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Medicine

In vivo Messung der Maus Pulmonary Endothelial Surface Layer

doi: 10.3791/50322 Published: February 22, 2013

Summary

Die endotheliale Glykokalyx / endothelial Oberflächenschicht ist ideal studiert mit Intravitalmikroskopie. Intravitalmikroskopie ist technisch anspruchsvoll in einem sich bewegenden Organ wie der Lunge. Wir zeigen, wie die gleichzeitige Hellfeld und Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um Endotheloberfläche Schichtdicke in einem frei beweglichen abzuschätzen

Abstract

Die endotheliale Glykokalyx ist eine Schicht aus Proteoglycanen und zugehörige Glycosaminoglycane Auskleiden des Gefäßlumens. In vivo die Glykocalix hochhydratisierten ist, Bilden einer erheblichen endothelialen Oberflächenschicht (ESL), die zur Aufrechterhaltung der endothelialen Funktion beiträgt. Als die endotheliale Glykokalyx ist oft aberrante in vitro und ist während der normalen Gewebe Fixationstechniken verloren, benötigt Studie der ESL Verwendung von Intravitalmikroskopie. Um die beste Annäherung an die komplexen Physiologie des alveolären Mikrovaskulatur wird pulmonalen intravital Bildgebung ideal auf einem frei beweglichen Lungenkrebs durchgeführt. Diese Zubereitungen jedoch typischerweise unter umfangreichen Bewegungsartefakt. Wir zeigen, wie mit geschlossenem Brustkorb Intravitalmikroskopie einer frei beweglichen Mauslunge verwendet werden, um Glykocalix Integrität mittels ESL Ausschluss von fluoreszenzmarkierten hochmolekularen Dextrane aus der endothelialen Oberfläche zu messen. Diese Nichtwiedereinziehung chirurgische Technik, die benötigtgleichzeitige Hellfeld und Fluoreszenz-Bildgebung der Maus Lunge, ermöglicht Längs Beobachtung des subpleural Mikrovaskulatur ohne Beweise zu induzieren confounding Lungenschädigung.

Introduction

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Die endotheliale Glykokalyx ist ein extrazelluläres Schicht aus Proteoglycanen und zugehörige Glycosaminoglycane Auskleiden der vaskulären Intima. In vivo die Glykocalix hochhydratisierten ist, Bilden einer Oberflächenschicht wesentlichen endothelialen (ESL), die eine Vielzahl von Funktionen einschließlich Endothelzellen Fluiddurchlässigkeit 1, Neutrophilen-Endothel reguliert Haftung 2 und die Mechanotransduktion von Fluid Scherbeanspruchung 3.

Historisch gesehen hat die Glykokalyx war underappreciated aufgrund seiner aberrance in kultivierten Zellpräparationen 4, 5 und seine Abbauprodukte während der üblichen Gewebefixierung und Verarbeitung 6. Der zunehmende Einsatz 7 von Intravitalmikroskopie (in vivo Mikroskopie, IVM) hat mit erhöhter wissenschaftliche Interesse an der Bedeutung der ESL auf vaskuläre Funktion bei Gesundheit und Krankheit zusammenfiel. Die ESL ist unsichtbar für Lichtmikroskopie und kann nicht einfach in beschriftbarvivo, da die Neigung der fluoreszierenden Glykokalyx-bindenden Lektine RBC Agglutination 8 und tödlichen Lungenembolien (unveröffentlichte Beobachtungen) verursachen. Mehrere indirekte Ansätze wurden daher entwickelt, um ESL Dicke (und durch Erweiterung, Glykokalyx Integrität) in unbewegten Gefäßbetten wie die cremasterica und mesenterialen microcirculations abzuleiten. Diese Techniken umfassen die Messung der Differenzen der zirkulierenden Mikropartikel Geschwindigkeit als eine Funktion des Abstands von der endothelialen Membran (Mikropartikel Bild velocimetry 9) sowie die Messung der Ausschluss von sperrigen, fluoreszenzmarkierten vaskulären Markern (zB Dextrane) von der endothelialen Oberfläche (Dextran Exklusionstechnik 10, 11). Von diesen Techniken ist nur Dextran Ausschluss fähig Schätzen ESL Dicke aus Messungen an einem einzigen Zeitpunkt hergestellt. Durch die gleichzeitige Messung vaskulärer Breiten mit Hellfeldmikroskopie (a Breite inclusive der "unsichtbaren" ESL) und Fluoreszenz-Mikroskopie eines vaskulären Tracer vom ESL ausgeschlossen, kann ESL Dicke wie die Hälfte der Differenz zwischen vaskulären Breiten 2 berechnet werden.

Die Verwendung von einem momentanen Maß für ESL Dicke für Studium des pulmonalen Glykocalix gut geeignet. Intravitalmikroskopie der Lunge ist eine Herausforderung, da signifikante pulmonale und kardiale Bewegungsartefakte. Während jüngsten Fortschritte zur Immobilisierung Mauslungen ermöglichen in vivo 12, 13, bestehen Bedenken hinsichtlich der physiologischen Auswirkungen von Lungen Stasis. Lung Immobilität wird mit einer verminderten endothelialen Stickstoffmonoxid Signalisierung 14, ein Signalweg, der sowohl Neutrophilen Adhäsion 15 und Lungenschädigung 16 Auswirkungen verbunden. Weiterhin Immobilisierung eines Bereichs von Lungen freilegt umgebenden mobilen Alveolen zu schädigenden Scherkräften (sogenannte "Atelektrauma"), in Übereinstimmung mit den Konzepten der klassischen physiologischenalveolären Interdependenz 17.

