Summary
Den endotel glykokalyx / endoteliala ytskiktet är idealiskt studeras med hjälp intravital mikroskopi. Intravital mikroskopi är tekniskt utmanande på ett rörligt organ såsom lungan. Vi visar hur samtidig ljusfält och fluorescensmikroskopi kan användas för att uppskatta endotel tjocklek ytskikt i en fritt röra
Abstract
Den endoteliala glykokalyx är ett skikt av proteoglykaner och tillhörande glykosaminoglykaner kantar vaskulära lumen. In vivo är glykocalyx mycket hydratiserade, bildar en betydande endotelial ytskikt (ESL) som bidrar till att upprätthålla endotelfunktion. Eftersom endoteliala glykokalyx ofta avvikande in vitro och förloras under standardtekniker vävnad fixering kräver studie av ESL användning av intravital mikroskopi. För att bäst approximerar komplexa fysiologi alveolära mikrovaskulaturen är pulmonell intravital avbildning helst utförs på en fritt rörlig lunga. Dessa preparat är dock typiskt lider omfattande rörelseartefakt. Vi visar hur slutna kista intravital mikroskopi av en fritt rörlig-muslunga kan användas för att mäta glykokalyx integritet genom ESL uteslutning av fluorescensmärkta högmolekylära dextraner från endotelytan. Denna icke-recovery kirurgisk teknik, som kräversamtidig ljusfält och fluorescerande avbildning av muslunga, möjliggör longitudinell observation av subpleural mikrovaskulaturen utan tecken på att framkalla confounding lungskada.
Introduction
Den endoteliala glykokalyx är en extracellulär skikt av proteoglykaner och tillhörande glykosaminoglykaner kantar vaskulära intiman. In vivo är glykocalyx mycket hydratiserade, bildar en betydande endotelial ytskikt (ESL) som reglerar en mängd endoteliala funktioner inklusive fluidumpermeabilitet 1, neutrofil-endotel vidhäftning 2, och mechanotransduction av vätska skjuvspänning 3.
Historiskt har glykokalyx varit underskattad på grund av dess aberrance i odlade cellpreparat 4, 5 och dess nedbrytning under vanlig vävnad fixering och bearbetning 6. Den ökande användningen 7 av intravital mikroskopi (in vivo mikroskopi, IVM) har sammanfallit med ökad vetenskaplig intresse för betydelsen av ESL till vaskulär funktion under hälsa och sjukdom. ESL är osynlig för ljusmikroskopi och kan inte lätt märkasvivo tanke benägenhet fluorescerande glykokalyx-bindande lektiner för att orsaka agglutination RBC 8 och dödlig lungemboli (opublicerade observationer). Flera indirekta metoder har därför utvecklats för att härleda ESL tjocklek (och i förlängningen glykokalyx integritet) i icke-rörliga kärlbäddar såsom cremasteric och mesenteriska microcirculations. Dessa tekniker inkluderar mätning av skillnader i cirkulerande mikropartikel hastighet som en funktion av avståndet från endoteliala membranet (mikropartikel bild velocimetry 9) samt mätning av uteslutandet av skrymmande, fluorescensmärkta vaskulära markörer (t.ex. dextraner) från endotelytan (dextran uteslutning teknik 10, 11). Av dessa tekniker är bara dextran utanförskap som kan uppskatta ESL tjocklek från mätningar gjorda på en enda tidpunkt. Genom att samtidigt mäta vaskulära bredder med brightfield mikroskopi (en bredd iclusive av "osynliga" ESL) och fluorescensmikroskopi av en vaskulär spårämne uteslutits från ESL, kan ESL tjocklek beräknas som hälften av skillnaden mellan vaskulära bredder 2.
Användningen av en momentan mätning av ESL tjocklek är väl lämpad för studier av pulmonell glykokalyx. Intravital mikroskopi av lungan är utmanande, med tanke på betydande pulmonell och hjärt rörelseartefakt. Medan nya framsteg tillåter immobilisering av mus lungor in vivo 12, 13, existerar oro över fysiologiska effekterna av lung stasis. Lung orörlighet är förknippad med minskad endotelial kväveoxid signalering 14, en signalväg som påverkar både neutrofiladhesion 15 och lungskada 16. Dessutom, immobilisering av ett område av lungan exponerar omgivande mobila alveoler till skadliga skjuvkrafter (så kallade "atelectrauma"), i enlighet med de klassiska fysiologiska begreppenalveolär beroende 17.
