפונקציה של מרחק מקרום אנדותל (velocimetry תמונת microparticle 9) כמו גם המדידה של ההדרה של סמנים מגושמים, fluorescently כותרת וכלי דם (למשל dextrans) ממשטח אנדותל (טכניקת dextran הדרת 10, 11). טכניקות אלו, רק הדרת dextran מסוגלת לאמוד עובי ESL ממדידות שנעשו בנקודה אחת בזמן. על ידי מדידת רוחב כלי דם בו זמנית באמצעות מיקרוסקופיה brightfield (רוחב בclusive של ESL "בלתי נראה"), ומיקרוסקופיה ניאון של נותב כלי דם הוצא מESL, עובי ESL ניתן לחשב כמחצית ההפרש בין רוחב כלי דם 2.
השימוש באמצעי מיידי של עובי ESL הוא מותאם היטב ללימוד glycocalyx ריאתי. מיקרוסקופיה Intravital של הריאות היא מאתגרת, בהתחשב בחפץ לב וריאות תנועה משמעותי. למרות התקדמות שחל באחרונה לאפשר לקיבוע של ריאות עכבר ב12 vivo, 13, חששות קיימים לגבי ההשפעה הפיזיולוגית של ריאות קיפאון. חוסר תנועת ריאות קשור בתחמוצת חנקן האנדותל ירד איתות 14, מסלול איתות המשפיע גם הידבקות נויטרופילים 15 ופציעה 16 ריאות. יתר על כן, קיבוע של אזור של ריאה חושפת מקיף alveoli הנייד לכוחות גזירה שפגיעתו (מה שנקרא "atelectrauma"), בהתאם למושגים הפיסיולוגיים הקלסיים שלתלות הדדית מכתשיים 17.
בשנת 2008, אראטה Tabuchi, וולפגנג Kuebler ועמיתיו פתחו טכניקת ניתוח המאפשרת למיקרוסקופיה intravital של ריאת עכבר שנע בחופשיות-18. חפץ נשימה הנובע מטכניקה זו ניתן לשלול על ידי שימוש בהדמיה במהירות גבוהה, כולל מדידה סימולטנית של brightfield ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדו"ח זה, אנו פירוט כיצד הדמית הדרת dextran מיידית יכולה להיות מועסקת על מנת למדוד את עובי ESL בזרימת דם subpleural של שנע בחופשיות-, in vivo ריאות עכבר. טכניקה זו ניתן לשנות בקלות כדי לקבוע glycocalyx פונקציה ספציפית, יכולתו של שלם ESL שלא לכלול במחזור אלמנטים ממשטח אנדותל. אנחנו השתמשנו בטכניקות אלה לאחרונה כדי לקבוע את החשיבות של יושרת ESL ריאתי להתפתחות פציעת ריאות חריפה במחלות דלקתיות מערכתיות כגון אלח דם 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת אבובי כירורגים, צנתרי כלי דם, חלון קיר חזה
- שלב מיקרוסקופיה Intravital. אנו מחוייט שלב פרספקס עליו את העכבר מורדם טמון במיקרוסקופ. שלב זה מכיל שני של 15 סנטימטר על ידי פורום 10 סנטימטרי פלסטיק גמיש חיתוך (שעל העכבר נמצא במהלך אינדוקציה של הרדמה, מיקום הנשמה, וצנתור ורידים), כמו גם גוף חימום בגודל דומה-(ממוקם מתחת לקרש החיתוך).
- הכנת עכבר thoracostomy צינור (איור 1). אורך 10 סנטימטרים של 50 צינורות PE (Intramedic, 0.58 מ"מ הפנימי קוטר, קוטר חיצוני 0.965 מ"מ) הוא לחתוך. קצה אחד מחובר לקצה הקהה של מחט מד מעוגלת 23; מחט זה ישמש כדי להעביר את הצינור דרך קיר בית החזה (בתוך מחוץ →) לפני סגירת חלון בית החזה.
הסוף הדיסטלי של הצינור (1.5 סנטימטרים באורך, מנוגדים ל23 מד המצורףמחט) שוב ושוב הוא נקב על ידי מחט מד 30, יצירה "יציאות לוואי" כדי להקל על שאיפה יעילה של אוויר intrathoracic.
