Summary
Endothelial glycocalyx / endothelial overflaten er ideelt studert ved hjelp intravital mikroskopi. Intravital mikroskopi er teknisk utfordrende i et bevegelig organ for eksempel lunger. Vi demonstrerer hvordan simultan lysfelt og fluorescerende mikroskopi kan brukes for å estimere endotelisk beleggtykkelse i en fritt bevegelige
Abstract
Endothelial glycocalyx er et lag av proteoglykaner og tilknyttede glykosaminoglykaner lining vaskulær lumen. In vivo er glycocalyx svært hydrert og danner en betydelig endotelial overflatelag (ESL) som bidrar til opprettholdelse av endotelfunksjon. Som det endoteliale glycocalyx ofte avvikende in vitro og går tapt under standard vev fiksering teknikker, krever et studium av ESL bruk av intravital mikroskopi. Til beste omtrentlig den komplekse fysiologi av alveolar microvasculature, er pulmonal intravital bildebehandling ideell utført på en fritt bevegelige lunge. Disse preparatene, men vanligvis lider omfattende bevegelsesartefakter. Vi demonstrerer hvordan lukket brystet intravital mikroskopi av en fritt bevegelig mus lunge kan brukes til å måle glycocalyx integritet via ESL uttrekk av fluorescensmerket-merkede høymolekylære dextraner fra endoteliale overflate. Denne ikke-recovery kirurgisk teknikk, som kreversamtidig lysfelt og fluoriserende avbildning av musen lunge, åpner for langsgående observasjon av subpleural microvasculature uten tegn på å indusere confounding lungeskade.
Introduction
Endothelial glycocalyx er en ekstracellulær lag av proteoglykaner og tilknyttede glykosaminoglykaner lining vaskulær intima. In vivo er glycocalyx svært hydrert og danner en betydelig endotelial overflatelag (ESL) som regulerer en rekke av endoteliale funksjoner inkludert fluid permeabilitet 1, nøytrofil-endotelial adhesjon 2, og mechanotransduction av væske skjærspenning 3.
Historisk har glycocalyx vært underappreciated grunnet sin aberrance i dyrkede cellepreparater 4, 5 og dens nedbrytning ved standard vev fiksering og prosessering 6. Den økende bruken 7 av intravital mikroskopi (in vivo mikroskopi, IVM) har falt sammen med økt vitenskapelig interesse i betydningen av ESL til vaskulær funksjon under helse og sykdom. ESL er usynlig for lysmikroskopi og kan ikke være lett merkes ivivo, gitt tilbøyelighet fluorescerende glycocalyx-bindende lektiner å forårsake RBC agglutinasjon 8 og dødelig lungeemboli (upubliserte observasjoner). Flere indirekte tilnærminger har derfor blitt utviklet for å utlede ESL tykkelse (og i forlengelsen, glycocalyx integritet) i ikke-bevegelige vaskulære senger som de cremasteric og mesenteric microcirculations. Disse teknikkene omfatter måling av forskjeller i sirkulerende mikropartikkel hastighet som en funksjon av avstand fra den endoteliske membran (mikropartikkel image velocimetry 9) samt måling av utelukkelsen av voluminøse, fluorescensmerket-merkede vaskulære markører (f.eks dextraner) fra endoteliale overflate (dekstran uttrekk teknikk 10, 11). Av disse teknikkene, er bare dekstran utelukkelse kan estimere ESL tykkelse fra målinger gjort på et enkelt tidspunkt. Ved samtidig å måle vaskulære bredder hjelp lysfelt mikroskopi (en bredde iclusive av "usynlig" ESL) og fluorescerende mikroskopi av en vaskulær sporstoff ekskludert fra ESL kan ESL tykkelse beregnes som en halv forskjellen mellom vaskulære bredder 2.
Bruken av en momentan mål på ESL tykkelse er velegnet for studie av pulmonal glycocalyx. Intravital mikroskopi av lunge er utfordrende, gitt betydelige lunge-og hjerte bevegelsesartefakter. Mens siste fremskritt tillate immobilisering av mus lungene i 12 vivo, 13, eksisterer bekymringer om fysiologiske virkningen av lunge stasis. Lunge immobilitet er assosiert med redusert endothelial nitrogenoksid signalering 14, en signalveien som påvirker både nøytrofile heft 15 og lungeskade 16. Videre, immobilisering av et område av lunge eksponerer omkringliggende mobile alveolene skadelige skjærkrefter (såkalte "atelectrauma"), i samsvar med de klassiske fysiologiske begrepenealveolar avhengighet 17.