Under 2008 utvecklade Arata Tabuchi, Wolfgang Kuebler och kollegor en kirurgisk teknik som möjliggör intravital mikroskopi av ett fritt rörlig muslunga 18. Andningsskydd artefakt till följd av denna teknik kan förnekas genom användning av hög hastighet avbildning, inklusive samtidig mätning av ljusfält och fluorescensmikroskopi. I denna rapport, detalj vi hur momentant dextran uteslutning avbildning kan användas för att mäta ESL tjocklek i subpleural mikrocirkulationen av en fritt röra in vivo mus lunga. Denna teknik kan enkelt modifieras för att bestämma glykokalyx funktion-specifikt, förmågan hos en intakt ESL utesluta cirkulerande element från endotelytan. Vi har nyligen använt dessa tekniker för att bestämma vikten av pulmonell ESL integritet till utvecklingen av akut lungskada under systemiska inflammatoriska sjukdomar såsom sepsis 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av kirurgisk slang, vaskulära katetrar, bröstkorgen fönster
- Intravital mikroskopi skede. Vi skräddarsyr gjort en plexiglas steg på vilken sövd mus ligger under mikroskopi. Detta stadium rymmer både ett 15 × 10 cm flexibel plast skärbräda (på vilken mus ligger under induktion av anestesi, trakeostomi placering och venös kateterisering) samt en liknande storlek värmeelement (finns under skärbräda).
- Mus thoracostomy rör förberedelse (figur 1). En 10 cm längd av PE 50 rör (Intramedic, innerdiameter 0,58 mm, ytterdiameter 0,965 mm) kapas. Ena ände är fäst vid den trubbiga änden av en krökt 23 gauge nål, denna nål kommer att användas för att passera röret genom den torakala väggen (inuti → utanför) före tillslutning av bröstkorg fönstret.
Den distala änden av röret (1,5 cm i längd, motsatta bifogade 23 gaugenål) upprepade gånger punkteras av en 30 gauge nål, skapa "sidoöppningar" för att underlätta en effektiv strävan intratorakala luft.
Denna fenestrated partiet separeras sedan från resten av röret av flera periferiella slingor av 04:00 silkessutur, dessa slingor kommer att tjäna som en "propp", slutligen förankring av 1,5 cm fenestrated del inuti brösthålan. - Jugular venkatetrar. Finns två 15 cm längder av PE 10 rör (Intramedic, innerdiameter 0,28 mm, ytterdiameter 0,61 mm) kapas. En skalpell används för att koniska ändarna av röret, vilket ökar lättheten för venpunktion. Röret spolas via en 1 ml spruta innehållande 6% 150 kDa dextran-lösning (i PBS) fäst till den icke-avfasade änden av röret.
- Bröstet vägg fönster beredning (figur 2). Transparent polyvinyliden membran (New Kure Wrap, Kuresha, Tokyo) kapas till en oval form (stora axel 6 cm, lillaxeln 4 cm). En cirkulär 5 mm # 1 täckglas (Bellco) är fäst vid membranet med α-cyanoakrylatlim (Pattex flüssig, Henkel, Diisseldorf).
- . Rör för pneumothorax induktion ("blåsrör") En 10 cm längd av slang (innerdiameter 3 mm, ytterdiameter 5 mm) är fäst vid en 5 ml spruta, den motsatta änden kommer att användas för att införa luft i djuret bröstkorg bur före bröstkorgen fönster engraftment.
- Spruta för nedsänkning i vatten av mål. En 23 gauge nål fäst vid en 30 ml spruta innehållande destillerat vatten. Spetsen på nålen trubbiga (med hjälp av en metall-fil) för att förhindra skador på målet.
2. Mus Anestesi
- En mus är bedövades med en blandning av ketamin (10 mg / ml) och xylazin (2 mg / ml), administrerades intraperitonealt i en dos av 8 pl per gram muskroppsvikt. Sedering sker inom 3 till 6 minuter och bör inte hindra spontan andning.
- Använda en elektrisk rakapparat, rakninghalsen, bröstet, buken, och höger sida av musen.