אז חלק fenestrated הוא מופרד משאר הצינור על ידי מספר לולאות היקפיות של תפר משי 04:00; לולאות אלה תשמשנה "פקק", בסופו עיגון 1.5 הסנטימטרים fenestrated חלק בתוך חלל החזה. - צנתרי ורידי צוואר. שני אורכים 15 סנטימטר של 10 צינורות PE (Intramedic, קוטר 0.28 מ"מ פנימי, קוטר חיצוני 0.61 מ"מ) נחתכים. אזמל משמש לפוע קצות הצינור, ובכך להגדיל את קלויות venipuncture. הצינורות הוא הסמיק באמצעות מזרק 1 מ"ל המכיל 6% פתרון 150 kDa dextran (ב PBS) המצורף בסוף שאינו המשופע של הצינורות.
- קרום polyvinylidene שקוף (ניו ק.א.ר. גלישה, Kuresha, טוקיו) הכנת חזה קיר חלון (איור 2). נחתכה לצורת אליפסה (6 סנטימטרי ציר מרכזיים, 4 סנטימטר ציר משני). 5 מ"מ מעגלי # 1 coverslip (Bellco) מודבקת בקרום באמצעות דבק α-cyanoacrylate (Pattex flüssig, הנקל, דיסלדורף).
- . צינור לזירוז pneumothorax ("צינור מכה") 10 סנטימטר אורך של צינור (קוטר פנימי 3 מ"מ, קוטר חיצוני 5 מ"מ) מחובר למזרק 5 מ"ל; הקצה השני ישמש להציג את האוויר לתוך כלוב חזה החיה לפני engraftment חלון קיר החזה.
- מזרק לטבילה במימיו של אובייקטיבי. מחט מד 23 מצורף מזרק המכיל 30 מיליליטר מים מזוקקים. קצה המחט שקהה (באמצעות קובץ מתכת) על מנת למנוע ניזק למטרה.
2. הרדמה מאוסה
- עכבר הוא מורדם בתערובת של קטמין (10 מ"ג / מ"ל) וxylazine (2 מ"ג / מ"ל), intraperitoneally ניתן במינון של 8 μl למשקל גוף עכבר גרם. סדציה מתרחשת תוך 3 - 6 דקות ולא צריך לעכב נשימה ספונטנית.
- שימוש במכונת גילוח, גילוחגרון, חזה, בטן, והצד ימני של העכבר.
- באמצעות קלטת, לאבטח את העכבר לקרש חיתוך פלסטיק דק. הראש של העכבר צריך להצביע לכיוון המפעיל (איור 3). מתח עדין שסופק על ידי לולאה של פטירת תפר מתחת לשיניים העליונות משמש כדי לשמור על ראש שלוחה. קרש החיתוך מונח על כרית חימום, שמירת euthermia עכבר במהלך הנשמה ומיקום קטטר ורידים.
- אזורים רטובים מגולחים עם אתנול 100%.
- לאשר הרדמה נאותה עם קמצוץ זנב / כפה. המשך אם תגובה מינימאלית; לספק בולוס נוסף של קטמין / xylazine אם לא כראוי מורדם.
3. טרכאוסטומיה
- חתך 1 סנטימטר נעשה על הגרון. רקמת חיבור בסיסית מנותחת, ובלוטות הרוק מופרדות ושקפו רוחביים. מייד השריר הקדמי לקנה הנשימה sternohyoid הוא לכרות את הגידול.
- לולאה של תפר 04:00 הוא התקדם תחת הדואר קנה נשימה (איור 4). אז לולאה היא לחתוך, יצירת שני גדילים נפרדים של תפר שבבסיס קנה הנשימה. תפר הזנב ישמש כדי לאבטח את צינור ההנשמה; תפר הגולגולת ישמש כדי לספק מתח בקנה הנשימה במהלך שמת הנשמה.
- השימוש בשתי אצבעות, התפר העליון נקלט ומתח עדין חל על קנה הנשימה. חתך אופקי נעשה בקנה הנשימה העליונה ובין תפרים נמוכים יותר. חתך זה צריך לעבור כשני שלישים מההיקף קנה הנשימה. צינור הנשמת אוגן (הרווארד Apparatus, קוטר חיצוני 1.22 מ"מ) מוכנס לתוך קנה נשימת דיסטלי ומאובטח למקומו באמצעות תפרים קנו נשימת הזנב.
