Summary
El endotelio glicocalix / endotelial capa superficial está muy bien estudiada mediante microscopía intravital. Microscopía intravital es técnicamente difícil en un órgano en movimiento, como el pulmón. Se demuestra cómo simultánea campo claro y microscopía de fluorescencia se puede usar para estimar el espesor de capa de la superficie endotelial en un libremente moviendo
Abstract
El glicocálix endotelial es una capa de proteoglicanos y glicosaminoglicanos asociados que recubren el lumen vascular. In vivo, el glicocáliz es altamente hidratada, formando una capa sustancial superficie endotelial (ESL) que contribuye al mantenimiento de la función endotelial. A medida que el glicocalix endotelial es a menudo aberrante in vitro y se pierde durante las técnicas estándar de fijación del tejido, el estudio de la ESL requiere el uso de microscopía intravital. Para mejor se aproximan a la compleja fisiología de la microvasculatura alveolar, formación de imágenes intravital pulmonar se realiza idealmente en un pulmón de libre movimiento. Estas preparaciones, sin embargo, sufren típicamente de un artefacto de movimiento extensa. Se demuestra cómo tórax cerrado microscopía intravital de un pulmón de ratón libremente de movimiento se puede utilizar para medir la integridad del glicocálix a través de la exclusión de ESL fluorescente marcada con dextranos de alto peso molecular a partir de la superficie endotelial. Esta técnica quirúrgica no recuperación, que requierecampo claro y simultánea de imagen fluorescente de la pulmón de ratón, permite la observación longitudinal de la microvasculatura subpleural sin evidencia de la inducción de lesión pulmonar confusión.
Introduction
El glicocálix endotelial es una capa extracelular de proteoglicanos y glicosaminoglicanos asociados que recubren la íntima vascular. In vivo, el glicocáliz es altamente hidratada, formando una capa sustancial superficie endotelial (ESL) que regula una variedad de funciones endoteliales incluyendo permeabilidad del fluido 1, neutrófilos endotelial adhesión 2, y 3 de la mecanotransducción fluido esfuerzo cortante.
Históricamente, el glicocálix ha sido subestimado debido a su aberración en preparaciones de células cultivadas de 4, 5 y su degradación durante la fijación del tejido estándar y de procesamiento 6. El creciente uso de la microscopía intravital 7 (microscopía in vivo, IVM) ha coincidido con mayor interés científico en la importancia de la ESL para la función vascular en la salud y la enfermedad. El ESL es invisible para microscopía de luz y no pueden ser fácilmente etiquetados enin vivo, dada la propensión de fluorescentes glicocálix lectinas de unión a causar aglutinación de RBC 8 y embolia pulmonar no fatal (observaciones no publicadas). Varios enfoques indirectos, se han desarrollado para deducir espesor ESL (y, por extensión, la integridad glicocáliz) que no se mueven en los lechos vasculares tales como los microcirculations cremastéricos y mesentérica. Estas técnicas incluyen la medición de las diferencias en la velocidad de circulación de micropartículas como una función de la distancia de la membrana endotelial (velocimetría de imagen de micropartículas 9), así como la medición de la exclusión de los voluminosos, marcadas con fluorescencia marcadores vasculares (por ejemplo dextranos) de la superficie endotelial (técnica de exclusión de dextrano 10, 11). De estas técnicas, sólo la exclusión de dextrano es capaz de estimar ESL espesor de las mediciones realizadas en un solo punto en el tiempo. Midiendo simultáneamente anchuras vasculares usando microscopía de campo claro (una anchura enconcluyente de la "invisible" ESL) y microscopía de fluorescencia de un trazador vascular excluidos de la ESL, espesor ESL se puede calcular como la mitad de la diferencia entre las anchuras de 2 vasculares.