- Med hjälp av tejp, fast musen till en tunn plast skärbräda. Chefen för musen ska peka mot operatören (Figur 3). Svag spänning som tillhandahålls av en suturögla passerar under de övre tänderna tjänar till att upprätthålla huvud förlängning. Den skärbräda placeras på en värmedyna, bibehålla mus euthermia under trakeostomi och venkateter placering.
- Våta rakade områden med 100% etanol.
- Bekräfta tillräckligt anestesi med en svans / tass nypa. Fortsätta om minimal respons, ger en extra bolus av ketamin / xylazin om inte tillräckligt sövd.
3. Trakeostomi
- En 1 cm snitt görs över halsen. Underliggande bindväv skärs, och spottkörtlarna separeras och reflekteras i sidled. Den sternohyoid muskeln omedelbart främre till luftstrupen är opererande.
- En slinga av 04:00 sutur Avancerat under the luftstrupen (Figur 4). Slingan skärs sedan, skapa två separata strängar av sutur underliggande luftstrupen. Den kaudala sutur kommer att användas för att fästa trakeotomiröret, den kraniala suturen kommer att användas för att tillhandahålla spänning på luftstrupen under trakeostomi placering.
- Med hjälp av två fingrar, är den övre suturen grips och mild spänning appliceras till luftstrupen. En horisontell snitt görs i luftstrupen mellan övre och nedre suturer. Detta snitt ska korsa ungefär två tredjedelar av trakeal omkrets. En flänsförsedd trakeostomirör (Harvard Apparatus, 1,22 mm ytterdiameter) är införd i den distala trakea och fästes på plats med hjälp av kaudala trakeala suturen.
- Den trakeostomi är ansluten till en volym-kontrollerad litet djur ventilator (Inspira, Harvard Apparatus), och musen ventileras med 40% inandat syre och 9 ml / kg tidalvolymer (inställningar optimerade för att upprätthålla adekvat syresättning / ventilation i vårt laboratorium). Positiva slutexpiratoriskt tryck (PEEP) är inte börjat vid denna punkt. Att notera, bör ventilatorinställningar optimeras till unika förutsättningar inom de enskilda laboratorierna. Olika längder av överflödig slang (placerad mellan ventilatorslangen Y-koppling och trakeostomi) kan användas för att justera dödutrymme, garanterar en stabil alveolär ventilation för varje vald tidalvolym.
4. Venös Kateterisering
- Övergången mellan interna och externa halsvenen kan identifieras genom att spåra distala venösa grenar proximalt. Den yttre halsvenen finns under de reflekterade spottkörtlar, vilket kan spåras proximalt för att hitta utvändig jugulära korsning.
- Använd mild trubbig dissektion för att separera jugular korsningen från omgivande bindväv.
- Med hjälp 04:00 suturer, fästa de externa jugular och interna jugularvenerna distala (kraniala) till jugular korsningen.
- Göra ett litet snitt i carinaav den jugulara förbindelsen; blödning bör vara minimal.
- Två katetrar kan stegvis fram genom incisionen och in i halsvenen stammen. Efter försiktig strävan att säkerställa blod gengäld katetrar fäst i venen med 4:00 suturer.
- Tape venkatetrar till skärbräda för att förhindra oavsiktlig förflyttning.
5. Intravital muslunga Mikroskopi kirurgi (anpassad från Tabuchi et al. 18)
- Den skärbräda (innehållande den återhållsamma, sövd mus samt tejpade katetrar venösa) har flyttats över till den intravital mikroskopi scenen, där de återstående kirurgiska ingrepp kommer att utföras. En rektal temperatur sond placerad, vilket gränssnitt med en adaptiv värmesystem (finns under skärbräda), så underhåll av mus euthermia.
- En jugular venös kateter är ansluten till en sprutpump som levererar en ketamin (10 mg / ml)-xylazin (2 mg / ml)blandningen vid 200 | il per timme. Adekvat anestesi åter bekräftas med svans / tass nypa.
- Den mittlinjesnitt är utsträckt från halsen till xyphoid processen, sedan fortsätter i sidled till höger (figur 5).
- Med hjälp av diatermi är bröstmuskulaturen bort, exponerar bröstkorg bur. Försiktighet vidtas för att säkerställa fullständig hemostas.