Im Jahre 2008 entwickelte Arata Tabuchi, Wolfgang Kübler und Kollegen eine chirurgische Technik die es erlaubt Intravitalmikroskopie einer frei beweglichen Mauslunge 18. Respiratorischen Artefakt aus diesem Verfahren kann durch die Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Abbildungssystem, einschließlich gleichzeitige Messung von Hellfeld und Fluoreszenzmikroskopie negiert werden. In diesem Bericht ausführlich wir, wie momentane Dextran Ausschluss Bildgebung eingesetzt werden, um ESL Dicke im subpleural Mikrozirkulation einer frei beweglichen, in vivo Mauslunge messen. Diese Technik kann leicht modifiziert werden, um zu bestimmen Glykokalyx-Funktion Insbesondere die Fähigkeit eines intakten ESL auszuschließen zirkulierenden Elemente aus der endothelialen Oberfläche. Wir haben kürzlich diese Techniken verwendet werden, um die Bedeutung der pulmonalen ESL Integrität zur Entwicklung von akutem Lungenversagen während systemische entzündliche Erkrankungen wie Sepsis 2 zu bestimmen.

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Protocol

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Ein. Vorbereitung der Surgical Tubing, Gefäßkathetern, Brust Wand Fenster

  1. Intravitalmikroskopie Bühne. Wir maßgeschneiderte eine Plexiglas Bühne, auf der die narkotisierten Maus liegt in der Mikroskopie. Diese Phase nimmt sowohl ein 15 cm x 10 cm flexible Kunststoff-Schneidebrett (auf dem die Maus liegt bei der Induktion der Anästhesie, Tracheotomie Platzierung und Katheterisierung) sowie einer ähnlich großen Heizelement (unter der Schneidebrett).
  2. Maus Thorakostomie Rohrvorbereitung (Abbildung 1). Ein 10 cm langes Stück PE 50-Schlauch (Intramedic, Innendurchmesser 0,58 mm, Außendurchmesser 0,965 mm) geschnitten. Ein Ende ist mit dem stumpfen Ende eines gekrümmten 23 Gauge-Nadel angebracht ist; diese Nadel wird verwendet, um das Rohr durch die Brustwand (innen → außen) übergeben vor dem Verschluss der thorakalen Fenster werden.
    Das distale Ende des Schlauches (1,5 cm in der Länge, entgegengesetzt zu der angehängten 23 GaugeNadel) wird immer wieder von einer 30-Gauge-Nadel punktiert, die Schaffung von "seitlichen Anschlüssen" wirksame Absaugung des intrathorakalen Luft zu erleichtern.
    Diese gefensterten Abschnitt wird dann von dem Rest des Rohrs durch mehrere umlaufende Schleifen von 4:0 Seidennaht getrennt; diese Schleifen wird als "Stopper" zu dienen, die Verankerung letztendlich 1,5 cm gefensterte Abschnitt innerhalb der Brusthöhle.
  3. Jugularvenöse Kathetern. Zwei 15 cm Längen PE 10-Schlauch (Intramedic, Innendurchmesser 0,28 mm, Außendurchmesser 0,61 mm) geschnitten werden. Ein Skalpell wird zur Abschrägung der Enden des Rohres, wodurch die Leichtigkeit der Venenpunktion. Der Schlauch wird über eine 1 ml Spritze, die 6% 150 kDa Dextranlösung (in PBS), die an den nicht abgeschrägten Ende des Schlauchs gespült.
  4. Chest wand Vorbereitung (Abbildung 2). Transparent Polyvinylidenfluorid-Membran (New Kure Wrap, Kuresha, Tokyo) wird in eine ovale Form (Hauptachse 6 cm, Nebenachse 4 cm) geschnitten. Ein kreisförmiger 5 mm # 1 Deckglas (Bellco) mit der Membran unter Verwendung α-Cyanacrylat-Klebstoff (Pattex flüssig, Fa. Henkel, Düsseldorf) befestigt ist.
  5. . Rohr für Pneumothorax Induktion ("Blasrohr") Ein 10 cm Länge Rohr (Innendurchmesser 3 mm, Außendurchmesser 5 mm) wird auf eine 5-ml-Spritze befestigt ist; das entgegengesetzte Ende wird verwendet, um Luft in das Tier einzuführen Brustkorb vor der Brust wand Transplantation.
  6. Spritze für Wasser Eintauchen Ziel. A 23-Gauge-Nadel auf eine 30 ml Spritze mit destilliertem Wasser angebracht. Die Spitze der Nadel abgestumpft ist (unter Verwendung eines Metall-Datei), um Schäden an dem Ziel zu verhindern.