El uso de una medida instantánea de espesor ESL es muy adecuado para el estudio de la glicocálix pulmonar. Microscopía intravital del pulmón es un reto, dado artefacto significativo movimiento pulmonar y cardiaca. Aunque los avances recientes permiten la inmovilización de los pulmones del ratón in vivo 12, 13, existen dudas acerca del impacto fisiológico de pulmón estasis. Inmovilidad de pulmón se asocia con disminución de óxido nítrico endotelial señalización 14, una vía de señalización que afecta tanto a la adhesión de neutrófilos 15 y lesión pulmonar 16. Además, la inmovilización de un área de pulmón expone que rodea a los alvéolos móviles perjudiciales fuerzas de cizallamiento (la denominada "atelectrauma"), de acuerdo con los conceptos clásicos fisiológicos deinterdependencia alveolar 17.
En 2008, Arata Tabuchi, Kuebler Wolfgang y sus colegas desarrollaron una técnica quirúrgica que permite la microscopía intravital de un pulmón de ratón con libertad de movimiento 18. Artefacto respiratorio resultante de esta técnica puede ser negado por el uso de imágenes de alta velocidad, incluyendo la medición simultánea de campo claro y microscopía fluorescente. En este informe, se detalle cómo imagen instantánea exclusión dextrano se puede emplear para medir el espesor de ESL en la microcirculación subpleural de un pulmón de ratón de libre movimiento, in vivo. Esta técnica se puede modificar fácilmente para determinar glicocálix función, específicamente, la capacidad de un intacta ESL para excluir circulante elementos de la superficie endotelial. Recientemente hemos usado estas técnicas para determinar la importancia de la integridad pulmonar ESL para el desarrollo de lesión pulmonar aguda durante enfermedades inflamatorias sistémicas tales como sepsis 2.
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Protocol
1. Preparación de tubos quirúrgicos, catéteres vasculares, Ventana pared torácica
- Etapa microscopía intravital. Hemos hecho a medida de una etapa de plexiglás sobre la que se encuentra el ratón anestesiado durante la microscopía. Esta etapa se adapta tanto a un 15 cm por 10 cm flexible, tabla de cortar de plástico (en la que el ratón se encuentra durante la inducción de la anestesia, la colocación de traqueotomía, y el cateterismo venoso), así como un elemento de calentamiento de tamaño similar (situado debajo de la tabla de cortar).
- Ratón toracostomía preparación del tubo (Figura 1). Una longitud de 10 cm de tubo PE 50 (Intramedic, diámetro interno 0,58 mm, diámetro exterior 0,965 mm) se corta. Un extremo está unido al extremo romo de una aguja de calibre curvo 23; esta aguja se utiliza para pasar el tubo a través de la pared torácica (interior → exterior) antes del cierre de la ventana torácica.
El extremo distal del tubo (1,5 cm de longitud, opuestas a la adjunta calibre 23aguja) es repetidamente pinchado con una aguja de calibre 30, la creación de "puertos secundarios" para facilitar una eficaz aspiración de aire intratorácica.
Esta porción fenestrado es entonces separada del resto del tubo por varios bucles circunferenciales de sutura de seda 4:00; estos bucles servirá como un "tapón", en última instancia, el anclaje de los 1,5 cm fenestrado porción dentro de la cavidad torácica. - Catéteres venosos yugulares. Dos 15 cm de longitud de tubo de PE 10 (Intramedic, diámetro interno 0,28 mm, diámetro exterior 0,61 mm) se cortan. Se utiliza un bisturí para biselar los extremos del tubo, lo que aumenta la facilidad de la venopunción. El tubo se vacía a través de una jeringa de 1 ml que contenía 6% 150 kDa solución de dextrano (en PBS) unido al extremo no biselado de la tubería.
- Chest preparación ventana de la pared (Figura 2). Membrana transparente de polivinilideno (New Kure Wrap, Kuresha, Tokio) se corta en una forma ovalada (eje principal 6 cm, eje menor 4 cm). Una circular de 5 mm # 1 cubreobjetos (Bellco) se fija a la membrana utilizando α-cianoacrilato pegamento (Pattex flüssig, Henkel, Düsseldorf).
- . Tubo para la inducción de neumotórax ("tubo de soplado") A 10 cm de longitud de tubo (diámetro interior 3 mm, diámetro exterior de 5 mm) se une a una jeringa de 5 ml, y el extremo opuesto se utiliza para introducir aire dentro de la jaula para animales torácica antes de injerto ventana de la pared torácica.