- Korsa musens högra bakben över vänster sida och tejp nedåt. Den resulterande buken vridning roterar bröstkorgen något bättre underlätta operationen.
- Placera scenen i 45 graders vinkel (Figur 6), denna positionering gör lungan faller bort från bröstkorgen när pneumothorax induceras.
- Den 1: a revbenet (mest sämre revben) grips med en tång och uppvuxen, en krökt pincett är rent ut trycks under ribban. Detta skiljer parietala pleura från bröstkorgen. Lungsäcken bör förbli unpunctured.
- Använda blåsröret ochen spruta, luft våld införs mot parietala pleura. Detta leder till bristning av pleura ytan och pneumotorax utan att skada den underliggande lungan. Den underliggande lungan kommer att falla bort från bröstväggen, tillåter införande av en diatermi tång utan att skada lungorna. En minskning av fläkt tidalvolymen är normalt inte erfordras under detta steg.
- Med hjälp av diatermi pincett, dissekera bröstväggen muskulatur och spänner över den 5: e och 6: e revben / parietal pleura, gör en ~ 8 mm cirkulärt hål i bröstkorgen. Det är viktigt att fullständig hemostas bibehålls, eftersom förekomsten av blödningar skymmer mikroskopi (Figur 7).
- Med hjälp av en nål förare sätter thoracostomy röret i bröstkorgen hålet. Nålen ska punktera bröstkorgen och avsluta brösthålan sämre och lateralt bröst fönstret (Figur 7). Undvik att punktera membranet. Denröret sedan försiktigt dras ut ur bröstkorgen tills det motstånd sker från suturen "proppen" ligger i utkanten av fenestrated delen av röret.
- Placera scenen platt.
- Lägg 3 cm H 2 O PEEP till ventilatorn att hjälpa bistå lunga reexpansion.
- Lim (Pattex gel, Henkel) placeras perifert runt bröstkorgen fönstret. Membranet är fäst, med täckglas vetter utsidan till brösthålan. Försiktigt (och perifert) ungefärlig membranet till limmet med hjälp av en applikator bomull.
- När du utför en manöver lunga rekrytering (3 tidalvolymer under vilken PEEP fläkten porten är skymd), är -3 mm Hg sug appliceras på bröstet röret. Lungan bör fortsatt ungefär membranet medan fritt röra sig under tidvatten ventilation (Figur 8).
- Höger framben av musen korsas över till vänster sida, vilket resulterar i en vänster lateral dekubitus position musen.Sponge kilar kan användas för att korrekt placera musen så bröstet fönstret är inriktad med mikroskopi vatten nedsänkning mål.
- Destillerat vatten placeras på täckglas före mikroskopi, vilket möjliggör visualisering av lungan med en objektiv nedsänkning i vatten. Vatten måste fyllas intermittent under avbildning.
6. Mätning av Pulmonell endotelytan Skikttjocklek
- Omedelbart efter bröstväggen stängning är 500 ul FITC-märkt 150 kDa dextran (6% lösning i PBS) som administreras via den andra (icke-anestesi) jugular venkateter. Denna bolus fungerar som volym återupplivning samt vaskulära spårämne för ESL mätning. Den dextran bolus påverkar inte neutrofiladhesion eller lungödem bildandet 2.
- Vatten nedsänkning Målet är centrerad över täckglaset. Valet av mål är viktig, att visualisera små skillnader i ESL tjocklek, hög numerisktcal öppning behövs (> 0,8) och samtidigt bibehålla en 2 - 3 mm arbetsavstånd (tillåter penetrering genom lungan fönstret och pleura yta). Vi använder Nikon CFI 75 LWD 16x (NA 0,8) och CFI 75 LWD 25x (NA 1,1) mål för detta ändamål.
- Att noggrant mäta ESL tjocklek i en rörlig orgel, är det viktigt att ljusfält och fluorescerande vaskulära bredder utförs samtidigt. Detta kan åstadkommas med hjälp av en bild splitter (Dual View, ljustekniska) som möjliggör samtidig infångning av reflekterat ljus differential interferens kontrast (DIC, brightfield) och FITC bilder (Figur 9).