I 2008 utviklet Arata Tabuchi, Wolfgang Kuebler og kolleger en kirurgisk teknikk som åpner for intravital mikroskopi av en fritt bevegelig mus lunge 18. Respiratory gjenstand som følger av denne teknikken kan være negated ved bruk av high-speed bildebehandling, inkludert samtidig måling av lysfelt og fluoriserende mikroskopi. I denne rapporten detalj vi hvordan momentant dekstran utelukkelse bildebehandling kan benyttes til å måle ESL tykkelse i subpleural mikrosirkulasjonen av en fritt-bevegelse, in vivo mus lunge. Denne teknikken kan enkelt endres for å avgjøre glycocalyx funksjon-spesifikt, muligheten for en intakt ESL å utelukke sirkulerende elementer fra endothelial overflaten. Vi har nylig brukt disse teknikker for å bestemme betydningen av pulmonal ESL integritet til utvikling av akutt lungeskade under systemiske inflammatoriske sykdommer som sepsis 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av kirurgisk Tubing, Vascular Kateter, brystveggen Window
- Intravital mikroskopi scenen. Vi skreddersydd en plexiglass scenen hvorpå bedøvet mus ligger under mikroskopi. Dette stadiet plass begge en 15 cm ved 10 cm fleksibel plast skjærebrett (hvorpå musen ligger under induksjon av anestesi, trakeostomi plassering, og venøse kateterisering) samt en tilsvarende størrelse varmeelement (plassert under skjærebrett).
- Mus thoracostomy tube forberedelse (figur 1). En 10 cm lang PE 50 rør (Intramedic, indre diameter 0,58 mm, ytre diameter 0,965 mm) er kuttet. Ene ende er festet til den butte ende av en buet 23 gauge nål, denne nålen vil bli brukt for å passere røret gjennom thorax veggen (inne → utenfor) før lukking av thorax vinduet.
Den distale enden av røret (1,5 cm i lengde, motsatt til den vedlagte 23 gaugep) er gjentatte ganger punktert av en 30 gauge nål, skape "side porter" for å lette effektiv aspirasjon av intrathoracic luft.
Denne fenestrated delen blir deretter separert fra resten av røret ved flere omkretsmessige løkker av 04:00 silke sutur, og disse løkker vil tjene som en "stopper", til slutt forankring av 1,5 cm fenestrated parti i brysthulen. - Vena venekatetre. To 15 cm lengder av PE 10 rør (Intramedic, indre diameter 0,28 mm, ytre diameter 0,61 mm) er kuttet. En skalpell brukes til skråkanten endene av røret, og dermed øke den enkle venepunksjon. Slangen spyles via en 1 ml sprøyte inneholdende 6% 150 kDa dekstran løsning (i PBS) festet til den ikke-skrå enden av slangen.
- Brystveggen vindu forberedelse (figur 2). Transparent polyvinylidene membran (New Kure Wrap, Kuresha, Tokyo) er kuttet i en oval form (hovedakse 6 cm, mindre akse 4 cm). En sirkulær 5 mm # 1 dekkglasset (Bellco) er festet til membranen ved hjelp av α-cyanoakrylat lim (Pattex flüssig, Henkel, Düsseldorf).
- . Tube til pneumotoraks induksjon ("blow tube") En 10 cm lengde av rør (indre diameter 3 mm, ytre diameter 5 mm) er festet til en 5 ml sprøyte, det motsatte enden vil bli brukt til å innføre luft inn i dyret thorax buret før brystveggen vindu engraftment.
- Sprøyte for nedsenking i vann på objektiv. En 23 gauge nål festet til en 30 ml sprøyte med destillert vann. Spissen av nålen er avstumpet (ved hjelp av en metall-fil) for å hindre skade på målet.
2. Mus Anestesi
- En mus er bedøvet med en blanding av ketamin (10 mg / ml) og xylazin (2 mg / ml), administrert intraperitonealt i en dose på 8 pl per gram mus kroppsvekt. Sedasjon inntreffer innen 3-6 min og bør ikke hindre spontan respirasjon.
- Ved hjelp av en elektrisk barberhøvel, barberinghalsen, brystet, magen og høyre side av musen.
