Summary
وقد تم تطوير رقاقة متكاملة بالحرارة ميكروفلويديك لاستخدامها بوصفها التشخيص الجزيئي. رقاقة يؤدي استخلاص الحمض النووي، الناسخ العكسي، وPCR. يتم وصف طرق لانتاج وتشغيل الشريحة.
Abstract
التشخيص السريع والفعال يلعب دورا هاما في السيطرة على الأمراض المعدية من خلال تمكين الإدارة الفعالة للمريض والعلاج. هنا، نقدم متكاملة رقاقة ميكروفلويديك بالحرارة مع القدرة على تضخيم الأنفلونزا الناجمة عن الفيروس في مسحات المريض (NP) والبلعوم aspirates. عند تحميل عينة المريض، الجهاز ميكروفلويديك يحمل بالتسلسل من على الرقاقة تحلل الخلايا وتنقية RNA والخطوات تركيز في المرحلة الصلبة استخراج (SPE)، النسخ العكسي (RT) وتفاعل البلمرة سلسلة (PCR) في RT-PCR الدوائر، على التوالي. يتم تنفيذ نقطة النهاية الكشف باستخدام Bioanalyzer خارج رقاقة (اجيلنت تكنولوجيز، سانتا كلارا، كاليفورنيا). للأجهزة الطرفية، استخدمنا مضخة محقنة واحدة لدفع كاشف والعينات، في حين تم استخدام جهازي سخانات رقيقة مثل مصادر الحرارة لRT PCR والغرف. تم تصميم رقاقة لتكون طبقة واحدة ومناسبة لتصنيع إنتاجية عالية للحد من fabricatiفي الوقت المحدد والتكلفة. رقاقة ميكروفلويديك توفر منصة لتحليل طائفة واسعة من الفيروسات والبكتيريا، وقلة فقط من التغييرات في التصميم كاشف اللازمة لكشف مسببات الأمراض جديد لسعر الفائدة.
Introduction
تم الإبلاغ عن حالة وفاة الملايين من خلال أوبئة الأنفلونزا ثلاثة من القرن 20th 1. وعلاوة على ذلك، أعلن وباء أنفلونزا أحدث من منظمة الصحة العالمية (WHO) 2 في عام 2009، واعتبارا من أغسطس 1، 2010، 18449 حالة وفاة تم الإبلاغ من قبل منظمة الصحة العالمية 3. أظهرت هذا الوباء مرة أخرى عبء ارتفاع الأمراض المعدية، والحاجة إلى الكشف السريع والدقيق للأنفلونزا لتمكين سريع تأكيد المرض، حسب استجابة الصحة العامة والعلاج الفعال 4.
هناك العديد من الطرق المستخدمة على نطاق واسع لتشخيص الأنفلونزا، وتشمل هذه المناعية السريع، اختبار مستضد مباشرة الفلورسنت (DFA) وأساليب الثقافة الفيروسية. المناعية السريع تفتقر بشكل كبير حساسية 5-8، في حين أن الآخر طريقتين هي كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا 9. الاختبارات الجزيئية توفر مزايا متعددة بما في ذلك دورانها قصيرة sensit، الأوانivity، وأعلى نوعية. وقد تم العديد من الكيانات التجارية تعمل من أجل الاختبارات الجزيئية بسرعة (وتسمى أيضا اختبارات الحامض النووي أو ناتس) للأمراض المعدية، ويكون عدة فحوصات الانفلونزا في خطوط الأنابيب الخاصة بهم. لكن معظمها تتطلب خارج رقاقة إعداد العينات. أي من التعديلات مختبر تحسن سريري (CLIA) تنازلت الاختبارات الجزيئية دمج إعداد العينات في خرطوشة الفحص أو وحدة نمطية.
المختبر على واحد في رقاقة التكنولوجيا تلعب دورا هاما في تطوير أجهزة اختبار نقطة من الرعاية. بعد إدخال شريحة PCR الأولى في 1993 10، وقد وضعت العديد من الجهود في تطوير رقائق النووي اختبار الحمض. ومع ذلك، سوى عدد قليل من هذه دمجت إعداد العينات الخام مع التضخيم المصب.
لقد أثبتنا سابقا التصغير من عمود مرحلة استخراج الصلبة (SPE) في رقاقة ميكروفلويديك البلاستيك 11 و تطويرمنة وتعظيم الاستفادة من شريحة تدفق مستمر PCR 12. هنا، ونحن تمديد العمل السابق لدمج SPE مع RT PCR والخطوات في شريحة واحدة لإثبات التشخيص السريري وقدرتها على تضخيم الأحماض النووية من مريض مسحات (NP) والبلعوم aspirates.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تصنيع رقاقة 12
- جعل اثنين من لويحات الكريات 690R Zeonex: توزيع 8-9 غرام الكريات Zeonex بالتساوي في وسط لوحة معدنية، سخن على الصحافة ساخنة C ° 198 لمدة 5 دقائق، ثم الضغط ببطء إلى 2،500 رطل لمدة 5 دقائق. لإكمال هذه الخطوة، استخدمنا الصحافة الساخنة كارفر.