- Under en 5 sek inspiratoriska paus är kontinuerlig avbildning utförs och registreras. Senare kan dessa bilder ses för att identifiera in fokusområdet.
- Med hjälp av en in-fokusområdet är subpleural mikrokärl (<20 nm diameter) identifieras, minst 3 mikrokärl finns normalt på en enda bildruta. Efter fullbordan av försöket, DICoch FITC-dextran vaskulära bredd mäts (av en blindad observatör) som genomsnittet längderna tre vinkelräta fångar per microvessel. Förutsatt lika ESL tjocklek på båda kanterna av fartyget, kan ESL storlek definieras av en hälften av skillnaden mellan DIC och FITC-dextran vaskulära bredder, som beskrivs i representativa resultat sektionen.
- Normalt kan intravital mikroskopi utföras för> 90 minuter utan några tecken på lungskada eller hypotension 2. Preliminära experiment bör utföras för att bekräfta mus stabilitet (blodtryck, syresättning, ventilation, lungskada) under observation. Experimentella läkemedel kan införas genom den andra (icke-anestesi) jugular kateter när som helst under förfarandet.
7. Alternativt mått på den Pulmonell endotelytan Layer Integrity
De intakta endotelceller ytskiktet funktioner (delvis) att utesluta circulatning element från endotelytan 2. ESL integritet kan därför mätas genom förmågan hos en cirkulerande elementet (t.ex. en fluorescerande mikrosfär) få tillgång till och interagera med cellyteadhesionsmolekyler (såsom ICAM-1).
- Anti-ICAM-1 märkt fluorescerande mikrosfärer framställs före operation. Streptavidin-belagda 0,97 um fluorescerande mikrosfärer inkuberas med biotinylerad anti-ICAM-1 (YN1/1.7.4 klon, 1:50, eBioscience) antikropp eller isotypkontroU under 30 min vid rumstemperatur. Mikrosfärerna tvättas tre gånger och suspenderades i PBS vid 1 x 10 9 mikrosfärer per ml.
- Under intravital mikroskopi är mikrosfärsuspensionen (100 pl) injicerades i den jugulara venkateter. Efter 15 minuter av cirkulation, är fluorescerande bilder tagna under 5 minuter. Mikrosfärer orörlig för> 5 minuter anses vidhäftande och kvantifieras med hjälp av bildbehandlingsprogram.
8. Eutanasi
<p class = "jove_content"> Efter avslutad förfarandet är sövda möss avlivas genom avblodning via direkt hjärtpunktion. Eutanasi bekräftas via bilaterala pneumothoraces, varefter lungorna skördas och snabbfrystes för senare analys.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den experimentella metod som beskrivs i steg 1-6 kommer att tillåta fångst av flera ramar samtidigt DIC (ljusfält) och fluorescerande bilder. För att bestämma ESL tjocklek är inspelade bilder granskas av en blindad observatör efter avslutad experimentella protokollet. Med hjälp av en in-fokusområdet är subpleural mikrokärl (<20 nm diameter) identifieras, minst 3 mikrokärl finns normalt på en enda bildruta (figur 10). Använda programvara bildanalys (NIS Elements, Nikon) är vaskulära bredder mäts (av en blindad observatör) som genomsnittet längderna tre vinkelräta fångar per microvessel. Eftersom ESL är osynlig för DIC avbildning, DIC vaskulära bredder spänner endotelial membran till endotelial membran och är därför inklusive ESL tjocklek 9, 10. I motsats, är FITC-dextran (150 kDa) uteslutits från ESL. Därför gör införliva FITC vaskulära bredder inte ESL tjocklek. Förutsatt lika ESL tjockNess vid båda kanterna av fartyget, kan ESL storlek därför definieras av hälften av skillnaden mellan DIC och FITC-dextran vaskulära bredder.
Flera potentiella tekniska fallgropar kan störa tolkningen av experimentella resultat. Närvaron av blödning i mikroskopi fältet skymmer både DIC och FITC visualisering av subpleural mikrovaskulaturen, därför måste försiktighet iakttas för att uppnå hemostas (med diatermi) under fönstret placering (5,9). Dessutom lungan kanske inte reapproximate bröstkorgens fönstret efter rekryteringen manövern (5,14), vilket vanligen innebär ofullständig omkretsen vidhäftning av membranet runt bröstkorg fönstret. Detta kan vanligtvis korrigeras genom återapplicering av lim runt den bröstkorg fönstret, följt av en upprepad lunga rekrytering manöver. Slutligen, måste försiktighet iakttas för att undvika oavsiktlig injektion av intravenöst luft i musen. Luftemboli, även om det inte dödlig, kommer preferenti allierad resa till nondependent lungan, vilket förhindrar FITC-dextran perfusion av visualiseras (nondependent) subpleural mikrovaskulaturen.