- Jeringa para la inmersión en agua de objetivo. Una aguja de calibre 23 está unido a una jeringa de 30 ml que contiene agua destilada. La punta de la aguja está embotado (usando una lima de metal) con el fin de evitar daños en el objetivo.
2. Ratón Anestesia
- Un ratón se anestesia con una mezcla de ketamina (10 mg / ml) y xilazina (2 mg / ml), administrado por vía intraperitoneal a una dosis de 8 l por gramo de peso corporal del ratón. La sedación se produce a menos de 3 - 6 min y no debe impedir la respiración espontánea.
- Usando una máquina de afeitar eléctrica, afeitarsela garganta, el pecho, el abdomen, y el lado derecho del ratón.
- Con cinta, asegure el ratón a un tablero plástico de corte fino. El jefe del ratón debe apuntar hacia el operador (Figura 3). Tensión suave proporcionada por un bucle de sutura que pasa por debajo de los dientes superiores sirve para mantener la extensión de la cabeza. El tablero de corte se coloca sobre una almohadilla térmica, manteniendo euthermia ratón durante la traqueotomía y la colocación del catéter venoso.
- Moje las zonas rasuradas con un 100% de etanol.
- Confirme anestesia adecuada con una pizca de cola / pata. Proceda si la respuesta mínima, proporcionar un bolo adicional de si no ketamina / xilazina adecuadamente anestesiado.
3. Traqueostomía
- Se hace una incisión de 1 cm sobre la garganta. Tejido conectivo subyacente se disecciona, y las glándulas salivales se separan y se refleja lateralmente. El músculo esternohioideo inmediatamente anterior a la tráquea se reseca.
- Un bucle de sutura 04:00 se hace avanzar bajo the tráquea (Figura 4). El bucle se corta entonces, la creación de dos filamentos separados de sutura que subyacen a la tráquea. La sutura de caudal se utilizan para asegurar el tubo de traqueotomía; la sutura craneal se utiliza para proporcionar la tensión en la tráquea durante la colocación de traqueotomía.
- Usando dos dedos, la sutura superior es agarrado y ligera tensión se aplica a la tráquea. Una incisión horizontal en la tráquea superior e inferior entre las suturas. Esta incisión debe cruzar aproximadamente dos tercios de la circunferencia traqueal. Un tubo de traqueotomía con pestaña (Harvard Apparatus, 1,22 mm de diámetro exterior) se inserta en la tráquea distal y se fija en su lugar usando la sutura traqueal caudal.
- La traqueostomía está conectado a un ventilador para animales volumen controlado pequeño (Inspira, Harvard Apparatus), y el ratón se ventila con 40% de oxígeno inspirado y 9 ml / kg volúmenes corrientes (ajustes optimizados para mantener una adecuada oxigenación / ventilación en nuestro laboratorio). Positiva presión espiratoria final (PEEP) no se comienza en este punto. Es de destacar que los parámetros del ventilador debe ser optimizado para las condiciones únicas dentro de cada laboratorio. Diferentes longitudes de tubo redundante (interpuesto entre el tubo del ventilador conector en Y y de traqueotomía) se puede utilizar para ajustar el espacio muerto, lo que garantiza la ventilación alveolar estable para cualquier volumen tidal elegido.
4. Cateterismo Venoso
- La unión de la vena yugular interna y externa pueden ser identificadas mediante el seguimiento de las ramas distales venosa proximal. La yugular externa se encuentra debajo de las glándulas salivales se refleja, lo que puede atribuirse proximalmente para encontrar el cruce yugular externa-interna.
- Use disección roma suave para separar la unión yugular de tejido conectivo circundante.
- Con suturas 4:0, ligar las venas yugulares externas yugular interna y distales (craneal) hasta el cruce yugular.
- Haga una pequeña incisión en la carinade la unión yugular, sangrado debe ser mínimo.
- Dos catéteres puede ser incrementalmente avanzar a través de la incisión y en el tronco yugular. Después de la aspiración suave para garantizar el retorno de sangre, catéteres se sujeta dentro de la vena mediante suturas 04:00.
- Catéteres venosos cinta a la tabla de cortar para prevenir contra desplazamiento accidental.