- زخرف قناة ميكروفلويديك في اللوحة مع العفن الايبوكسي. وترد تفاصيل عن تصنيع القالب في مكان آخر 12 (قناة التصميم في الشكل 2B): وضع واحد على لوحة القالب الايبوكسي؛ سخن لهم على الصحافة ساخنة عند 157 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ومن ثم ممارسة الضغط ببطء إلى 1،000 رطل لمدة 10 دقيقة . إزالة البلاك من القالب باليد أو باستخدام ملقط قبل أن يبرد. (ملاحظة: ارتداء القفازات الحرارية خلال هذه الخطوة.)
- حفر ثقوب في الشريحة تنقش على مدخل، منفذ النفايات، ومنفذ للقناة ميكروفلويديك. استخدمنا بقطر 1،25 ملمالعطر قمة الحفر لجعل الثقوب الثلاثة.
- السندات رقاقة تنقش مع آخر لوحة (في الأعلى): يغسل مع رقائق IPA، ريبونوكلياز بعيدا والماء منزوع الأيونات في تسلسل؛ على الصحافة تسخين الهواء الجاف وسخن لهم في C ° 131 لمدة 10 دقيقة ثم اضغط في 350 رطل لآخر 10 دقيقة.
- إرفاق Nanoports في مدخل، والنفايات، وباستخدام المنافذ منفذ على حدة JB ولد الايبوكسي؛ علاج لمدة 15 إلى 24 ساعة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- شطف مع 50 قناة SPE بعيدا ريبونوكلياز ميكرولتر، ثم مع 100 ميكرولتر المياه نوكلياز مجانا.
- تحميل قناة SPE مع 4 ميكرولتر من الحل تطعيم (ميثاكريلات الميثيل مع 3٪ ث / ت بينزفينون) ثم تشعبي في ميتاكريليت من احتضان لمدة 10 دقيقة في فرن 365 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية تحت الطول الموجي للأشعة فوق البنفسجية و 2،000 ميغا جول 2 / سم. إزالة الحل المتبقية ترقيع مع الفراغ. كنا الجدار الفراغ. للحصول على أفضل النتائج، يجب استخدام حل الطازجة. فإنه عادة ما يكون مقبولا، ولكن، لتخزينأعد حل في C ° 4 لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
- جعل الحل العمود SPE (جميع٪ V / V): 16٪ dimethacrylate الإيثيلين، 24٪ بوتيل ميتاكريليت، 42٪ 1-dodecanol، سيكلوهيكسانول 18٪، وإضافة 1٪ 2-dimethylamino-4-(ميثيل phenylamino)-الفينول كما البادئ الصور.
- إخراج نفس الحجم من السيليكا المجهرية الحل هو الحل العمود SPE (لجعل مزيج 1:1)، وذلك في يجف تماما 70 درجة مئوية خلال الليل في فرن الفراغ. تفريق بيليه بالنقر على أنبوب مع إغلاق الغطاء. إضافة الحل العمود SPE في أنبوب السيليكا المكروية المجففة ودوامة لخلط.
- تحميل 4 ميكرولتر من الحل SPE في نفس القناة وتشعبي ثم من قبل أشعة فوق البنفسجية لمدة 2.5 دقيقة. ثم، والوجه أكثر من شريحة وأشرق لمدة دقيقة 2.5. يجب أن يكون العمود SPE بلمرة يكون صلبة غير شفافة بيضاء.
- غسل القناة مع 500 ميكرولتر من الميثانول بنسبة 100٪ لشطف بعيدا المواد المتفاعلة الزائدة. هذا يغسل كما يزيل داخل البوليمر بوالمذيبات rogenic، وبالتالي خلق بنية المسام المفتوحة للعمود SPE عندما تجفف في الظروف المحيطة.
- إرفاق اثنين الأغشية الرقيقة سخانات إلى الجزء السفلي من الشريحة مع الشريط ناقلة للحرارة. الجانبين من سخانات تحتاج إلى أن تتماشى مع حافة واسعة لقنوات تمسخ والصلب بشكل منفصل (انظر الشكل 1).
- انتهت مكان خمس المزدوجات الحرارية في رقاقة من خلال قنوات القتلى الجانب المفتوح من كل رقاقة (انظر الشكل 2B). والمزدوجات الحرارية البقاء في هذه القنوات عبر الصحافة مناسبا. واستخدم الشريط لإصلاح مزيد من موقع المزدوجات الحرارية.