- ההנשמה מחוברת למכונת נשמת חיה קטנה נפח מבוקרת (אינספירה, הרווארד Apparatus), והעכבר מאוורר עם חמצן השראה 40% וכרכי 9 מ"ל / קילו גאות (הגדרות מותאמות כדי לשמור על חמצון / אוורור מתאים במעבדה שלנו). חיובילחץ tive סוף הנשיפה (PEEP) לא התחיל בשלב זה. מן ראוי לציין כי הגדרות הנשמה צריכות להיות מותאמות לתנאים ייחודיים במעבדות בודדות. אורכים שונים של צינורות מיותרים (חוצץ בין ה-Y מחבר צינורות ההנשמה וההנשמה) ניתן להשתמש כדי להתאים את השטח מת, כדי להבטיח אוורור מכתשיים יציב לכל נפח גאות בחר.
4. צנתור ורידים
- הצומת של עורק הצוואר הפנימי וחיצוני יכולה להיות מזוהית על ידי מעקב ענפי ורידים הדיסטליים proximally. הצוואר החיצוני נמצא מתחת לבלוטות הרוק משתקפת; זה יכול להיות נעוצי proximally למצוא צומת הצוואר חיצוני-הפנימית.
- השתמש נתיחה בוטה עדינה להפריד צומת הצוואר מרקמות חיבור.
- שימוש בתפרים 04:00, לקשור את ורידי הצוואר והפנימיים וריד הצוואר החיצוניים דיסטלי (גולגולת) עד לצומת הצוואר.
- לעשות חתך קטן לקארינהלצומת הצוואר; דימום צריך להיות מינימאלי.
- שני צנתרים יכולים להיות מתקדמים בהדרגה דרך החתך בתא המטען והצוואר. לאחר שאיפה עדינה, כדי להבטיח תמורת דם, צנתרים מובטחים בתוך הווריד באמצעות תפרים 04:00.
- צנתרי ורידי קלטת לקרש חיתוך כדי למנוע נגד ליפה לא מכוון.
5. כירורגיה Intravital עכבר ריאות מיקרוסקופית (מותאם Tabuchi et al. 18)
- קרש החיתוך (המכיל עכבר המאופק, הרדים כמו גם צנתרי ורידים מוקלטים) הוא עבר לשלב מיקרוסקופיה intravital, שבו בצעה את התערבויות כירורגיות הנותרות. בדיקה רקטלית טמפרטורה ממוקמת; ממשקים זה עם מערכת חימום אדפטיבית (ממוקם מתחת לקרש החיתוך), ומאפשרת תחזוקה של euthermia עכבר.
- צנתר ורידי צוואר אחד מחובר למשאבת מזרק שמספקת קטמין (10 מ"ג / מ"ל)-xylazine (2 מ"ג / מ"ל)תערובת ב 200 μl לשעה. הרדמה נאותה הוא אשר שוב באמצעות זנב / קמצוץ כפה.
- חתך קו אמצעו הוארך מהצוואר ועד תהליך xyphoid, אז שימשיך רוחבי לצד ימין (איור 5).
- שימוש electrocautery, שרירי חזו הוסר, חשיפת כלוב בית החזה. טיפול נלקח כדי להבטיח hemostasis מלאה.
- לחצות את hindleg ימין של העכבר על הצד והקלטת השמאליים. פיתול בטן כתוצאה מסתובב מעט חזה, שיפור קל של הניתוח.
- הנח את הבמה בזווית של 45 מעלות (איור 6); מיצוב זה מאפשר הריאות לנפול מקיר החזה פעם pneumothorax מושרה.
- צלע st 1 (צלעות הנחותות ביותר) נתפסת עם מלקחיים וגדלה; מלקחיים מעוקלים נדחפו בבוטות מתחת לצלע. זה מפריד הצדר הקודקודית מקיר החזה. הצדר צריך להישאר unpunctured.
- שימוש בצינור והמכהמזרק, האוויר הציג בכוח נגד הצדר הקודקודית. זה מוביל לקרע של פני השטח וpneumothorax פלאורלי מבלי לפגוע ריאות הבסיסיות. הריאות הבסיסיות תיפולנה מקיר החזה, ומאפשרות החדרת מלקחי electrocautery מבלי לפגוע ריאות. ירידה בנפח גאות הנשמה בדרך כלל לא נדרשה במהלך שלב זה.
- שימוש במלקחי electrocautery, לנתח חזה קיר השרירים וחצה את ה 5 ו 6 צלעות ה / הצדר הקודקודית, מה שהופך ~ חור עגול 8 מ"מ לתוך בית החזה. זה חיוני כי hemostasis השלמה להישמר, כנוכחות של דימום תטשטש מיקרוסקופית (איור 7).