5. Pulmón de ratones Microscopía intravital Cirugía (adaptado de Tabuchi et al. 18)
- El tablero de corte (que contiene el ratón contenida, anestesiados, así como grabadas catéteres venosos) es la transición a la etapa de microscopía intravital, donde las intervenciones quirúrgicas restantes se llevará a cabo. Una sonda de temperatura rectal se coloca; Esto se relaciona con un sistema de calefacción de adaptación (que se encuentra debajo de la tabla de corte), lo que permite el mantenimiento de euthermia ratón.
- Un catéter venoso yugular está unido a una bomba de jeringa que proporciona una mezcla de cetamina (10 mg / ml)-xilazina (2 mg / ml)mezcla a 200 l por hora. Anestesia adecuada se confirma de nuevo usando la cola / pata pellizco.
- La incisión de línea media se extiende desde el cuello hasta el apéndice xifoides, procediendo después lateralmente hacia el lado derecho (Figura 5).
- Usando electrocauterización, la musculatura del pecho se retira, dejando al descubierto la caja torácica. Se tiene cuidado de asegurar la hemostasis completa.
- Cruce pata trasera derecha del ratón sobre el lado izquierdo y cinta adhesiva. La torsión resultante abdominal gira ligeramente el tórax, la mejora de la facilidad de la cirugía.
- Coloque el escenario en un ángulo de 45 grados (Figura 6), esta posición permite que el pulmón se apartarán de la pared del pecho una vez que el neumotórax es inducido.
- La costilla st 1 (costilla más inferior) se sujeta con una pinza y se crió; unas pinzas curvas es empujado bruscamente por debajo de la costilla. Esto separa pleura parietal de la pared torácica. La pleura debe permanecer unpunctured.
- Uso del tubo de soplado yuna jeringa, el aire es introducido a la fuerza en contra de la pleura parietal. Esto conduce a la ruptura de la superficie pleural y neumotórax sin dañar el pulmón subyacente. El pulmón subyacente caerá lejos de la pared del pecho, lo que permite la introducción de un fórceps de electrocauterización sin dañar el pulmón. Una disminución en el volumen tidal ventilador no se requiere típicamente durante este paso.
- Usando una pinza electrocauterio, diseccionar la musculatura de la pared torácica y cortar a través de las 5 ª y 6 ª costillas / pleura parietal, lo que hace un ~ 8 mm agujero circular en la pared torácica. Es esencial que se mantenga una hemostasia completa, como la presencia de sangrado se oscurecen microscopía (Figura 7).
- Utilizando el controlador de aguja, inserte el tubo de toracostomía en el agujero de la pared torácica. La aguja debe perforar la pared del pecho y salir de la cavidad torácica inferior y lateral a la ventana torácica (Figura 7). Tenga cuidado de no perforar el diafragma. Latubo entonces se tira suavemente de la pared del pecho hasta que ocurre la resistencia de la sutura "tapón" situado en el borde de la parte de orificios en el tubo.
- Coloque la etapa plana.
- Añadir 3 cm H 2 O de PEEP al ventilador para ayudar a ayudar reexpansión pulmonar.
- Pegamento (Pattex gel, Henkel) se coloca circunferencialmente alrededor de la ventana de pecho. La membrana se une, con la hoja de la cubierta exterior de vidrio que da a la cavidad torácica. Cuidadosamente (y circunferencialmente) aproximada de la membrana para el pegamento mediante un aplicador de algodón.
- Durante la realización de una maniobra de reclutamiento pulmonar (3 volúmenes de marea durante el cual el puerto de ventilador PEEP está tapada), -3 mm Hg de succión se aplica al tubo de pecho. El pulmón debe persistentemente se aproximan a la membrana mientras se mueven libremente durante la ventilación tidal (Figura 8).
- La pata delantera derecha del ratón se cruzaron para el lado izquierdo, lo que resulta en una posición de decúbito lateral izquierdo del ratón.Cuñas de esponja puede utilizarse para colocar correctamente el ratón por lo que la ventana de pecho está alineado con el objetivo microscopía de inmersión en agua.