2. طريقة استخراج الصلبة المرحلة
- إعداد 96 ميكرولتر من الايثانول 70٪ مع الماء DEPC المعالجة وتعقيمها (منزوع الأيونات أو تصفيتها ميليبور).
- إضافة 4 ميكرولتر من 25X تأمين RNA إلى 96 ميكرولتر من الايثانول 70٪ في أنبوب واحد، وتكرار نفس الخليط مع الإيثانول بنسبة 100٪ في أنبوب منفصل.
- إعداد 300ميكرولتر من العازلة قناة عن طريق خلط ما يلي: 75 ميكرولتر من 6 ثيوسيانات الجوانيدين M (GuSCN)، 150 ميكرولتر من بروبانول-2، 63 ميكرولتر من المياه مجانا نوكلياز، و 12 ميكرولتر من 25X RNA الآمنة.
- إعداد 312 ميكرولتر من العازلة تحلل من خلط: 100 ميكرولتر من GuSCN M 6، 200 ميكرولتر من بروبانول-2، و 12 ميكرولتر 25X RNA الآمنة.
- تسخين الايثانول 70٪، 100٪ الإيثانول العازلة القناة، ومخازن تحلل في C ° 60 لمدة 10-20 دقيقة لتنشيط الآمنة RNA.
- لتتوازن قناة ميكروفلويديك، تشغيل المخزن المؤقت القناة من خلال قناة SPE بمعدل تدفق قدره 0.8 مل / ساعة.
- ذوبان الجليد سريعة عينة الاختبار في VTM في C ° 37 في حمام مائي، وإزالة عينة فورا من الحمام المائي بمجرد إذابة ذلك.
- أجهزة الطرد المركزي في 13000 دورة في الدقيقة عينة لمدة 10 دقيقة، ونقل 100 ميكرولتر من طاف إلى 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت تحلل. استكمال الخليط بإضافة 6 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / ميكرولتر RNA الناقل.
- دوامة لخلط، وبعد زيادة ونقصان لل5 ثانية، تحميل المحللة بأكمله إلى حقنة سم مكعب بالتركيبة لوك 1.
- تشغيل حلالة من خلال قناة SPE بمعدل تدفق قدره 0.8 مل / ساعة.
- غسل قناة SPE مع 100 ميكرولتر من الايثانول 70٪، تليها الإيثانول ميكرولتر 100 of100٪ في 1 مل / ساعة. (هناك 50 قتيلا حجم ميكرولتر في الطرف المحاقن التي لن تحصل على دفع بها، في الواقع حتى بعد 50 ميكرولتر يمر القناة.)
- وضع حقنة فارغة في علامة مل 0.5 و دفع الهواء من خلال قناة لتجف ذلك في 1 مل / ساعة.
- تشغيل 67،5 ميكرولتر من نوكلياز خالية المياه من خلال القناة لأزل الأحماض النووية محددة عند 0.5 مل / ساعة، وجمع 13،5 ميكرولتر من nanoport في ميناء النفايات. (وفقدان السوائل ويرجع ذلك إلى حجم ميكرولتر 54 قتيلا في الطرف حقنة وقناة SPE).
3. RT-PCR
- إعداد 36،5 ميكرولتر من مزيج ماجستير RT-PCR خلال الخطوة الهواء الجاف (2.12) باستخدام الكواشف في مجموعات QIAGEN RT-PCR OneStep.
- تحميل RT-PCR الكاشف في nanoport في ميناء النفايات، وتخلط مع RNA للحصول على 50 ميكرولتر RT-PCR التالية رد فعل: 13.5 ميكرولتر مزال RNA في الماء مجانا نوكلياز، 4 ميكرولتر مزيج إنزيم RT-PCR، 10 ميكرولتر حل س، 10 μl1X 1 الخطوة العازلة، 2 ميكرولتر 25 ملم MgCl 2، 1 ميكرولتر التمهيدي 50 ميكرومتر إلى الأمام 5'-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA 'C-3، 1 ميكرولتر التمهيدي ميكرومتر 50 العكسي 5'-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3 "(2)، dNTP ميكرولتر، 0.75 ميكرولتر 1.0٪ W / V BSA، 0.73 ميكرولتر PEG8000 و5،02 المياه نوكلياز ميكرولتر مجانا.
- تحميل الخليط RT-PCR في قناة RT من فراغ لطيف (كنا الفراغ الجدار) وختم Nanoport مع تركيب مغلقة.
- تطبيق 35 V لسخان 1. الحفاظ على الكواشف في قناة RT لمدة 30 دقيقة بعد سخان 1 equilibrates في C. ° 50 الحفاظ على الكواشف في قناة RT لمدة 15 دقيقة بعد equilibrates 1 سخان في 95 ° C.