Mätning av ESL bredder kräver användning av en bild splitter (ger samtidig DIC och fluorescerande avbildning) samt specialiserade mål mikroskopi. Dessa utrustning krav kan undvikas med några ändringar till vår protokollet. Glykokalyx integritet kan indirekt mätas genom att bestämma ESL utesluta cirkulerande mikrosfärer från fartyget yta. Närvaron av ESL nedbrytning, därför indikeras av ökad subpleural mikrovaskulär infångning av mikrosfärer riktade mot endoteliala molekyler ytvidhäftning (såsom ICAM-1) (Figur 11).
Figur 1.
Figur 2.
Figur 3.
Figur 4.
Figur 5.
Figur 6.
Figur 7.
Figur 8.
Figur 9.
Figur 10. Mätning av mus pulmonell ESL tjocklek. (A) representant samtidigt-fångade DIC och fluorescerande bilder av mus subpleural mikrovaskulaturen (skala bar 50 um). Microvessel bredd mäts med ett genomsnitt av tre vinkelräta linjära avlyssningar. ESL tjocklek kan bestämmas med hälften av skillnaden mellan DIC (inklusive ESL) och fluorescerande (exklusive ESL)microvessel bredder. (b) DIC mätningar korrekt identifiera subpleural gränser fartyg vägg, vilket framgår av nästan identisk DIC och GFP fartyg breddmått utförs i endotel-fluorescerande Tie2-GFP möss (Jackson Labs). Heldragen linje representerar linje av identitet. (C) subpleural mikrovaskulatur kan följas longitudinellt, vilket framgår av den progressiva förlusten av ESL tjocklek inträffar efter intravenös lipopolysackarid (LPS). N = 3 möss. * P <0,05 i jämförelse med tiden = 0 min med ANOVA.
Film 1. Glykokalyx integritet kan bestämmas genom att bedöma för anti-ICAM-1 mikrosfär vidhäftning inom subpleural mikrovaskulaturen. High-speed konfokalmikroskopi (Nikon A1R) visar fastsittande fluorescerande mikrosfärer 45 min efter intravenös LPS (20 mg per kg kroppsvikt). Notera att cirkulerande mikrosfärer kan vara occasionally sett passerar genom mikrocirkulationen. För att förbättra visualisering av (grönt fluorescerande) mikrosfärer lokalisering i steg 6,1 möss förbehandlades med den vaskulära spårämnet TRITC-dextran (150 kDa, 6%) i stället för FITC-dextran. Klicka här för att visa filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I samband med den ökade användningen av in vivo-mikroskopi, det finns en ökad uppskattning för både den betydande storleken av ESL liksom dess många bidrag till vaskulär funktion. Dessa nya uppgifter, men främst härrör från studier av den systemiska kärlsystemet. Faktum användning av in vivo mikroskopi i lungan är tekniskt utmanande, med tanke på betydande pulmonell och hjärt rörelseartefakt.
Flera nya tekniska framsteg har gjort det möjligt för stabilisering av den rörliga muslunga, ger bättre tillämpning av intravital tekniker för pulmonell mikrocirkulationen 12, 13. Dessa metoder är dock potentiellt förväxlas med de fysiologiska konsekvenserna av lung orörlighet. Eftersom lungorna är teleologiskt ett organ avsett för kontinuerlig rörelse kommer lunga stas ändra intuitivt pulmonell fysiologi. Faktum är lunga stas associerad med förändringar i endotel Nitric oxid signalering, en väg med många nedströms konsekvenser i både friska och skadade lungan 14, 16. Dessutom, immobilisering av ett område av lungan ämnen omger alveolerna till skadliga skjuvkrafter, i överensstämmelse med den "atelectrauma" kännetecknar ventilatorn inducera lungskada 19. Dessa och andra ännu-till-vara identifierade konsekvenserna av lung stasis sannolikt förväxla tolkning av intravital observationer av pulmonell mikrovaskulära (pato) fysiologi.