- Med tape, feste musen til en tynn plast skjærebrett. Leder av mus skal peke mot operatøren (Figur 3). Lett spenning levert av en løkke av sutur passerer under de øvre tennene tjener til å opprettholde hodet forlengelse. Skjærebrett er plassert på en varmepute, opprettholde mus euthermia under trakeostomi og venekateter plassering.
- Våt barberte områder med 100% etanol.
- Bekreft tilstrekkelig anestesi med en hale / pote klemme. Fortsette hvis minimal respons, gi en ekstra bolus av ketamin / xylazin hvis ikke tilstrekkelig bedøvet.
3. Trakeostomi
- A 1 cm innsnitt er gjort over halsen. Underliggende bindevev er dissekert og spyttkjertler separeres og reflektert sideveis. Den sternohyoid muskel umiddelbart anterior til luftrøret er resected.
- En løkke av 4:00 sutur er avansert i henhold the luftrøret (figur 4). Loopen så kuttet, å opprette to separate tråder av sutur underliggende luftrøret. Caudal sutur skal brukes til å feste trakeostomirøret, den kraniale sutur skal brukes for å gi spenning på luftrøret under trakeostomi plassering.
- Hjelp av to fingre, er det øvre sutur grasped og skånsom spenning påføres til luftrøret. En horisontal snitt er gjort i luftrøret mellom øvre og nedre sting. Dette snittet skal krysse omtrent to tredjedeler av den tracheal omkrets. En flenset trakeostomirøret (Harvard Apparatus, 1,22 mm ytre diameter) settes inn i den ytre luftrøret og sikret på plass ved hjelp caudal tracheal sutur.
- Den trakeostomi er koblet til en volum-kontrollert små dyr respiratoren (Inspira, Harvard Apparatus), og musen er ventilert med 40% oksygen og inspirert 9 ml / kg tidalvolum (innstillinger optimalisert for å opprettholde tilstrekkelig oksygenering / ventilasjon i vårt laboratorium). Positive ende-ekspiratorisk trykk (PEEP) ikke begynt på dette punktet. Av notatet, bør ventilator innstillinger være optimalisert for å unike forhold i den enkelte laboratorier. Forskjellige lengder av overflødige rør (innskutt mellom respiratoren slangen Y-kobling og trakeostomi) kan brukes til å justere dødrom, noe som sikrer stabile alveolær ventilasjon for enhver valgt tidevolum.
4. Venøs Kateterisering
- Krysset av interne og eksterne vena jugularis kan identifiseres ved å spore distale venøse grener proksimalt. Den eksterne jugular er funnet under de reflekterte spyttkjertler, og dette kan spores proksimalt for å finne den eksterne-interne jugulare veikryss.
- Bruk milde sløv disseksjon å skille jugular krysset fra omkringliggende bindevev.
- Bruke 04:00 sting, tie av den eksterne jugularis og interne jugulare årer distale (cranial) til jugular krysset.
- Lag et lite snitt inn i carinaav jugular krysset, blødninger bør være minimal.
- To kateter kan settes trinnvis ført gjennom innsnitt og inn i den jugulare bagasjerommet. Etter en forsiktig aspirasjon for å sikre blod tilbake, er katetre sikret innenfor venen med 04:00 suturer.
- Tape venekatetre til skjærebrett for å hindre utilsiktet løsner.
5. Intravital Mouse Lung Mikroskopi Surgery (tilpasset fra Tabuchi et al. 18)
- Skjærebrett (inneholder behersket, bedøvet mus samt tapet venekatetre) er overført til intravital mikroskopi scenen, hvor de resterende kirurgiske inngrep vil bli utført. En rektal temperatur probe er plassert, og dette grensesnitt med en adaptiv varmesystem (under skjærebrett), slik at vedlikehold av mus euthermia.
- Ett jugulare venekateter er festet til en sprøytepumpe som leverer en ketamin (10 mg / ml)-xylazin (2 mg / ml)blanding ved 200 ul per time. Tilstrekkelig anestesi igjen bekreftet ved hjelp av halen / pote klemme.
- Midtlinjen innsnitt er utvidet fra nakken til xyphoid prosessen, deretter fortsetter sideveis til høyre side (figur 5).
- Bruke electrocautery er brystmuskulaturen fjernet, utsette thorax buret. Omsorg er tatt for å sikre fullstendig hemostase.