- שימוש נהג מחט, הכנס את הצינור לתוך חור thoracostomy קיר החזה. המחט צריכה לנקב את דופן בית החזה ולצאת מהחלל הנחות ורוחב לחלון בית החזה (איור 7) החזי. תשמרו על עצמך כדי להימנע מניקוב הסרעפת.אז צינור הוא משך בעדינות מתוך קיר בית החזה עד שההתנגדות מתרחשת מהתפר "הפקק" הממוקם בקצה של חלק fenestrated של הצינור.
- הנח את השלב שטוח.
- הוסף 3 סנטימטר PEEP H 2 O להנשמה לעזור ולסייע הריאות reexpansion.
- דבק (Pattex ג'ל, הנקל) ממוקם circumferentially סביב חלון החזה. הקרום מחובר, עם תלוש כיסוי הזכוכית הפונה לחוץ את חלל בית החזה. בזהירות (וcircumferentially) משוער קרום לדבק באמצעות מוליך כותנה.
- בעת ביצוע תרגיל גיוס ריאות (3 כרכי גאות שבמהלך יציאת הנשמת PEEP חסומה), שאיבת -3 מ"מ כספי תחול על צינור החזה. ריאות צריכות עקביות משוערת קרום תוך שנעו בחופשיות במהלך אוורור גאות (איור 8).
- הרגל הקדמית הימנית של העכבר עברה לצד שמאל, וכתוצאה מכך עמדת משכוב רוחבית שמאלית של העכבר.טריזים ספוגים ניתן להשתמש כדי למקם את העכבר כראוי ולכן חלון החזה מיושר עם מטרת הטבילה במים המיקרוסקופי.
- מים מזוקקים מושמים על תלוש הכיסוי לפני מיקרוסקופי, המאפשרים הדמיה של הריאות באמצעות אובייקטיבי טבילה במים. מים צריכים להיות מתחדשים לסירוגין לאורך הדמיה.
6. מדידה של עובי שכבת האנדותל ריאתי Surface
- מייד לאחר סגירת בית חזה, 500 FITC מתויג-150 kDa dextran μl (פתרון 6% ב PBS) המנוהל דרך צנתר הוורידים שני (הלא הרדמה) הצוואר. בולוס זה משמש כהחייאת נפח, כמו גם כלי הדם נותב לESL מדידה. Dextran בולוס אינה משפיעה הידבקות נויטרופילים או היווצרות בצקת ריאות 2.
- מטרת הטבילה במים מרוכזת על תחתונית הכיסוי. בחירת המטרה היא חיונית, כדי להמחיש הבדלים קטנים בעובי ESL, numeri גבוהcal צמצם יש צורך (> 0.8), תוך שמירה על 2 - 3 מ"מ מרחק עבודה (המאפשר חדיר דרך חלון הריאות ומשטח פלאורלי). אנו משתמשים בניקון CFI 75 LWD 16x (NA 0.8) וCFI 75 (NA 1.1) מטרות 25x LWD למטרה זו.
- כדי למדוד במדויק את עובי ESL באיבר מרגש, זה הכרחי כי brightfield ורוחב כלי דם ניאון מבוצעים בו זמנית. ניתן לעשות זאת באמצעות תמונת ספליטר (צג כפול, Photometrics) המאפשר ללכידתו זמני של ניגוד הפרעות משתקף אור הפרש (DIC, brightfield) ותמונות FITC (איור 9).
- במהלך פוגת 5 שניות שאיפה, הדמיה רצופה הופיעה והקליטה. מאוחר יותר, תמונות אלה תוכלנה להיבחן לזהות מסגרות במיקוד.
- שימוש במיקוד המסגרת, microvessels subpleural (<20 קוטר מיקרומטר) מזוהית; לפחות 3 microvessels נמצאים בדרך כלל במסגרת אחת. לאחר השלים הניסוי, דסק"שורוחב FITC-dextran כלי דם נמדד (על ידי משקיף עיוור) על ידי החישוב ממוצע של שלושה אורכי מיירט ניצב לmicrovessel. בהנחה שעובי ESL שווה בשני הקצוות של הכלי, גודל ESL יכול להיות מוגדר על ידי מחצית ההפרש בין דסק"ש ורוחב FITC-dextran כלי דם, כפי שתואר בסעיף תוצאות הנציג.
- בדרך כלל, מיקרוסקופיה intravital יכולה להתבצע ל> 90 דקות ללא כל עדות לפגיעת ריאות או ירידה בלחץ דם 2. ניסויים ראשוניים יש לבצע כדי לאשר את יציבות עכבר (לחץ דם, החמצון, האוורור, פגיעת ריאות) במהלך התקופה של התבוננות. תרופות ניסיוניות עשויות להיות הציגה דרך הצנתר שני (הלא הרדמה) צוואר בכל שלב במהלך ההליך.