- El agua destilada se coloca en la hoja de la cubierta antes de la microscopía, lo que permite la visualización del pulmón utilizando un objetivo de inmersión en agua. El agua tendrá que ser intermitente repone durante todo imágenes.
6. Medición de la pulmonar Espesor Capa superficial endotelial
- Inmediatamente después de cierre de la pared del pecho, 500 l marcado con FITC 150 kDa dextrano (6% solución en PBS) se administra a través del catéter venoso segundos (sin anestesia) yugular. Este bolo sirve como el volumen de reanimación, así como el marcador vascular para ESL medición. El bolo dextrano no influye en la adhesión de neutrófilos o la formación de edema pulmonar 2.
- El objetivo de inmersión en agua está centrado sobre el cubreobjetos. La elección de los objetivos es esencial para visualizar las pequeñas diferencias en el grosor de ESL, un alto Numerical abertura que se necesita (> 0,8), mientras que todavía mantiene un 2 a 3 mm de distancia de trabajo (que permite la penetración a través de la ventana de pulmón y la superficie pleural). Usamos la Nikon CFI 75 LWD 16x (NA 0,8) y TPI 75 LWD 25x (NA 1.1) objetivos para este propósito.
- Para medir con precisión espesor ESL en un órgano móvil, es esencial que los anchos de campo claro y fluorescencia vasculares se realizan simultáneamente. Esto se puede conseguir utilizando un divisor de la imagen (Dual View, Photometrics) que permite la captura simultánea de la luz reflejada de contraste de interferencia diferencial (DIC, claro) y las imágenes de FITC (Figura 9).
- Durante una pausa de 5 segundos inspiratorio, continua de imágenes se lleva a cabo y se registra. Posteriormente, estas imágenes pueden ser revisados para identificar en los cuadros de enfoque.
- El uso de un marco de enfoque, subpleural microvasos (<20 m de diámetro) se identifican, al menos 3 microvasos se encuentran típicamente en un solo marco. Después de la terminación del experimento, DICy FITC-dextrano anchuras vasculares se miden (por un observador ciego) promediando las longitudes de tres intercepta perpendiculares por los microvasos. Suponiendo igual espesor ESL en ambos bordes de la embarcación, el tamaño de ESL puede ser definida por la mitad de la diferencia entre la DIC y FITC-dextrano anchuras vasculares, como se describe en la sección de resultados representativos.
- Típicamente, la microscopía intravital se puede realizar durante> 90 min sin ninguna evidencia de lesión pulmonar o hipotensión 2. Los experimentos preliminares se realizaron para confirmar la estabilidad del ratón (presión arterial, la oxigenación, la ventilación, la lesión pulmonar) durante el período de observación. Los medicamentos experimentales pueden ser introducidos a través del segundo catéter (no anestesia) yugular en cualquier momento durante el procedimiento.
7. La medición alternativa de la integridad del endotelio pulmonar capa superficial
Las funciones endoteliales intactas capa superficial (en parte) para excluir circulanteción elementos de la superficie endotelial 2. Integridad ESL por lo tanto se puede medir por la capacidad de un elemento de circulación (por ejemplo, una microesfera fluorescente) para acceder e interactuar con moléculas de adhesión (tales como ICAM-1).
- Anti-ICAM-1 marcado con microesferas fluorescentes se preparan antes de la cirugía. Recubiertas de estreptavidina 0,97 micras microesferas fluorescentes son incubadas con biotina de control de anti-ICAM-1 (clon YN1/1.7.4, 1:50, eBioscience) o isotipo de anticuerpo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las microesferas se lavaron tres veces y se suspendieron en PBS a 1 x 10 9 microesferas por ml.
- Durante microscopía intravital, la suspensión de microesferas (100 l) se inyecta en el catéter venoso yugular. Después de 15 min de circulación, imágenes fluorescentes se capturaron más de 5 min. Inmóvil durante> 5 min microesferas se considera adherente y se cuantificó usando software de procesamiento de imágenes.