- Kryss musen rett bakben over venstre side og tape ned. Den resulterende abdominal torsjon roterer thorax litt for forenklet operasjonen.
- Plasser scenen på en 45 graders vinkel (figur 6), og dette gjør det mulig posisjonering lungen til å falle bort fra brystveggen når pneumothorax er indusert.
- 1 st rib (mest dårlig rib) er grepet med en pinsett og oppvokst, en buet tang er bluntly presset under ribben. Dette skiller parietal pleura fra brystveggen. Pleura bør forbli unpunctured.
- Bruke slag røret ogen sprøyte, er luft tvang innført mot parietal pleura. Dette fører til brudd av pleural overflate og pneumothorax uten å skade den underliggende lunge. Den underliggende lunge vil falle fra brystveggen, slik at innføring av en electrocautery tang uten å skade lungene. En reduksjon i respiratoren tidevolum er vanligvis ikke nødvendig i dette trinnet.
- Ved hjelp av electrocautery tang, dissekere brystveggen muskulaturen og på tvers av de fem th og 6 th ribbeina / parietal pleura, gjør en ~ 8 mm sirkulært hull i brystveggen. Det er viktig at komplett hemostase skal opprettholdes, som nærvær av blødning vil tilsløre mikroskopi (figur 7).
- Ved hjelp av en nål driver, setter thoracostomy slangen inn i brystveggen hullet. Nålen bør punktere brystveggen og avslutte brysthula mindreverdig og lateralt for thorax-vinduet (figur 7). Pass på å unngå punktering av membranen. Denrøret blir deretter forsiktig trukket ut av brystveggen inntil det motstand oppstår fra suturen "stopper" som ligger på kanten av fenestrated parti av røret.
- Plasser scenen flat.
- Legg 3 cm H 2 O PEEP til respiratorbehandling hjelpe lunge reexpansion.
- Lim (Pattex gel, Henkel) er plassert rundt omkretsen rundt brystet vinduet. Membranen er festet, med glass dekkglass vender eksteriøret til brysthula. Nøye (og omkretsmessig) omtrentlige membranen til limet ved hjelp av en bomull applikator.
- Mens du utfører en lunge rekruttering manøver (3 tidalvolum hvorunder PEEP ventilator porten er blokkert), er -3 mm Hg sug brukt til brystet tube. Lungen bør vedvarende omtrentlige membranen mens fritt beveger seg under tidevanns ventilasjon (figur 8).
- Høyre forben av musen er krysset over til venstre side, noe som resulterer i en venstre lateral decubitus posisjonen til musen.Svamp kiler kan brukes plasseres riktig musen slik brystet vinduet er innrettet med mikroskopi vann nedsenking objektiv.
- Destillert vann er plassert på dekkglass før mikroskopi, som åpner for visualisering av lungen med et vann-nedsenking målsetting. Vann må periodisk etterfylles gjennom avbildning.
6. Måling av Pulmonal endotel beleggtykkelse
- Umiddelbart etter brystveggen lukking får 500 pl FITC-merket 150 kDa dekstran (6% løsning i PBS) administreres via andre (ikke-anestesi) jugulare venekateter. Denne tjener som bolus volum lungeredning samt vaskulær sporstoffet etter ESL måling. Den dekstran bolus påvirker ikke nøytrofile heft eller lungeødem dannelsen 2.
- Vannet nedsenking Målet er sentrert over dekkglass. Valget av mål er essensielle for å visualisere små forskjeller i ESL tykkelse, høy Numerical blenderåpning er nødvendig (> 0,8) mens du beholder en 2 - 3 mm arbeidsavstand (slik at penetrasjon gjennom lunge vinduet og pleural overflate). Vi bruker Nikon CFI 75 LWD 16x (NA 0,8) og CFI 75 LWD 25x (NA 1.1) mål for dette formålet.
- Å måle ESL tykkelse i et bevegelig organ, er det viktig at lysfelt og fluorescerende vaskulære bredder utføres samtidig. Dette kan utføres ved hjelp av et bilde splitter (Dual View, fotometriske) som gir mulighet for samtidig opptak av reflektert lys differensial interferens kontrast (DIC, lysfelt) og FITC bilder (figur 9).
- Under en 5 sek inspiratorisk pause blir kontinuerlig avbildning utføres og registreres. Senere kan disse bildene bli anmeldt for å identifisere i fokus rammer.