7. מדידה אלטרנטיבית של יושרת שכבת האנדותל ריאתי Surface
פונקציות שכבת האנדותל המשטח השלמות (בחלקם) שלא לכלול circulatאלמנטי ing מ2 המשטח אנדותל. יושרת ESL לכן ניתן למדוד את היכולת של אלמנט במחזור (למשל microsphere ניאון) לגישה ולאינטראקציה עם מולקולות דבקות בתא שטח (כגון Icam-1).
- אנטי Icam-1 שכותרת הניאון microspheres מוכן לפני הניתוח. 0.97 מיקרומטר streptavidin המצופה microspheres ניאון מודגרת עם biotinylated אנטי Icam-1 (YN1/1.7.4 שיבוט, 1:50, eBioscience) שליטת נוגדן או אלוטיפ למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. Microspheres נשטף שלוש פעמים והושעה ב PBS ב1 x 10 9 microspheres למ"ל.
- במהלך מיקרוסקופיה intravital, השעית microsphere (100 μl) מוזרקת לתוך צנתר ורידי הצוואר. לאחר 15 דקות של זרימה, תמונות ניאון הם כבשו מעל 5 דקות. Microspheres הנייח ל> 5 דקות נחשבים חסיד ולכמת באמצעות תוכנת עיבוד תמונה.
8. מת
<כיתת p => "jove_content" לאחר השלמת ההליך, עכברים מורדמים מורדמים ידי exsanguination דרך לנקב לב ישיר. המתת חסד היא דרך אשרה pneumothoraces הבילטראליים, לאחר שריאותיהם מסתיימות ונצמדים קפוא לניתוח מאוחר יותר.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הגישה הניסויית מתואר בשלבים 1-6 תאפשר לכידה של מסגרות מרובות של דסק"ש סימולטני (brightfield) ותמונות ניאון. כדי לקבוע את עובי ESL, תמונות נרשמו נבדקות על ידי משקיף עיוור לאחר השלמת פרוטוקול הניסוי. שימוש במיקוד המסגרת, microvessels subpleural (<20 קוטר מיקרומטר) מזוהית; לפחות 3 microvessels נמצאים בדרך כלל במסגרת אחת (איור 10). השימוש בתוכנת ניתוח תמונה (אלמנטי ש"ח, ניקון), רוחב כלי דם נמדד (על ידי משקיף עיוור) על ידי חישוב ממוצע של שלושה אורכי מיירט ניצב לmicrovessel. כESL הוא בלתי נראה להדמית דסק"ש, רוחב כלי הדם DIC span קרום האנדותל לממברנת האנדותל ולכן עובי כולל של ESL 9, 10. לעומת זאת, FITC-dextran (150 KDA) מנועה מESL. כתוצאה מכך, רוחב כלי דם FITC לא לשלב עובי ESL. בהנחת ESL עבה שווהנוס בשני הקצוות של הכלי, גודל ESL לכן יכול להיות מוגדר על ידי מחצית ההפרש בין דסק"ש ורוחב FITC-dextran כלי דם.
כמה חסרונות טכניים פוטנציאליים עלולים להפריע לפרשנות של תוצאות ניסיוניות. הנוכחות של דימום לתוך שדה מיקרוסקופיה תטשטש גם הדמיה של דסק"ש וFITC microvasculature subpleural, ולכן יש להקפיד לקבל hemostasis (באמצעות electrocautery) במהלך השמת חלון (5.9). בנוסף, הריאות אולי לא reapproximate חלון בית החזה לאחר תמרון הגיוס (5.14); זה בדרך כלל מעיד על הידבקות היקפית שלמה של הקרום סביב חלון בית החזה. זה בדרך כלל ניתן לתקן על ידי reapplication של דבק סביב חלון בית החזה, ואחרי תמרון גיוס ריאה חוזרת. לבסוף, יש להקפיד להימנע מהזרקה תוך ורידית מקרית של אוויר לתוך העכבר. תסחיפי אוויר, גם אם לא קטלני, יהיו preferenti נסיעות ברית לריאות nondependent, מניעת זלוף FITC-dextran של microvasculature דמיין (nondependent) subpleural.