2. Maus Anesthesia

  1. Eine Maus ist anästhesiert mit einer Mischung aus Ketamin (10 mg / ml) und Xylazin (2 mg / ml) intraperitoneal in einer Dosis von 8 ul pro Gramm Körpergewicht Maus. Sedierung erfolgt innerhalb von 3 - 6 min und sollten kein Hindernis Spontanatmung.
  2. Mit einem elektrischen Rasierer, Rasurder Hals-, Brust-, Bauch und rechten Seite der Maus.
  3. Mit Klebeband sichern Sie die Maus auf einer dünnen Kunststoff-Schneidebrett. Der Kopf der Maus sollte in Richtung des Bedieners (Abbildung 3) zeigen. Gentle Spannung durch eine Schlaufe des Fadens Weitergabe unter den oberen Zähnen dient Kopf-Erweiterung zu erhalten. Das Schneidebrett ist auf einem Heizkissen gelegt, die Aufrechterhaltung der Maus euthermia während Tracheostomie und Venenkatheter Platzierung.
  4. Wet rasiert Bereiche mit 100% Ethanol.
  5. Bestätigen adäquate Anästhesie mit einem Schwanz / paw Prise. Gehen Sie, wenn minimale Reaktion, bieten eine zusätzliche Bolus von Ketamin / Xylazin, wenn nicht ausreichend betäubt.

3. Tracheostomie

  1. Ein 1 cm lange Inzision über der Kehle vorgenommen. Darunterliegende Bindegewebe wird seziert, und die Speicheldrüsen getrennt und reflektiert seitlich. Der M. sternohyoideus sofort anterior der Trachea reseziert.
  2. Eine Schleife von 4:0 Naht wird unter th fortgeschrittene Trachea (Abbildung 4). Die Schleife wird dann geschnitten, wodurch zwei getrennte Stränge der Naht zugrunde liegenden Luftröhre. Die kaudale Nahtmaterial wird verwendet, um die Tracheostomiekanüle zu befestigen; der kraniale Nahtmaterial verwendet wird, um Spannung auf die Luftröhre während Tracheostomie Platzierung bereitzustellen.
  3. Mit zwei Fingern wird der obere Faden ergriffen und schonende Spannung auf die Luftröhre aufgebracht. Ein horizontaler Einschnitt in die Luftröhre zwischen oberen und unteren Nähten hergestellt. Dieser Schnitt sollte überqueren etwa zwei Drittel der trachealen Umfang. Ein Flansch Trachealkanüle (Harvard Apparatus, 1,22 mm Außendurchmesser) in das distale Luftröhre eingeführt und an seinem Platz mit der Schwanzflosse trachealen Naht.
  4. Die Tracheotomie wird auf ein Volumen-kontrollierte kleines Tier Ventilator (Inspira, Harvard Apparatus) verbunden ist, und die Maus ist mit 40% eingeatmeten Sauerstoffs und 9 ml / kg Tidalvolumen (Einstellungen optimiert, um eine adäquate Oxygenierung / Lüftung in unserem Labor erhalten) belüftet. Positive endexspiratorischen Druck (PEEP) wird an dieser Stelle nicht begonnen. Zu beachten ist, sollten die Einstellungen des Beatmungsgerätes besondere Bedingungen innerhalb der einzelnen Labors optimiert werden. Unterschiedliche Längen von redundanten Schlauch (der zwischen dem Schlauchsystem Y-Anschluss und Tracheotomie) kann zum Totraum einzustellen, eine stabile Alveolarventilation für jeden gewählten Atemzugvolumen.

4. Katheterisierung

  1. Die Verbindung der inneren und äußeren Jugularvene kann durch Verfolgen distalen Venenäste proximal identifiziert werden. Die externe Vena befindet sich unterhalb der reflektierten Speicheldrüsen gefunden, dies kann proximal verfolgt werden, um die externe-interne jugulare Kreuzung zu finden.
  2. Verwenden Sie sanfte stumpf, um die Vena Übergang von umgebenden Bindegewebe trennen.
  3. Mit 4.00 Nähten, binden Sie die externen Halsschlagader und interne Jugularvenen distalen (kraniale) an die Gurgel Kreuzung.
  4. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Carinader Vena Kreuzung, Blutungen sollte minimal sein.
  5. Zwei Katheter können schrittweise durch den Schnitt und in die Vena trunk vorangetrieben werden. Nach leichtes Ansaugen von Blut Rückkehr zu gewährleisten, werden Katheter in der Vene mit 4.00 Nähte gesichert.
  6. Band Kathetern auf das Schneidebrett gegen unbeabsichtigtes Herausfallen zu verhindern.