- Ved hjelp av en in-rammemarkørens er subpleural microvessels (<20 mikrometer i diameter) identifisert, minst 3 microvessels sitter vanligvis på en enkelt ramme. Etter fullførelse av forsøket, DICog FITC-dextran vaskulære bredder målt (av en blindet observatør) ved gjennomsnitt lengdene av tre perpendikulære skjæringspunkter pr microvessel. Forutsatt lik ESL tykkelse på begge kantene av fartøyet, kan ESL størrelsen bli definert av en halv forskjellen DIC og FITC-dextran vaskulære bredder, som beskrevet i den representative resultater delen.
- Vanligvis kan intravital mikroskopi utføres for> 90 min uten noen bevis for lungeskade eller hypotensjon 2. Foreløpige eksperimenter bør utføres for å bekrefte mus stabilitet (blodtrykk, oksygenering, ventilasjon, lungeskade) under observasjonsperioden. Eksperimentelle medikamenter kan innføres gjennom den andre (ikke-narkose) jugular kateter på noe punkt under prosedyren.
7. Alternativ Måling av Pulmonal endotel Surface Layer Integrity
De intakte endothelial Overflatesjikt funksjoner (delvis) for å utelukke sirkulerermenter fra endoteliale overflate 2. ESL integritet kan derfor måles ved evnen til en sirkulerende element (for eksempel en fluorescerende mikrokule) å få tilgang til og samhandle med celleadhesjonsmolekyler (som ICAM-1).
- Anti-ICAM-1 merket fluorescerende mikrosfærer er forberedt før operasjonen. Streptavidin-belagte 0,97 um fluorescerende mikrosfærer blir inkubert med biotinylert anti-ICAM-1 (YN1/1.7.4 klone, 1:50, eBioscience) antistoff eller isotype kontroll i 30 minutter ved romtemperatur. Mikrosfærene vaskes tre ganger og suspendert i PBS ved 1 x 10 9 mikrokuler per ml.
- Under intravital mikroskopi blir mikrokule suspensjonen (100 ul) injisert inn i den jugulare venekateter. Etter 15 minutter av sirkulasjon, er fluorescerende bilder tatt over 5 min. Mikrosfærer immobile for> 5 min anses tilhenger og kvantifisert ved hjelp av bildebehandling.
8. Dødshjelp
<p class = "jove_content"> Etter fullførelse av prosedyren, bedøves musene avlives ved blodtapping via direkte hjertepunktur. Eutanasi er bekreftet via bilaterale pneumothoraces, hvoretter lungene er høstet og snap-frosset for senere analyser.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den eksperimentelle tilnærmingen som beskrives i trinn 1-6 vil tillate fangst av flere rammer av samtidige DIC (lysfelt) og fluorescerende bilder. Å bestemme ESL tykkelse, er opptatte bilder anmeldt av en blindet observatør etter gjennomføring av eksperimentelle protokollen. Ved hjelp av en in-rammemarkørens er subpleural microvessels (<20 mikrometer i diameter) identifisert, minst 3 microvessels sitter vanligvis på en enkelt ramme (Figur 10). Ved bildeanalyse programvare (NIS Elements, Nikon), er vaskulære bredder målt (av en blindet observatør) ved gjennomsnitt lengdene av tre vinkelrette fanger per microvessel. Som ESL er usynlig for DIC bildebehandling, DIC vaskulære bredder span endothelial membran til endotelial membran og er derfor inkluderende av ESL tykkelse 9, 10. I kontrast er FITC-dekstran (150 kDa) utelukket fra ESL. Derfor gjør FITC vaskulære bredder ikke innlemme ESL tykkelse. Forutsatt lik ESL tykksomhet på begge kantene av fartøyet, kan ESL størrelsen derfor defineres med en halv forskjellen DIC og FITC-dextran vaskulære bredder.