מדידת רוחב ESL דורשת שימוש במפצל תמונה (שהציע דסק"ש והדמית ניאון סימולטני) כמו גם יעדי מיקרוסקופיה מיוחדות. דרישות ציוד אלה ניתן להימנע עם כמה שינויים לפרוטוקול שלנו. יושרת Glycocalyx ניתן למדוד באופן עקיף על ידי קביעת הדרת ESL של המחזור microspheres ממשטח הכלי. הנוכחות של שפלת ESL, ולכן, הוא הצביע על ידי הלכידה מוגברת של כלי הדם subpleural microspheres הממוקד נגד מולקולות אנדותל משטח הדבקה (כגון Icam-1) (איור 11).
איור 1.
איור 2.
איור 3.
איור 4.
איור 5.
איור 6.
איור 7.
איור 8.
איור 9.
איור 10. מדידה של עובי עכבר ריאתי ESL. (א) נציגו זמנית-DIC ונתפס תמונות ניאון של microvasculature subpleural העכבר (סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר). רוחב Microvessel נמדד באמצעות הממוצע של שלושה מיירט ניצב ליניארי. עובי ESL ניתן לקבוע על ידי מחצית ההפרש בין דסק"ש (הכולל ESL) וניאון (בלעדי של ESL)רוחב microvessel. (ב) מדידות DIC לזהות במדויק גבולות קיר כלי subpleural, כפי שהודגמו על ידי דסק"ש כמעט זהה, ומדידות רוחב כלי GFP שבוצעו בעכברי אנדותל-ניאון Tie2-GFP (Labs ג'קסון). קו מוצק מייצג שורה של זהות. (ג) microvasculature subpleural ניתן בעקבות longitudinally, כפי שמעיד אובדן ההדרגתי של עובי ESL התרחש לאחר lipopolysaccharide תוך ורידים (LPS). n = 3 עכברים. * P <0.05 בהשוואה לזמן = 0 דקות על ידי ANOVA.
סרט 1. יושרת Glycocalyx יכולה להיקבע על ידי הערכה לדבקות microsphere אנטי Icam-1 בתוך microvasculature subpleural. מיקרוסקופיה confocal המהירה (ניקון A1R) מדגימה 45 דקות microspheres ניאון חסידות לאחר LPS תוך ורידים (20 מ"ג לכל קילו משקל גוף). שים לב שיכול להיות במחזור microspheres occasionally ראה עובר דרך זרימת הדם. כדי לשפר את ההדמיה של לוקליזציה (ירוקה הזרחנית) microsphere, בשלב 6.1 עכברים pretreated עם נותב כלי דם TRITC-dextran (150 kDa, 6%) במקום FITC-dextran. לחץ כאן לצפייה בסרט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ביחד עם התרחבות השימוש במיקרוסקופ בvivo, יש הערכה גוברת הוא לגודל משמעותי של ESL, כמו גם התרומות הרבות שלו לתפקוד כלי דם. נתונים אלה המתעוררים, לעומת זאת, נובעים בעיקר ממחקרים של מערכת כלי הדם המערכתית. ואכן, שימוש במיקרוסקופ בvivo הריאות מאתגר מבחינה טכנית, ניתן חפץ תנועת ריאות ולב משמעותי.
כמה פיתוחים טכניים אחרונים אפשרו לייצוב של ריאת העכבר נע, ונותן יישום טוב יותר של טכניקות intravital ל12 זרימת דם ריאתי, 13. גישות אלה, עם זאת, נבהלות מההשלכות שעלולות להיות הפיזיולוגיות של חוסר תנועת ריאות. כריאה היא teleologically איבר המיועד לתנועה רציפה, ריאות קיפאון יהיה אינטואיטיבי לשנות פיזיולוגיה של ריאות. אכן, ריאות קיפאון הוא קשור בשינויים בn אנדותלitric תחמוצת איתות, מסלול עם השלכות רבות במורד זרם גם הריאה הבריאה ופצועה 14, 16. יתר על כן, קיבוע של אזור אחד נושאי הריאה מקיפים alveoli לכוחות הגזירה שפגיעתו, עולה בקנה אחד עם מאפיין "atelectrauma" של הנשמה לגרום פציעת ריאות 19. אלה ואחרים עדיין ליזוהה-השלכות של ריאות קיפאון צפויות פרשנות לבלבל תצפיות intravital של כלי דם ריאתי (פתיו) פיזיולוגיה.