5. Intravital Maus Lung Microscopy Surgery (adaptiert aus Tabuchi et al. 18)

  1. Das Schneidbrett (enthaltend das zurückhaltend, narkotisierten Maus sowie abgeklebt Venenkathetern) mit dem Intravitalmikroskopie Stufe übergegangen, bei denen die verbleibenden chirurgische Eingriffe durchgeführt. Rektale Temperatursonde angeordnet ist; dieses Schnittstellen mit einem adaptiven Heizsystem (unter dem Schneidebrett), so dass Wartung der Maus euthermia.
  2. Ein jugularvenöse Katheter mit einer Spritze, die eine Pumpe Ketamin (10 mg / ml)-Xylazin (2 mg / ml) liefert befestigtMischung bei 200 ul pro Stunde. Eine adäquate Anästhesie wird erneut bestätigt, mit tail / paw Prise.
  3. Die Mittellinieneinschnitt vom Hals zum Xyphoid ausgefahren, dann Fortfahren seitlich an der rechten Seite (Fig. 5).
  4. Mit Elektrokauter wird die Brustmuskulatur entfernt, so dass den Brustkorb. Es wird darauf geachtet, um eine vollständige Blutstillung gewährleisten.
  5. Überqueren Sie die Maus rechten Hinterbein über die linke Seite und Klebeband ab. Die daraus resultierende Bauch Torsion dreht den Brustkorb leicht, durch Erleichterung der Operation.
  6. Legen Sie die Stufe bei einem Winkel von 45 Grad (Abb. 6); diese Positionierung ermöglicht die Lunge fallen weg von der Brustwand, sobald der Pneumothorax induziert wird.
  7. Die 1. Rippe (am unteren Rippe) wird mit einer Pinzette ergriffen und angehoben; eine gekrümmte Pinzette wird stumpf unterhalb der Rippe gedrückt. Diese trennt Pleura parietalis von der Brustwand. Die Pleura bleiben sollte unpunktierten.
  8. Mit dem Blasrohr undeine Spritze, wird die Luft gewaltsam gegen die Pleura parietalis eingeführt. Dies führt zum Bruch der Pleuraoberfläche und Pneumothorax, ohne die zugrunde liegenden Lunge. Die zugrunde liegende Lunge fallen weg von der Brustwand, so dass Einführung eines Elektrokauter Pinzette ohne Beschädigung der Lunge. Eine Abnahme der Beatmungsgerät Atemvolumen wird typischerweise nicht während dieses Schrittes notwendig.
  9. Mit Elektrokauter Pinzette, sezieren die Brustwand Muskulatur und schneiden Sie über den 5 th und 6 th Rippen / Pleura parietalis, so dass ein ~ 8 mm kreisförmigen Loch in der Brustwand. Wesentlich ist, daß eine vollständige Hämostase aufrechterhalten werden, da das Vorhandensein von Blutungen Mikroskopie (Abbildung 7) verdeckt wird.
  10. Mit einer Nadel Fahrer, legen Sie die Thorakostomie Rohr in der Brustwand Loch. Die Nadel sollte Punktion der Brustwand und verlassen die Brusthöhle unterhalb und seitlich des Thorax (Abbildung 7). Achten Sie darauf, zu vermeiden Punktion der Membran. DieSchlauch wird dann vorsichtig aus der Brustwand gezogen, bis er auf Widerstand tritt aus der Naht "Stopper" an der Kante des gefensterten Abschnitt des Rohres befindet.
  11. Zeigen die Bühne flach.
  12. Hinzufügen 3 cm H 2 O PEEP an das Beatmungsgerät zu helfen unterstützen Lungenkrebs reexpansion.
  13. Kleber (Pattex Gel, Henkel) in Umfangsrichtung um die Brust Fenster platziert. Die Membran gebunden ist, mit dem Deckglas zugewandten außerhalb der Brusthöhle. Vorsichtig (und umfangsmäßig) annähernd der Membran zu der Leim mit einem Baumwoll-Applikator.
  14. Während der Durchführung einer Lunge Rekrutierungsmanöver (3 Tidalvolumen während der die PEEP Lüfter-Anschluss verstopft ist), wird -3 mm Hg Saugen an der Brust Rohr aufgebracht. Die Lunge sollte anhaltend ungefähre die Membran, während sich frei bewegenden während Gezeiten Lüftung (Abbildung 8).
  15. Die rechte Vorderbein des Maus über die linke Seite durchquert, wodurch eine linke Seitenlage der Maus.Sponge Keile können verwendet werden, um richtig zu positionieren mit der Maus, so dass die Brust-Fenster mit der Mikroskopie Wasser Immersionsobjektiv ausgerichtet ist.
  16. Destilliertes Wasser wird auf dem Deckplättchen vor Mikroskopie platziert, so dass für die Visualisierung der Lunge unter Verwendung eines Wasser Immersionsobjektiv. Wasser müssen zeitweise ganz Bildgebung ergänzt werden.