Med tanke på dessa problem, försökte vi utveckla en metod genom vilken pulmonell ESL kan studeras i ett fritt rörligt in vivo mus lunga. Vi valde att anpassa tekniken för Tabuchi och Kuebler, en metod som gör det möjligt längsgående visualisering av ett fritt rörlig muslunga utan anstiftan lungskada 18. Viktigt innehåller vår strategi flera subtila förändringar från Tabuchi ursprungliga protokoll, dessa Alteraningar utvecklats från behovet att tillgodose unika förutsättningar inom vårt laboratorium. Likaså antas i vår modell av ESL mätning håll kräver liknande optimering för att säkerställa stabiliteten i mus hemodynamiken, syresättning, ventilation och avsaknad av lungskada.
Vi valde att använda dextran utanförskap som vår främsta sätt att ESL mätning. Denna teknik är väl lämpad för vår modell, eftersom ESL mätningar kan göras från ett enda tidpunkt, motverkar pulmonell och hjärt rörelseartefakt. Även tidigare studier av den systemiska mikrovaskulaturen har föreslagit att dextran utslagning är bara exakt i små kärl (<15 nm 6), har vi noterat samstämmiga ESL förändringar i fartyg upp till 30 um i diameter. Dessa skillnader kan bero på optiska egenskaper som är specifika för pleural ytan.
I en rörlig kärlbädd, är det viktigt att ljusfält och fluorescerande avbildning Occurs samtidigt, som till och med en kort fördröjning i bilden förvärv (t.ex. slutare stängning mellan sekventiella bilder) skulle på ett ödesdigert förväxla mätningar av ESL tjocklek. Medan paus ventilation kan minska denna confounding kommer en inspiratorisk paus inte helt förhindra hjärt rörelseartefakt eller respiratorisk artefakt från gas omfördelning i heterogent-uppblåsta, skadade lungor ("pendelluft") 20. Vi valde att använda en bild splitter för att samtidigt skicka ljusfält och fluorescerande bilder till en enda CCD-kamera. Alternativa metoder skulle kunna omfatta användning av dikroiska speglar att samtidigt fånga reflekterade och fluorescenta bilder under konfokalmikroskopi.
En ytterligare viktig efterfrågan på vår modell är att använda specialiserade vatten nedsänkning mål. Dessa mål måste ha en tillräckligt stor numerisk apertur för att lösa små skillnader i fartyg bredder samtidigt SKÖTAg. en tillräcklig sträcka för att penetrera både bröstkorgens fönstret och pleura yta. Dessa mål, medan tillgänglig, är mycket dyra. Användningen av reflekterat ljus differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi, är en brightfield teknik som belyser ofärgade vävnader kanter, dessutom önskvärt eftersom DIC förbättrar precisionen av vaskulära bredd mätningar.
Alternativa tekniker finns för bestämning av pulmonell ESL bredd. Även mikrosfär velocimetry inte exakt kan utföras på en rörlig kärlbädd kan mikrosfär vidhäftning användas för att indirekt testa pulmonell glykokalyx integritet. Vi har tidigare visat att de intakta ESL funktioner för att utesluta cirkulerande mikrosfärer från endotelceller molekyler ytvidhäftning 2. Närvaron av anti-ICAM-1-mikrosfärer vidhäftning till endotelytan indikerar därför en förlust av glykokalyx / ESL integritet. Denna teknik kräver inte samtidig brightfield / fluorescerande avbildning, inte heller hög numerisk apertur mål behövs. Det finns dock en viktig varning: för ökad anti-ICAM-1 adhesion mikrosfärer att indikera glykokalyx förlust, måste det finnas liknande ICAM-1-cellyteexpression mellan kontroll och experimentella grupper. Medan ICAM-1 endotelytan uttryck förblev stabil tidigt (<45 min) i sepsisinducerad lungskada 2 kommer ytexpression att öka så småningom i en NF-KB beroende sätt 21. Användning av mikrosfärer vidhäftning som en markör för glykokalyx integritet kan därför endast vara giltigt under tidig inflammation.