בהתחשב בחששות האלה, שאנחנו בקשנו לפתח שיטה שבאמצעותה ניתן יהיה לבחון ESL ריאתי בחופשיות מרגשת, in vivo ריאות עכבר. אנחנו בחרנו להתאים את הטכניקה של Tabuchi וKuebler, גישה המאפשרת הדמית אורך של ריאת עכבר שנע בחופשיות, בלי הסתת פגיעת ריאתית 18. חשוב מכך, הגישה שלנו מכילה מספר שינויים עדינים מהפרוטוקול המקורי של Tabuchi; Altera אלהtions התפתח מהצורך להתאים תנאים ייחודיים בתוך המעבדה שלנו. בדומה לכך, האימוץ של המודל של ESL מדידה שלנו במקום אחר ידרוש אופטימיזציה דומה כדי להבטיח את היציבות של פרמטרים המודינמיים עכבר, חמצון, אוורור, והיעדר פגיעת ריאות.
אנחנו בחרנו להשתמש באי הכללת dextran כגישה העיקרית שלנו לESL מדידה. טכניקה זו מתאימה היטב למודל שלנו, כפי שניתן לבצע מדידות ESL מרגע יחיד בזמן, שלילת חפץ תנועת ריאות ולב. בעוד שהמחקרים הקודמים של microvasculature המערכתי הציעו כי הדרת dextran נכונה אך ורק בכלי דם קטנים (<15 מיקרומטר 6), שכבר ציין את שינויי ESL concordant בכולים ל30 מיקרומטר בקוטר. לפערים אלו עשויים להיות בשל מאפיינים ספציפיים למשטח פלאורלי אופטיים.
במיטה וסקולרית מרגשת, זה הכרחי כי brightfield וניאון ההדמיה occurs בו זמנית, כמו גם עיכוב קל ברכישת תמונה (למשל סגירת תריס בין תמונות רציפות) הייתי האנושות לבלבל את המדידות של עובי ESL. בעוד השהיית אוורור עלולה להקטין זה בלבול, להשהות אינספירטורי לא ימנע לחלוטין חפץ לב תנועה או חפץ נשימה מהפצת גז בריאות מנופחות-הטרוגני, פצועות ("pendelluft") 20. אנחנו בחרנו להשתמש במפצל תמונה בו זמנית לשלוח brightfield ותמונות ניאון למצלמת CCD יחידה. גישות חלופיות עלולות לכלול שימוש במראות dichroic בו זמנית ללכוד תמונות אור וניאון משתקפים במהלך מיקרוסקופיה confocal.
דרישה קריטית נוספת של המודל שלנו היא השימוש ביעדים מיוחדים במי טבילה. יעדים אלה חייבים להיות צמצם מספרי גדול מספיק כדי לאפשר רזולוציה של הבדלים קטנים ברוחב כולים תוך maintaininגרם מרחק עבודה נאות לחדור גם לחלון בית החזה ומשטח פלאורלי. יעדים אלה, תוך זמינים, הם יקרים מאוד. השימוש בניגוד מיקרוסקופיה משתקפת אור הפרש התערבות (DIC), טכניקת brightfield שמדגיש קצות רקמות בתוליים, הוא בנוסף רצוי, כמו דסק"ש משפר את הדיוק של מדידות רוחב כלי דם.
טכניקות אלטרנטיביות קיימות לקביעת רוחב ESL ריאתי. בעוד velocimetry microsphere לא ניתן לבצע באופן מדויק על מיטה וסקולרית מרגשת, הדבקת microsphere יכולה להיות מועסקת באופן עקיף לבדיקת תקינות glycocalyx ריאתי. הראינו בעבר כי תפקידי ESL השלמים שלא לכלול במחזור microspheres ממולקולות דבקות משטח אנדותל 2. הנוכחות של הידבקות אנטי Icam-1 microsphere אל פני השטח האנדותל לכן מציינת אובדן היושרה glycocalyx / ESL. טכניקה זו אינה דורשת brightf סימולטניהדמית ield / ניאון, וגם הם יעדי צמצם מספריים גבוהים הכרחיים. עם זאת, אזהרה חשובה קיימת אחד כזה: להידבקות microsphere אנטי Icam-1 מוגברת כדי לציין אובדן glycocalyx, חייב להיות ביטוי דומה Icam-1 תא שטח שבין שליטה וקבוצות ניסוי. בעוד ביטוי Icam-1 אנדותל משטח נותר יציב מוקדם (<45 דקים ') בפציעת אלח הדם המושרית ריאות 2, ביטוי משטח סופו של דבר להגדיל באופן תלוי NF-κB 21. שימוש בהידבקות microsphere כסמן של יושרת glycocalyx, ולכן, יכול להיות תקף רק בדלקת בשלב מוקדם.