8. Eutanasia
<clase p = "jove_content"> Después de la finalización del procedimiento, los ratones anestesiados son sacrificados por desangrado mediante punción cardiaca directa. La eutanasia se confirmó a través de neumotórax bilateral, después de lo cual los pulmones se cosechan y se congelaron rápidamente para su posterior análisis.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El método experimental descrito en los pasos 1-6 se permitir la captura de fotogramas múltiples de DIC simultánea (claro) y las imágenes fluorescentes. Para determinar el espesor ESL, las imágenes grabadas se revisan por un observador ciego después de la finalización del protocolo experimental. El uso de un marco de enfoque, subpleural microvasos (<20 m de diámetro) se identifican, por lo menos 3 microvasos se encuentran típicamente en un solo cuadro (Figura 10). El uso de software de análisis de imágenes (Elementos NIS, Nikon), el ancho se miden vasculares (por un observador ciego) promediando las longitudes de los tres intercepciones perpendiculares por los microvasos. Como la ESL es invisible para formación de imágenes DIC, DIC anchuras vasculares abarcan la membrana endotelial de la membrana endotelial y por lo tanto son inclusive de espesor ESL 9, 10. En contraste, la FITC-dextrano (150 kDa) se excluye de la ESL. Por lo tanto, el ancho de FITC vasculares no incorporan espesor ESL. Suponiendo igual espesor ESLNess en ambos bordes de la embarcación, por lo tanto, el tamaño de ESL puede ser definida por la mitad de la diferencia entre la DIC y FITC-dextrano anchuras vasculares.
Varios obstáculos técnicos potenciales pueden interferir con la interpretación de los resultados experimentales. La presencia de hemorragia en el campo de la microscopía se oscurecen tanto la visualización DIC y FITC de la microvasculatura subpleural, por lo tanto, se debe tener cuidado para obtener la hemostasia (usando electrocauterización) durante la colocación de ventana (5,9). Además, el pulmón no podría reaproximar la ventana torácica después de la maniobra de reclutamiento (5,14), lo que normalmente indica la adherencia incompleta circunferencial de la membrana alrededor de la ventana torácica. Esto se puede corregir por la reaplicación de pegamento alrededor de la ventana torácica, seguida por una maniobra de reclutamiento pulmonar de repetición. Por último, se debe tener cuidado para evitar la inyección de aire accidental intravenosa en el ratón. Embolia de aire, aunque no fatal, se preferenti aliado viajes al pulmón proclive, evitando FITC-dextrano perfusión del visualizado (no dependiente) microvasculatura subpleural.
La medición de las anchuras de ESL requiere el uso de un divisor de la imagen (obteniéndose imágenes simultáneas DIC y fluorescentes), así como objetivos especializados microscopía. Estas demandas de equipos se pueden evitar con algunas modificaciones en el protocolo. Integridad glicocálix puede ser medida indirectamente mediante la determinación de la exclusión de ESL circulante microesferas a partir de la superficie del recipiente. La presencia de la degradación de ESL, por lo tanto, está indicado por el aumento de la captura subpleural microvascular de microesferas dirigidos contra moléculas de la superficie de adhesión endoteliales (tales como ICAM-1) (Figura 11).
Figura 1.
Figura 2.
Figura 3.
Figura 4.
Figura 5.
Figura 6.
Figura 7.
Figura 8.
La Figura 9.
Figura 10. Medición de ratón pulmonar espesor ESL. (A) Representante simultáneamente imágenes de cámara DIC y fluorescente de la microvasculatura ratón subpleural (barra de escala, a 50 micras). Anchura de microvasos se mide utilizando el promedio de tres intercepta perpendiculares lineales. ESL espesor puede ser determinada por la mitad de la diferencia entre DIC (inclusive de la ESL) y fluorescente (exclusivo de la ESL)anchos de microvasos. (b) las mediciones de DIC identificar con precisión subpleurales fronteras pared del vaso, como se demuestra por la DIC casi idéntica y GFP medidas de anchura buque efectuada endotelial fluorescentes-Tie2-GFP ratones (Jackson Labs). La línea continua representa la línea de identidad. (C) La microvasculatura subpleural puede ser seguido longitudinalmente, como se evidencia por la pérdida progresiva de espesor ESL que ocurre después de lipopolisacárido intravenosa (LPS). N = 3 ratones. * P <0,05 en comparación con el tiempo = 0 min por ANOVA.