Flere potensielle tekniske fallgruver kan forstyrre tolkningen av eksperimentelle resultater. Tilstedeværelsen av blødning i mikroskopi feltet vil skjule både DIC og FITC visualisering av subpleural microvasculature, og derfor må man sørge for å få hemostase (med electrocautery) under vinduet plassering (5,9). I tillegg lungene kanskje ikke reapproximate thorax vinduet etter rekrutteringen manøver (5.14), dette betyr vanligvis ufullstendig omkrets vedheft av membranen rundt thorax vinduet. Dette kan vanligvis korrigeres ved reapplication av lim rundt thorax vinduet, etterfulgt av en gjentagelse lunge rekruttering manøver. Til slutt må det utvises forsiktighet for å unngå utilsiktet injeksjon av intravenøs luft inn i musa. Air emboli, selv om ikke dødelig, vil preferenti alliert reise til nondependent lunge, hindrer FITC-dekstran perfusjon av visualisert (nondependent) subpleural microvasculature.
Måling av ESL bredder krever bruk av et bilde splitter (affording simultan DIC og fluorescerende imaging) samt spesialiserte mikroskopi mål. Disse utstyr krav kan unngås med noen modifikasjoner protokoll vår. Glycocalyx integritet kan indirekte målt ved å bestemme ESL utelukkelse av sirkulerende mikrokuler fra fartøyet overflaten. Tilstedeværelsen av ESL degradering, er derfor angitt med økt subpleural mikrovaskulær fangst av mikrokuler målrettet mot endothelial overflaten adhesjonsmolekyler (som ICAM-1) (figur 11).
Figur 1.
Figur 2.
Figur 3.
Figur 4.
Figur 5.
Figur 6.
Figur 7.
Figur 8.
Figur 9.
Figur 10. Måling av mus lunge ESL tykkelse. (A) representant samtidig fanges DIC og fluorescerende bilder av musen subpleural microvasculature (skala bar, 50 mikrometer). Microvessel bredde måles ved hjelp av gjennomsnitt av tre vinkelrette lineære fanger. ESL tykkelse kan bestemmes ved en-halv forskjellen DIC (inkl ESL) og fluorescerende (eksklusive ESL)microvessel bredder. (b) DIC målinger nøyaktig identifisere subpleural åreveggen grenser, som demonstrert av nesten-identisk DIC og GFP fartøy bredde målinger utført i endothelial-fluorescerende Tie2-GFP mus (Jackson Labs). Heltrukket linje representerer linje med identitet. (C) subpleural microvasculature kan følges på langs, noe som gjenspeiles av den progressive tap av ESL tykkelse som oppstår etter intravenøs lipopolysakkarid (LPS). N = 3 mus. * P <0,05 sammenlignet med tid = 0 minutter med ANOVA.
Movie 1. Glycocalyx integritet kan bestemmes ved å vurdere for anti-ICAM-1 mikrosfære tilslutning i subpleural microvasculature. Høyhastighets konfokalmikroskopi (Nikon A1R) demonstrerer tilhenger fluorescerende mikrosfærer 45 min etter intravenøse LPS (20 mg per kg kroppsvekt). Merk at sirkulerende mikrokuler kan være occasionally sett passerer gjennom mikrosirkulasjonen. For å forbedre visualisering av (grønn fluorescerende) mikrosfære lokalisering, i trinn 6,1 mus ble forbehandlet med den vaskulære sporstoff TRITC-dekstran (150 kDa, 6%) i stedet for FITC-dekstran. Klikk her for å vise film .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenfallende med den ekspanderende bruken av in vivo mikroskopi, er det en økende forståelse for både betydelig størrelse av ESL samt sine tallrike bidrag til vaskulær funksjon. Disse nye data, men er først og fremst avledet fra studier av den systemiske vaskulatur. Faktisk bruk av in vivo mikroskopi i lungene er teknisk utfordrende, gitt betydelige lunge-og hjerte bevegelsesartefakter.
Flere siste tekniske fremskritt har tillatt for stabilisering av den bevegelige mus lunge, affording bedre anvendelse av intravital teknikker til lunge 12 mikrosirkulasjonen, 13 år. Disse metodene, men er potensielt forvirret av de fysiologiske konsekvenser av lunge immobilitet. Som lunge er teleologically et organ beregnet for kontinuerlig bevegelse, vil lunge stasis intuitivt endre pulmonal fysiologi. Faktisk er lunge stasis forbundet med endringer i endothelial nitric oksid signalering, en sti med mange nedstrøms konsekvenser i både sunn og skadde lunge 14, 16. Videre, immobilisering av ett område av lunge fagene omkringliggende alveolene skadelige skjærkrefter, i samsvar med "atelectrauma" karakteristisk for respiratoren indusere lungeskade 19. Disse og andre ennå-å-være-identifiserte konsekvenser av lunge stasis er sannsynlig å forvirre tolkning av intravital observasjoner av lunge mikrovaskulær (patho) fysiologi.