מן ראוי לציין כי בעוד טכניקות הכירורגיות ומיקרוסקופיה שלנו לא לגרום פציעת ריאות 2, לא ברור איך מתפתחים פציעת ריאות ניסויית (למשל פגיעה הנגרמת על ידי החדרת החומצה intratracheal) משפיעה על מדידות של עובי ESL. מתפתח בצקת ריאות שעלולים לבלבל את המדידות של DIC רוחב כליחדירות dextran השפעה ו / או. אי ודאות זו יכולה להיות מתנה ידי השימוש המשלים של טכניקות מרובות (למשל הדרת dextran, הדבקת microsphere, כמו גם ערכות היסטולוגית מאשרות של תוכן כלי glycosaminoglycan 2) כדי לאשר את השינויים שנצפו בESL ריאתי.
לסיכום, על ידי הרחבת הגישה כירורגית דיווחה בתחילה על ידי Tabuchi וKuebler, פתח מודל ניסוי המאפשר התבוננות המפורטת של ESL ריאתי. השימוש במודל זה אמור לאפשר להבנה טובה יותר של חשיבותו של glycocalyx האנדותל בכלי דם הריאתיים לפיזיולוגיה בבריאות ומחלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
אנו מודים לבני זוג. אראטה Tabuchi וולפגנג Kuebler (אוניברסיטת טורונטו) להוראה בדבר מיקרוסקופיה intravital. אנו מודים לאנדרו קייהיל (ניקון מכשירים) לסיוע בתכנון ויישום מיקרוסקופים. עבודה זו מומנה על ידי NIH / NHLBI מענקים P30 HL101295 וK08 HL105538 (למניה).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various | ||
References
- Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung. AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).
- Florian, J. A., et al. Heparan sulfate proteoglycan is a mechanosensor on endothelial cells. Circ. Res. 93, e136-e142 (2003).
- Chappell, D., et al. The Glycocalyx of the Human Umbilical Vein Endothelial Cell: An Impressive Structure Ex Vivo but Not in Culture. Circulation Research. 104, 1313-1317 (2009).
- Potter, D. R., Damiano, E. R. The hydrodynamically relevant endothelial cell glycocalyx observed in vivo is absent in vitro. Circ. Res. 102, 770-776 (2008).
- Weinbaum, S., Tarbell, J. M., Damiano, E. R. The Structure and Function of the Endothelial Glycocalyx Layer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 121-167 (2007).
- Pittet, M., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Kilpatrick, D. C., Graham, C., Urbaniak, S. J., Jeffree, C. E., Allen, A. K. A comparison of tomato (Lycopersicon esculentum) lectin with its deglycosylated derivative. Biochem. J. 220, 843-847 (1984).
- Smith, M. L., Long, D. S., Damiano, E. R., Ley, K. Near-wall micro-PIV reveals a hydrodynamically relevant endothelial surface layer in venules in vivo. Biophys. J. 85, 637-645 (2003).
- Vink, H., Duling, B. R. Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries. Circ. Res. 79, 581-589 (1996).
- Marechal, X., et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 29, 572-576 (2008).
- Presson, R. G. Jr, et al. Two-Photon Imaging within the Murine Thorax without Respiratory and Cardiac Motion Artifact. The American Journal of Pathology. 179, 75-82 (2011).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Meth. 8, 91-96 (2011).
- Pearse, D. B., Wagner, E. M., Permutt, S. Effect of ventilation on vascular permeability and cyclic nucleotide concentrations in ischemic sheep lungs. J. Appl. Physiol. 86, 123-132 (1999).
- Hossain, M., Qadri, S., Liu, L. Inhibition of nitric oxide synthesis enhances leukocyte rolling and adhesion in human microvasculature. Journal of Inflammation. 9, 28 (2012).
- Schmidt, E. P., et al. Soluble guanylyl cyclase contributes to ventilator-induced lung injury in mice. AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, L1056-L1065 (2008).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. J. Appl. Physiol. 28, 596-608 (1970).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J. Appl. Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Gattinoni, L., Protti, A., Caironi, P., Carlesso, E. Ventilator-induced lung injury: the anatomical and physiological framework. Crit. Care Med. 38, 539-548 (2010).
- Tabuchi, A., Kim, M., Semple, J. W., Kuebler, W. M. Acute Lung Injury Causes Pendelluft Between Adjacent Alveoli In Vivo. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, A2490 (2011).
- Roebuck, K. A., Finnegan, A. Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression. J. Leukoc. Biol. 66, 876-888 (1999).