6. Die Messung der Lungenfunktion Endothelial Oberflächenschichtdicke

  1. Unmittelbar nach Brustwand Verschlusses werden 500 ul FITC-markiertem Dextran 150 kDa (6% ige Lösung in PBS) über die zweite (nicht-Narkose) jugularis Venenkatheter verabreicht. Dieser dient als Bolus Volumengabe sowie das Gefäßsystem Tracer für ESL-Messung. Das Dextran Bolus hat keinen Einfluss auf neutrophilen Haftung oder Lungenödem Bildung 2.
  2. Das Wasser Immersionsobjektiv über das Deckglas zentriert. Die Wahl des Ziels ist wichtig zu kleinen Unterschieden in ESL Dicke eine hohe numeri visualisierencal Blende benötigt wird (> 0,8) unter Beibehaltung einer 2 - 3 mm Arbeitsabstand (ermöglicht das Eindringen durch die Lunge Fenster und Pleuraoberfläche). Wir verwenden die Nikon CFI 75 LWD 16x (NA 0,8) und CFI 75 LWD 25x (NA 1,1) Ziele für diesen Zweck.
  3. Um genau messen ESL Dicke in einem sich bewegenden Organ, ist es wesentlich, dass Hell-und fluoreszierende vaskulären Breiten gleichzeitig durchgeführt werden. Dies kann unter Verwendung eines Bildes Splitter (Dual View, Photometrics), die für die gleichzeitige Erfassung des reflektierten Lichts Differential-Interferenz-Kontrast (DIC, Hellfeld) und FITC Bilder (Abbildung 9) ermöglicht werden.
  4. Während eines 5 sec inspiratorische Pause ist eine kontinuierliche Bildgebung durchgeführt und aufgezeichnet. Später können diese Bilder überprüft werden, um in-Messfeld zu identifizieren.
  5. Verwendung eines In-Fokus-Rahmen, subpleuralen Mikrogefäßen (<20 Mikrometer Durchmesser) werden identifiziert; mindestens 3 Mikrogefäßen werden typischerweise auf einem einzigen Rahmen vorhanden. Nach Beendigung des Versuchs, DICund FITC-Dextran vaskulären Breiten gemessen werden (durch eine Blindbeobachter) durch Mitteln der Längen der drei senkrechten Abschnitte pro Mikrogefäßzellen. Annahme gleicher ESL Dicke an beiden Rändern des Schiffes kann die ESL Größe um die Hälfte der Differenz zwischen DIC und FITC-Dextran vaskulären Breiten, wie in der Repräsentative Ergebnisse Abschnitt definiert werden.
  6. Typischerweise kann Intravitalmikroskopie für> 90 min ohne jeden Beweis der Lungenschädigung oder Hypotonie 2 durchgeführt werden. Vorläufige Experimente durchgeführt werden, um mit der Maus Stabilität (Blutdruck, Sauerstoffsättigung, Lüftung, Lungenschädigung) während des Beobachtungszeitraums zu bestätigen. Experimentelle Medikamente können durch den zweiten (nicht-Narkose) Jugularkatheter an irgendeinem Punkt während des Verfahrens eingebracht werden.

7. Alternative Messung der Lungenfunktion Endothelial Surface Layer Integrität

Die intakten Endothelzellen Oberflächenschicht Funktionen (teilweise) auszuschließen circulatten Elemente aus der endothelialen Oberfläche 2. ESL Integrität kann daher durch die Fähigkeit einer Umlaufelement (zB eine fluoreszierende Mikrokugel) für den Zugriff und die Interaktion mit Zelloberflächen-Adhäsionsmolekülen (wie ICAM-1) gemessen werden.

  1. Anti-ICAM-1 markierten fluoreszierenden Mikrosphären vor der Operation vorbereitet. Streptavidin-beschichtete 0,97 um fluoreszierenden Mikrosphären werden mit biotinyliertem Anti-ICAM-1 (Klon YN1/1.7.4, 1:50, eBioscience) Antikörper oder Isotyp-Kontrolle für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mikrokugeln werden dreimal gewaschen und in PBS suspendiert bei 1 x 10 9 pro ml Mikrokügelchen.
  2. Während Intravitalmikroskopie wird die Mikrosphären Suspension (100 ul) in die Vena Katheter injiziert. Nach 15 min der Zirkulation, sind fluoreszierende Bilder über 5 min erfasst. Microspheres unbeweglich> 5 min gelten als Anhänger und quantifiziert mit Bildverarbeitungs-Software.

8. Sterbehilfe

<p class = "jove_content"> Nach Abschluss des Verfahrens werden narkotisierten Mäusen durch Ausbluten über direkte Herzpunktion eingeschläfert. Sterbehilfe wird über bilaterale Pneumothoraces, nach denen Lungen geerntet und schockgefroren zur späteren Analyse bestätigt.

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Representative Results

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Der experimentelle Ansatz in den Schritten 1-6 beschrieben ermöglichen Erfassung von mehreren Frames gleichzeitiger DIC (Hellfeld) und fluoreszierende Bilder. Um ESL Dicke zu bestimmen, werden aufgenommene Bilder mit einer Blindbeobachter nach Beendigung des experimentellen Protokolls bewertet. Mit Hilfe eines in-Fokussierrahmen subpleural Mikrogefäßen (<20 Mikrometer Durchmesser) identifiziert; mindestens 3 Mikrogefäßen sind in der Regel auf einem einzigen Rahmen (Abbildung 10). Mit Bildanalyse-Software (NIS Elements, Nikon), sind vaskuläre Breiten gemessen (durch einen verblindeten Beobachter) durch Mittelung der Längen der drei senkrechten Abschnitte pro microvessel. Da die ESL unsichtbar ist DIC Bildgebung, überspannen DIC vaskulären endothelialen Breiten Membran Endothelmembran und sind daher einschliesslich ESL Dicke 9, 10. Im Gegensatz dazu wird FITC-Dextran (150 kDa) von der ESL ausgeschlossen. Folglich sind FITC vaskulären Breiten nicht übernehmen ESL Dicke. Annahme gleicher ESL dickeness an beiden Rändern des Schiffes kann die ESL Größe daher um die Hälfte der Differenz zwischen DIC und FITC-Dextran vaskulären Breiten festgelegt werden.