Película 1. Integridad glicocálix puede determinarse mediante la evaluación de la adherencia de microesferas anti-ICAM-1 dentro de la microvasculatura subpleural. Alta velocidad microscopía confocal (Nikon A1R) demuestra adherente microesferas fluorescentes 45 min después de LPS por vía intravenosa (20 mg por kg de peso corporal). Tenga en cuenta que circula microesferas puede ser occasionally visto pasar a través de la microcirculación. Para mejorar la visualización de los (verde fluorescente) de microesferas de localización, en el paso 6,1 ratones fueron pretratados con el marcador vascular TRITC-dextrano (150 kDa, 6%) en lugar de FITC-dextrano. Haga clic aquí para ver la película .
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Discussion
Coincidiendo con la expansión del uso de microscopía in vivo, hay una creciente apreciación tanto para el gran tamaño de la ESL, así como sus numerosas contribuciones a la función vascular. Estos datos emergentes, sin embargo, se derivan principalmente de estudios de la vasculatura sistémica. En efecto, el uso de microscopía in vivo en el pulmón es técnicamente difícil, dado artefacto significativo movimiento pulmonar y cardíaco.
Varios avances técnicos recientes han permitido para la estabilización del pulmón del ratón en movimiento, proporcionando una mejor aplicación de las técnicas de intravital a la microcirculación pulmonar 12, 13. Estos enfoques, sin embargo, son potencialmente confundidos por las ramificaciones fisiológicas de inmovilidad pulmón. A medida que el pulmón es un órgano teleológicamente destinada a movimiento continuo, pulmón estasis intuitivamente alterar la fisiología pulmonar. En efecto, la estasis de pulmón está asociado con alteraciones en el endotelio nitric óxido de señalización, de una vía con numerosas consecuencias aguas abajo, tanto en el pulmón sano y lesionado 14, 16. Además, la inmovilización de un área de los sujetos que rodean los alvéolos pulmonares a fuerzas de cizallamiento perjudiciales, de acuerdo con el "atelectrauma" característica de ventilador inducir lesión pulmonar 19. Estos y otros todavía-a-ser-identificado consecuencias de pulmón estasis es probable que confundir la interpretación de las observaciones intravital de microvascular pulmonar (pato) fisiología.
Teniendo en cuenta estas preocupaciones, hemos tratado de desarrollar un método por el cual el ESL pulmonar podría ser estudiado en un movimiento libre, el pulmón de ratón in vivo. Hemos elegido para adaptar la técnica de Tabuchi y Kuebler, un enfoque que permite la visualización longitudinal de un pulmón de ratón que se mueve libremente sin incitar a la lesión pulmonar 18. Es importante destacar que nuestro enfoque tiene varias alteraciones sutiles del protocolo original de Tabuchi; estas alteracionesciones evolucionaron a partir de la necesidad de adaptarse a las condiciones únicas dentro de nuestro laboratorio. Del mismo modo, la adopción de nuestro modelo de medición de ESL en otra parte requerirá la optimización similar para asegurar la estabilidad de la hemodinámica del ratón, la oxigenación, la ventilación y la ausencia de lesión pulmonar.
Hemos elegido utilizar la exclusión de dextrano como nuestro enfoque principal para ESL medición. Esta técnica es muy adecuada para nuestro modelo, ya que las mediciones de ESL se puede hacer de un momento único en el tiempo, negando artefacto de movimiento pulmonar y cardíaco. Mientras que los estudios anteriores de la microvasculatura sistémica han sugerido que la exclusión de dextrano sólo es precisa en vasos pequeños (<15 micras 6), hemos observado cambios concordantes de ESL en buques de hasta 30 micras de diámetro. Estas discrepancias pueden deberse a las características ópticas específicas a la superficie pleural.