Gitt disse bekymringene, forsøkte vi å utvikle en metode som lunge ESL kan bli studert i et fritt bevegelige, in vivo mus lunge. Vi valgte å tilpasse teknikken Tabuchi og Kuebler, en tilnærming som gjør at langsgående visualisering av en fritt bevegelig mus lunge uten eggende lunge skade 18. Viktigere, inneholder vår tilnærming flere subtile endringer fra Tabuchi opprinnelige protokoll; disse alterasjoner utviklet seg fra behovet for å imøtekomme unike forhold i vårt laboratorium. Tilsvarende adopsjon av vår modell av ESL måling steder vil kreve tilsvarende optimalisering for å sikre stabilitet i mus hemodynamikk, oksygenering, ventilasjon og fravær av lungeskade.
Vi valgte å bruke dekstran ekskludering som vår primære tilnærming til ESL måling. Denne teknikken er godt egnet for vår modell, som ESL målinger kan gjøres fra en enkelt øyeblikk i tid, benektende lunge og hjerte bevegelsesartefakter. Mens tidligere studier av systemisk microvasculature har antydet at dekstran ekskludering bare nøyaktig i små fartøy (<15 mikrometer 6), har vi merket konkordant ESL endringer i fartøyer opp til 30 mikrometer i diameter. Disse avvikene kan skyldes optiske egenskaper spesifikke for pleural overflaten.
I en bevegelig vaskulær seng, er det viktig at lysfelt og fluorescerende bildebehandling occurs samtidig, som selv en kort forsinkelse i bildet oppkjøp (f.eks skodde nedleggelse mellom sekvensielle bilder) ville skjebnesvangert forvirre målinger av ESL tykkelse. Mens pause ventilasjon kan redusere denne confounding, vil en inspiratorisk pause ikke helt forhindre hjerte bevegelsesartefakter eller luftveiene gjenstand fra gass omfordeling i heterogent-oppblåst, skadde lunger ("pendelluft") 20. Vi har valgt å bruke et bilde splitter til samtidig sende lysfelt og fluorescerende bilder til ett CCD-kamera. Alternative tilnærminger potensielt omfatter bruk av dikroiske speil til samtidig fange reflektert lys og fluorescerende bilder under konfokalmikroskopi.
En ekstra kritisk etterspørselen av vår modell er bruk av spesialiserte vann-nedsenking mål. Disse målene må ha en tilstrekkelig stor numerisk apertur for å tillate oppløsning av små forskjeller i fartøyets bredder samtidig VEDLIKEHOLg tilstrekkelig arbeidsavstand å trenge både thorax vinduet og pleural overflate. Disse målene, mens tilgjengelig, er svært dyrt. Bruken av reflektert lys differensial interferens kontrast (DIC) mikroskopi, er et lysfelt teknikk som fremhever unstained vev kanter, i tillegg ønskelig, som DIC forbedrer presisjon av vaskulære bredde målinger.
Alternative teknikker finnes for fastsettelse av pulmonal ESL bredde. Mens microsphere velocimetry ikke kan være nøyaktig utført på et bevegelig vaskulær sengen, kan microsphere vedheft brukes for å indirekte teste lunge glycocalyx integritet. Vi har tidligere vist at de intakte ESL funksjonene å ekskludere sirkulerende mikrokuler fra endoteliale overflate adhesjonsmolekyler 2. Tilstedeværelsen av anti-ICAM-1 mikrokule vedheft til endotelial overflaten indikerer derfor et tap glycocalyx / ESL integritet. Denne teknikk krever ikke samtidig brightfield / fluoriserende bildebehandling, eller er høy numerisk apertur mål er nødvendig. Imidlertid eksisterer en viktig forbeholdet: for økt anti-ICAM-1 mikrokule vedheft til indikere glycocalyx tap, må det være lik ICAM-1 celleoverflate uttrykk mellom kontroll og eksperimentelle grupper. Mens ICAM-1 endothelial overflaten uttrykk stabilt tidlig (<45 min) i sepsis-indusert lungeskade 2, vil overflaten uttrykk eventuelt øke i en NF-κB avhengig måte 21. Bruk av microsphere vedheft som en markør for glycocalyx integritet, derfor kan bare være gyldig i tidlig betennelse.