Mehrere potenzielle technische Fallstricke kann mit der Interpretation von experimentellen Ergebnissen stören. Die Anwesenheit von Blutungen in der Mikroskopie Feld verschleiern sowohl DIC und FITC Visualisierung des subpleuralen Mikrovaskulatur, daher darauf zu Hämostase (unter Verwendung Elektrokauter) während Fensteranordnung (5,9) erhalten. Darüber hinaus könnte die Lunge nicht reapproximate die thorakale Fenster nach der Rekrutierungsmanöver (5,14); zeigt dies für gewöhnlich unvollständige umlaufende Haftung der Membran um die Thorax-Fenster. Dies kann üblicherweise durch erneute Anwendung von Kleber um den Thorax Fenster korrigiert werden, gefolgt von einer Wiederholung Lungenrekrutierung manövrieren. Schließlich muß darauf geachtet werden, um ein versehentliches intravenöse Injektion von Luft in die Maus zu vermeiden. Luftembolie, wenn auch nicht tödlich, wird preferenti Verbündeter Reise in die nondependent Lunge, verhindert FITC-Dextran Perfusion des visualisiert (nondependent) subpleural Mikrovaskulatur.

Messung der ESL Breiten erfordert die Verwendung eines Bildes Splitter (BIETEN gleichzeitige DIC und Fluoreszenz-Imaging) sowie spezielle Mikroskopie Ziele. Diese Geräte Anforderungen können mit einigen Modifikationen an unserem Protokoll vermieden werden. Glycocalyx Integrität kann indirekt durch die Bestimmung ESL Ausschluss des zirkulierenden Mikrosphären aus dem Behälter Oberfläche gemessen werden. Die Anwesenheit von ESL Abbau, daher wird durch eine erhöhte mikrovaskuläre subpleuralen Abscheidung von Mikrokügelchen gegen Endotheloberfläche Adhäsionsmoleküle (wie ICAM-1) (Abbildung 11) ausgerichtet angedeutet.

Abbildung 1
Abbildung 1.

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Abbildung 2.

Abbildung 3
Abbildung 3.

Abbildung 4
Abbildung 4.

Abbildung 5
Abbildung 5.

Abbildung 6
Abbildung 6.

Abbildung 7
Abbildung 7.

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Abbildung 8.

Abbildung 9
Abbildung 9.

Abbildung 10
Abbildung 10. Messung der Maus pulmonalen ESL Dicke. (A) Repräsentative DIC und fluoreszierenden Bildern der Maus subpleuralen Mikrovaskulatur (Maßstab, 50 um) gleichzeitiges-eingefangen. Mikrogefäßzellen Breite wird gemessen mit dem Mittelwert von drei senkrechten linearen abfängt. ESL Dicke kann durch eine Hälfte der Differenz zwischen DIC (inklusive der ESL) und fluoreszierende (exklusive der ESL) bestimmt werdenMikrogefäßzellen Breiten. (b) DIC Messungen genau zu identifizieren subpleuralen Gefäßwand Grenzen, um nahezu identische DIC und GFP Gefäß Breitenmaße in endothelialen fluoreszierenden Tie2-GFP-Mäuse (Jackson Labs) durchgeführt demonstriert. Durchgezogene Linie stellt die Linie der Identität. (C) Die subpleuralen Mikrovaskulatur Längsrichtung verfolgt werden kann, wie durch den fortschreitenden Verlust der ESL Dicke vorkommenden nach intravenöser Lipopolysaccharid (LPS). N = 3 Mäusen nachgewiesen. * P <0,05 im Vergleich zur Zeit = 0 min von ANOVA.

Film 1. Glykokalyx Integrität kann durch die Bewertung für anti-ICAM-1 Mikrokugel Adhärenz im subpleuralen Mikrovaskulatur bestimmt werden. Hochgeschwindigkeits-Konfokalmikroskopie (Nikon A1R) zeigt adhärente fluoreszierenden Mikrokugeln 45 min nach intravenöser LPS (20 mg pro kg Körpergewicht). Beachten Sie, dass zirkulierende Mikrosphären können AnlassMotiv seiny gesehen durch die Mikrozirkulation. Um Visualisierung (grün fluoreszierend) Mikrosphären Lokalisierung zu verbessern, Schritt 6,1 Mäuse wurden mit dem vaskulären Tracer TRITC-Dextran (150 kDa, 6%) anstelle von FITC-Dextran vorbehandelt. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .

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Discussion

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Koinzident mit dem expandierenden Verwendung von in vivo-Mikroskopie, gibt es zunehmende Wertschätzung sowohl für die beträchtliche Größe der ESL sowie dessen zahlreichen Beiträge Gefäßfunktion. Diese neuen Daten werden jedoch vor allem aus Studien der systemische Gefäßsystem abgeleitet. In der Tat, der in vivo-Mikroskopie in der Lunge zu verwenden ist technisch anspruchsvoll, da signifikante pulmonale und kardiale Bewegungsartefakte.