Att notera, medan våra kirurgiska och mikroskopi tekniker inte framkalla lungskada 2 är det osäkert hur utvecklas experimentell lungskada (t.ex. skada inducerad av intratrakeal syra instillation) påverkar mätningar av ESL tjocklek. Evolving lungödem skulle kunna förväxla DIC mätningar av fartygets breddoch / eller inflytande dextran permeabilitet. Denna osäkerhet kan minskas genom kompletterande användning av flera tekniker (t.ex. dextran utslagning, mikrosfär vidhäftning samt bekräftande histologiska bedömningar av fartyg glykosaminoglykan innehåll 2) för att bekräfta observerade förändringar i lungorna ESL.
Sammanfattningsvis, genom att utvidga den kirurgiska metoden initialt av Tabuchi och Kuebler, har vi utvecklat en experimentell modell som gör det möjligt för den detaljerade observation av pulmonell ESL. Användning av denna modell bör möjliggöra en större förståelse för vikten av endotel glykokalyx till pulmonell vaskulär fysiologi vid hälsa och sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Arata Tabuchi och Wolfgang Kuebler (University of Toronto) för undervisning om intravital mikroskopi. Vi tackar Andrew Cahill (Nikon Instruments) för hjälp med mikroskopi utformning och genomförande. Detta arbete har finansierats av NIH / NHLBI bidrag P30 HL101295 och K08 HL105538 (till EPS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various | ||
References
- Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung. AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).
- Florian, J. A., et al. Heparan sulfate proteoglycan is a mechanosensor on endothelial cells. Circ. Res. 93, e136-e142 (2003).
- Chappell, D., et al. The Glycocalyx of the Human Umbilical Vein Endothelial Cell: An Impressive Structure Ex Vivo but Not in Culture. Circulation Research. 104, 1313-1317 (2009).
- Potter, D. R., Damiano, E. R. The hydrodynamically relevant endothelial cell glycocalyx observed in vivo is absent in vitro. Circ. Res. 102, 770-776 (2008).
- Weinbaum, S., Tarbell, J. M., Damiano, E. R. The Structure and Function of the Endothelial Glycocalyx Layer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 121-167 (2007).
- Pittet, M., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Kilpatrick, D. C., Graham, C., Urbaniak, S. J., Jeffree, C. E., Allen, A. K. A comparison of tomato (Lycopersicon esculentum) lectin with its deglycosylated derivative. Biochem. J. 220, 843-847 (1984).
- Smith, M. L., Long, D. S., Damiano, E. R., Ley, K. Near-wall micro-PIV reveals a hydrodynamically relevant endothelial surface layer in venules in vivo. Biophys. J. 85, 637-645 (2003).
- Vink, H., Duling, B. R. Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries. Circ. Res. 79, 581-589 (1996).
- Marechal, X., et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 29, 572-576 (2008).
- Presson, R. G. Jr, et al. Two-Photon Imaging within the Murine Thorax without Respiratory and Cardiac Motion Artifact. The American Journal of Pathology. 179, 75-82 (2011).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Meth. 8, 91-96 (2011).
- Pearse, D. B., Wagner, E. M., Permutt, S. Effect of ventilation on vascular permeability and cyclic nucleotide concentrations in ischemic sheep lungs. J. Appl. Physiol. 86, 123-132 (1999).
- Hossain, M., Qadri, S., Liu, L. Inhibition of nitric oxide synthesis enhances leukocyte rolling and adhesion in human microvasculature. Journal of Inflammation. 9, 28 (2012).
- Schmidt, E. P., et al. Soluble guanylyl cyclase contributes to ventilator-induced lung injury in mice. AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, L1056-L1065 (2008).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. J. Appl. Physiol. 28, 596-608 (1970).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J. Appl. Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Gattinoni, L., Protti, A., Caironi, P., Carlesso, E. Ventilator-induced lung injury: the anatomical and physiological framework. Crit. Care Med. 38, 539-548 (2010).
- Tabuchi, A., Kim, M., Semple, J. W., Kuebler, W. M. Acute Lung Injury Causes Pendelluft Between Adjacent Alveoli In Vivo. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, A2490 (2011).
- Roebuck, K. A., Finnegan, A. Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression. J. Leukoc. Biol. 66, 876-888 (1999).