Av notatet, mens våre kirurgiske og mikroskopi teknikker ikke brekning lungeskade 2, er det usikkert hvor utvikling eksperimentell lungeskade (f.eks skader forårsaket av intratrakeal syre instillasjon) påvirker målinger av ESL tykkelse. Evolving lungeødem kan potensielt forvirre DIC målinger av fartøy breddeog / eller påvirkning dekstran permeabilitet. Denne usikkerheten kan begrenses ved den komplementære bruk av flere teknikker (f.eks dekstran utelukkelse, mikrokule adhesjon, samt bekreftende histologiske vurderinger av fartøy glykosaminoglykan innholdet 2) for å bekrefte at de observerte endringer i pulmonal ESL.
I sammendraget, ved å utvide den kirurgiske tilnærming i utgangspunktet rapportert av Tabuchi og Kuebler, har vi utviklet en eksperimentell modell som gjør det mulig for detaljert observasjon av lunge ESL. Bruk av denne modellen bør gi rom for en større forståelse for betydningen av endothelial glycocalyx til pulmonal vaskulær fysiologi i helse og sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker legene. Arata Tabuchi og Wolfgang Kuebler (University of Toronto) for instruksjon om intravital mikroskopi. Vi takker Andrew Cahill (Nikon Instruments) for å få hjelp i mikroskopi design og implementering. Dette arbeidet ble finansiert av NIH / NHLBI tilskudd P30 HL101295 og K08 HL105538 (til EPS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various | ||
References
- Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung. AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).
- Florian, J. A., et al. Heparan sulfate proteoglycan is a mechanosensor on endothelial cells. Circ. Res. 93, e136-e142 (2003).
- Chappell, D., et al. The Glycocalyx of the Human Umbilical Vein Endothelial Cell: An Impressive Structure Ex Vivo but Not in Culture. Circulation Research. 104, 1313-1317 (2009).
- Potter, D. R., Damiano, E. R. The hydrodynamically relevant endothelial cell glycocalyx observed in vivo is absent in vitro. Circ. Res. 102, 770-776 (2008).
- Weinbaum, S., Tarbell, J. M., Damiano, E. R. The Structure and Function of the Endothelial Glycocalyx Layer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 121-167 (2007).
- Pittet, M., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Kilpatrick, D. C., Graham, C., Urbaniak, S. J., Jeffree, C. E., Allen, A. K. A comparison of tomato (Lycopersicon esculentum) lectin with its deglycosylated derivative. Biochem. J. 220, 843-847 (1984).
- Smith, M. L., Long, D. S., Damiano, E. R., Ley, K. Near-wall micro-PIV reveals a hydrodynamically relevant endothelial surface layer in venules in vivo. Biophys. J. 85, 637-645 (2003).
- Vink, H., Duling, B. R. Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries. Circ. Res. 79, 581-589 (1996).
- Marechal, X., et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 29, 572-576 (2008).
- Presson, R. G. Jr, et al. Two-Photon Imaging within the Murine Thorax without Respiratory and Cardiac Motion Artifact. The American Journal of Pathology. 179, 75-82 (2011).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Meth. 8, 91-96 (2011).
- Pearse, D. B., Wagner, E. M., Permutt, S. Effect of ventilation on vascular permeability and cyclic nucleotide concentrations in ischemic sheep lungs. J. Appl. Physiol. 86, 123-132 (1999).
- Hossain, M., Qadri, S., Liu, L. Inhibition of nitric oxide synthesis enhances leukocyte rolling and adhesion in human microvasculature. Journal of Inflammation. 9, 28 (2012).
- Schmidt, E. P., et al. Soluble guanylyl cyclase contributes to ventilator-induced lung injury in mice. AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, L1056-L1065 (2008).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. J. Appl. Physiol. 28, 596-608 (1970).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J. Appl. Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Gattinoni, L., Protti, A., Caironi, P., Carlesso, E. Ventilator-induced lung injury: the anatomical and physiological framework. Crit. Care Med. 38, 539-548 (2010).
- Tabuchi, A., Kim, M., Semple, J. W., Kuebler, W. M. Acute Lung Injury Causes Pendelluft Between Adjacent Alveoli In Vivo. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, A2490 (2011).
- Roebuck, K. A., Finnegan, A. Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression. J. Leukoc. Biol. 66, 876-888 (1999).