Mehrere neuere technische Fortschritte haben zur Stabilisierung der beweglichen Mauslunge erlaubt, wird eine bessere Anwendung der intravital Techniken, um die pulmonale Mikrozirkulation 12, 13. Diese Ansätze sind jedoch möglicherweise durch die physiologischen Auswirkungen von Lungen Unbeweglichkeit verwechselt. Da die Lunge ist teleologisch ein Organ für stetige Bewegung bestimmt wird Lungenkrebs Stasis intuitiv verändern pulmonalen Physiologie. Tatsächlich ist Lungenkrebs Stasis mit Veränderungen in Endothelzellen n assoziiertitric Oxid-Signalisierung, eine Bahn mit einer Vielzahl von stromabwärtigen Auswirkungen sowohl auf dem gesunden Lunge und verletzten 14, 16. Darüber hinaus induzieren Immobilisierung von einem Bereich der Lunge Themen rund Alveolen schädlichen Scherkräfte, im Einklang mit dem "Atelektrauma" Merkmal der Ventilator Lungenschädigung 19. Diese und andere noch zu--identifiziert werden Folgen von Lungenkrebs Stasis sind wahrscheinlich zu verwechseln Interpretation intravital Beobachtungen der pulmonalen mikrovaskulären (Patho-) Physiologie.

Angesichts dieser Bedenken haben wir versucht, eine Methode, mit der pulmonalen ESL in einem frei beweglichen, in vivo Mauslunge untersucht werden könnten. Wir entschieden uns für die Technik der Tabuchi und Kuebler, ein Ansatz, der Längs-Visualisierung von einem frei beweglichen Mauslunge ermöglicht, ohne Anstiftung Lungenverletzung 18 anzupassen. Wichtig ist, enthält unser Ansatz einige subtile Veränderungen von Original-Protokoll Tabuchi die, diese alteragen aus der Notwendigkeit entwickelt, um einzigartige Bedingungen in unserem Labor unterzubringen. Ebenso Annahme unseres Modells der ESL Messung anderswo erfordern ähnliche Optimierung, um die Stabilität der Maus Hämodynamik, Oxygenierung, Beatmung, und das Fehlen der Lungenschädigung zu gewährleisten.

Wir entschieden uns für Dextran Ausgrenzung als unsere primäre Ansatz zur ESL Messung zu verwenden. Diese Technik ist für unser Modell gut geeignet, da ESL Messungen aus einem einzigen Moment in der Zeit gemacht werden können, negiert pulmonale und kardiale Bewegungsartefakte. Während frühere Studien des systemischen Mikrozirkulation angeregt haben, dass Dextran Ausschluss nur genau in kleinen Gefäßen (<15 um 6) ist, haben wir übereinstimmende ESL Veränderungen in Gefäßen festgestellt bis zu 30 &mgr; m Durchmesser. Diese Diskrepanzen können durch optische Eigenheiten der Pleuraoberfläche.

In einer bewegenden Gefäßbett, ist es wichtig, dass Hellfeld und Fluoreszenz-Bildgebung occurs gleichzeitig, wie auch eine kurze Verzögerung bei der Bildaufnahme (zB Shutter Verschluss zwischen aufeinanderfolgenden Bildern) wäre tödlich verwechseln Messungen der ESL Dicke. Während der Pause Belüftung verringern kann diese Störfaktoren, wird eine inspiratorische Pause nicht vollständig verhindern Herzbewegung Artefakt oder respiratorischen Artefakt aus Gas Umverteilung heterogen aufgeblasen, verletzte Lunge ("pendelluft") 20. Wir entschieden uns, ein Bild Splitter verwenden, um gleichzeitig zu senden Hellfeld und Fluoreszenz-Bilder zu einem einzigen CCD-Kamera. Alternative Ansätze könnten zählen die Verwendung von dichroitischen Spiegeln, gleichzeitig reflektiertes Licht zu erfassen und fluoreszierenden Bildern während Konfokalmikroskopie.

Ein weiterer wesentlicher Anspruch unserer Modell ist die Verwendung von spezialisierten wasserlöslichen Immersionsobjektiven. Diese Ziele müssen einen ausreichend großen numerischen Apertur zu ermöglichen Auflösung von kleinen Unterschieden in Behälter Breiten während noch maintaining eine angemessene Arbeitsbedingungen Abstand sowohl die thorakale Fenster und Pleuraoberfläche eindringen. Diese Ziele, während Verfügung stehen, sind sehr teuer. Die Verwendung von reflektiertem Licht Differential-Interferenz-Kontrast (DIC)-Mikroskopie ist eine Hellfeld Technik, ungefärbten Geweberänder unterstreicht zusätzlich wünschenswert, wie DIC verbessert Präzision von Gefäß Breite Messungen.