En un lecho vascular en movimiento, es esencial que campo claro y fluorescencia o formación de imágenesccurs simultáneamente, ya que incluso un breve retraso en la adquisición de imágenes (por ejemplo, el cierre del obturador entre las imágenes secuenciales) fatalmente sería confundir las mediciones de espesor de ESL. Durante la pausa de ventilación puede reducir esta confusión, una pausa inspiratoria no evitará completamente artefactos de movimiento cardíaco o respiratorio artefacto redistribución de gas en forma heterogénea-inflados, los pulmones lesionados ("pendelluft") 20. Hemos optado por utilizar un divisor de imagen para enviar al mismo tiempo claro y las imágenes fluorescentes para una sola cámara CCD. Los enfoques alternativos podrían incluir el uso de espejos dicroicos para capturar simultáneamente imágenes de luz reflejada y fluorescente durante la microscopía confocal.
Una demanda adicional crítico de nuestro modelo es el uso de inmersión en agua especializadas objetivos. Estos objetivos deben tener una apertura numérica suficientemente grande para permitir la resolución de pequeñas diferencias en los vasos anchos sin dejar de MANTENIMIEg una distancia adecuada de trabajo para penetrar tanto en la ventana torácica y la superficie pleural. Estos objetivos, mientras que están disponibles, son muy caros. El uso de la luz reflejada diferencial de contraste de interferencia (DIC) microscopía, una técnica de campo claro que resalta los bordes de tejido sin teñir, es además deseable, ya que mejora la DIC precisión de las mediciones de ancho vasculares.
Las técnicas alternativas existen para la determinación de la anchura pulmonar ESL. Mientras que la velocimetría de microesferas no pueden ser adecuadamente realizada en un lecho vascular en movimiento, la adhesión de microesferas se pueden emplear para probar indirectamente la integridad glicocálix pulmonar. Hemos demostrado anteriormente que las funciones intactas ESL para excluir circulante microesferas a partir de las moléculas endoteliales de superficie de adhesión 2. La presencia de anticuerpos anti-ICAM-1 de adhesión de microesferas a la superficie endotelial por lo tanto, indica una pérdida de glicocálix / ESL integridad. Esta técnica no requiere brightf simultáneaield / fluorescente de imágenes, ni son objetivos de alta apertura numérica es necesario. Sin embargo, existe una importante advertencia: para aumento de la adhesión anti-ICAM-1 para indicar la pérdida de microesferas glucocáliz, debe haber células similar ICAM-1 expresión en la superficie entre el control y los grupos experimentales. Mientras que la ICAM-1 expresión en la superficie endotelial se mantuvo estable temprana (<45 min) en la sepsis inducida por la lesión pulmonar 2, la expresión de superficie eventualmente aumentar de una manera dependiente de NF-kB 21. El uso de la adhesión de microesferas como un marcador de la integridad glucocáliz, por lo tanto, sólo puede ser válida durante la inflamación temprana.
De nota, mientras que nuestras técnicas quirúrgicas y microscopía de no provocar lesión pulmonar 2, no se sabe cómo la evolución de la lesión pulmonar experimental (por ejemplo, lesión inducida por la instilación intratraqueal de ácido) influye en las mediciones del espesor ESL. La evolución de edema pulmonar potencialmente podrían confundir las mediciones de ancho DIC buquey / o permeabilidad influencia dextrano. Esta incertidumbre puede ser mitigado por el uso complementario de múltiples técnicas (por ejemplo, la exclusión de dextrano, la adhesión de las microesferas, así como confirmatorias evaluaciones histológicas del buque contenido de glicosaminoglicano 2) para confirmar los cambios observados en la ESL pulmonar.
En resumen, mediante la ampliación de la vía de abordaje inicialmente reportado por Tabuchi y Kuebler, hemos desarrollado un modelo experimental que permite la observación detallada de la pulmonar ESL. El uso de este modelo deberá tener una mayor comprensión de la importancia de la glicocálix endotelial a la fisiología vascular pulmonar en la salud y la enfermedad.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Agradecemos a los Dres. Arata Tabuchi y Wolfgang Kuebler (Universidad de Toronto) para la instrucción con respecto a la microscopía intravital. Damos las gracias a Andrew Cahill (Nikon Instruments) para la asistencia en el diseño e implementación de microscopía. Este trabajo fue financiado por el NIH / NHLBI subvenciones P30 HL101295 y K08 HL105538 (a EPS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various | ||
References
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