Alternative Techniken existieren für die Bestimmung von pulmonaler ESL Breite. Während Mikrosphären Velocimetry kann nicht genau auf einem sich bewegenden Gefäßbett durchgeführt werden, können Mikrosphären Haftung eingesetzt, um indirekt testen pulmonalen Glykokalyx Integrität werden. Wir haben zuvor gezeigt, dass die intakten ESL Funktionen auszuschließen zirkulierenden Mikrokugeln aus Endotheloberfläche Adhäsionsmoleküle 2. Das Vorhandensein von Anti-ICAM-1 Mikrokugel Haftung an der endothelialen Oberfläche zeigt daher einen Verlust von Glykocalix / ESL Integrität. Diese Technik erfordert keine gleichzeitige brightfield / Fluoreszenz-Bildgebung, noch sind hohe numerische Apertur Ziele notwendig. Jedoch eine wichtige Einschränkung existiert: für eine erhöhte Anti-ICAM-1 Mikrokugel Haftung an Glykocalix Verlust anzeigen, müssen es ähnliche ICAM-1 Zelloberflächenexpression zwischen Kontroll und experimentellen Gruppen sein. Während ICAM-1 Endotheloberfläche Ausdruck stabil geblieben früh (<45 min) in Sepsis-induzierten Lungenschädigung 2 wird Oberflächenexpression schließlich in einer NF-kappaB abhängigen Weise 21 zu erhöhen. Verwendung Mikrokugel Adhäsion als Marker der Glykocalix Integrität, also nur in der frühen Entzündung gültig.

Zu beachten ist, während unsere chirurgische und Mikroskopie-Techniken nicht zu induzieren Lungenschädigung 2, ist es ungewiss, wie sich entwickelnden experimentellen Lungenversagen (zB Verletzung durch intratracheale Säure Instillation induziert) beeinflusst Messungen der ESL Dicke. Evolving Lungenödem könnte verwirren DIC Messungen des Schiffes Breiteund / oder Einfluss Dextran Durchlässigkeit. Diese Unsicherheit kann durch die Verwendung von mehreren komplementären Techniken (zB Dextran Ausgrenzung Mikrokugel Adhäsion, sowie bestätigende histologische Beurteilung der Behälter Glycosaminoglycan content 2) zu beobachteten Änderungen in der pulmonalen ESL bestätigen gemildert werden.

Zusammenfassend durch Expandieren des chirurgischen Ansatz zunächst durch Tabuchi und Kuebler gemeldet haben wir ein experimentelles Modell, das für die genaue Beobachtung des pulmonalen ESL ermöglicht entwickelt. Die Verwendung dieses Modells sollte zu einem besseren Verständnis der Bedeutung der endothelialen Glykokalyx der pulmonalen vaskulären Physiologie in Gesundheit und Krankheit zu ermöglichen.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Wir danken Drs. Arata Tabuchi und Wolfgang Kübler (University of Toronto) für den Unterricht über Intravitalmikroskopie. Wir danken Andrew Cahill (Nikon Instruments) für die Unterstützung in der Mikroskopie Design und Implementierung. Diese Arbeit wurde vom NIH / NHLBI Zuschüsse P30 HL101295 und K08 HL105538 (auf EPS) finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Reagent
FITC-dextran (150 kDa) Sigma FD150S
TRITC-dextran (150 kDa) Sigma T1287
Streptavidin-coated fluorescent microspheres Bangs Laboratories CP01F/10428 Dragon Green fluorescence (similar to FITC)
Ketamine Moore Medical
Xylazine Moore Medical
Anti-ICAM-1 biotinylated antibody eBioscience Clone YN1/1.7.4 1:50 dilution
Isotype biotinylated antibody eBioscience IgG2b eB149/10H5 1:50 dilution
EQUIPMENT
Mechanical ventilator Harvard Apparatus Inspira
Tracheostomy catheter Harvard Apparatus 730028
Electrocautery apparatus DRE Medical Valleylab SSE-2L
Bipolar cautery forceps Olsen Medical 10-1200I 9.9cm McPherson
Temperature control system World Precision Instruments ATC1000
Syringe pump Harvard Apparatus Pump 11 Elite
Microscope (widefield) Nikon LV-150
Microscope (confocal) Nikon A1R
Image splitter Photometrics DV2
CCD camera Photometrics CoolSNAP HQ2
Image processing software Nikon NIS Elements
Polyvinylidene membrane Kure Wrap
Circular cover slip Bellco 5CIR-1-BEL 5 mm, #1 thickness
Glue (cover slip to membrane) Pattex Flussig (liquid) For affixing cover slip to membrane
Glue (cover slip to mouse) Pattex Gel For attaching membrane to mouse
Surgical tubing Intramedic PE50, PE10
Suture Fisher 4:0 silk
Electric razor Oster 78997
Curved surgical forceps Roboz
Straight surgical forceps Roboz
Surgical scissors Roboz
Surgical microscissors Roboz
Surgical needle driver Roboz
Surgical tape Fisher
Kitchen sponges (cut into wedges) various

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References

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<em>In vivo</em> Messung der Maus Pulmonary Endothelial Surface Layer
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Yang, Y., Yang, G., Schmidt, E. P. In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer. J. Vis. Exp. (72), e50322, doi:10.3791/50322 (2013).More

Yang, Y., Yang, G., Schmidt, E. P. In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer. J. Vis. Exp. (72), e50322, doi:10.3791/50322 (2013).

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