- تطبيق V 27 إلى 1 و 50 سخان V لسخان 2، الانتظار حوالي ثلاث دقائق أو حتى equilibrates 1 سخان في 60 و ديز؛ C وسخان 2 equilibrates في 95 ° C.
- دفع الكواشف في القناة PCR عند 0.5 ميكرولتر / دقيقة. وينبغي أن يستغرق حوالي 20 دقيقة لالكواشف لتدفق من خلال قناة اعوج.
- كما يجعل من العينة إلى نهاية القناة اعوج، وجمع المنتجات PCR عند مخرج باستخدام pipettor بحجم مناسب والإكراميات.
4. PCR المنتجات كشفها
- نحن استخدام DNA اجيلنت حساسية عالية في اختبار للكشف عن المنتجات. لتشغيل هذا الاختبار إخراج DNA اجيلنت حساسية عالية كيت من الثلاجة 30 دقيقة قبل إجراء الاختبار.
- بدوره على Bioanalyzer وفتح البرنامج الخبراء 2100.
- تحميل ميكرولتر 1 من المنتجات PCR في الاختبار واتبع بروتوكول اجيلنت ( http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent 20Manual.pdf٪ ).
- تحليل وتسجيل البيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد نتيجة نموذجية في الشكل 3 لأنفلونزا A المصابة عينة غسل البلعوم. نظرا لكميات مختلفة من فيروس الانفلونزا في كل عينة مريض، فإن تركيز النهائي من الناتج PCR تختلف. وينبغي أن يكون نتيجة جيدة لديك انخفاض مستوى الضجيج، واثنين من قمم واضحة سلم (35 و10380 سنة مضت) وذروة منتج واحد في حجم المنتجات المصممة (107 بي بي) لعينة إيجابية. في حين أن المنتج يجب أن يكون ذروة نظريا غائبة لعناصر سلبية، لم نلاحظ زائفة قمم PCR بالقرب من مكان الانفلونزا محددة من التمهيدي-dimers تشكيل في بعض العينات. قمم متعددة المنتج تعكس التلوث المحتمل للاختبار. إذا حدث هذا، ينبغي اختبارها آخر قسامة من العينة. ويمكن استخدام هلام الكهربائي لمزيد من التحقق من نتائج الاختبار 13.
في "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50325/50325fig1highres.jpg "/>
الشكل 1. تبسيط أعلى إلى أسفل التخطيطي رقاقة. والخطوط الحمراء تظهر موضع سخانات الاتصال على الجزء السفلي من الشريحة.
الشكل 2. تدفق مقايسة ميكروفلويديك 13 (أ) صورة من اثنين من رقائق ميكروفلويديك مع المرفقة سخانات رقيقة واثنين برميل مضخة الحقنة. تم توصيل الحقن الزجاج إلى كل رقاقة مع أنابيب مرنة لتحميل الكواشف والعينات. تم لصقها ثلاثة موانئ في مداخل من قناة SPE وميناء النفايات، ومنفذ للقناة PCR (ب) قناة التصميم مع ثلاثة أقسام: إعداد العينات (SPE)، RT غرفة ومستمرة التدفق في القنوات PCR. وترد اثنين من سخانات المقاومة الثابتة عبر الشريط الحراري إلى أسفل الشريحة. وكان تدفق السوائل بين القنوات الصفحي، والتغيرات في مقاومة السوائل المسموح به لأقل صمام العملية. عمق هو 500 ميكرون لSPE والقنوات RT، وقناة PCR هو 100 ميكرون عميقة. وعلى بعد 500 ميكرومتر بعرض للعمود SPE، 1 ملم لدائرة RT، وتختلف 200 حتي 400 ميكرومتر لقطاعات واسعة وضيقة للقناة تدفق مستمر PCR. الشريحة هو 70 ملم في الطول و 25 ملم في العرض و 1.4 ملم في الطول. (ج) عملية الفحص ميكروفلويديك التدفق. يتم خلط العينة مع العازلة تحلل البلعوم، وتطبيقها على شريحة، يتم تشغيل الشريحة، ويتم قراءتها المنتجات PCR باستخدام رقاقة التجارية الكهربائي الشعري 13 اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
ن "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50325/50325fig3highres.jpg "/>
الشكل 3. على رقاقة النتيجة النهائية نقطة التشخيص. ذروة المنتج PCR هي قمة الأوسط في حجم من 107 سنة مضت. قمم الأيسر (35 بي بي) والحق (10380 بي بي) هي قمم سلم السيطرة. تركيز كل من المنتجات ذروة هي المنطقة تحت المنحنى. وهذه جداول (أ) نتيجة إيجابية دون أي ضجيج الذروة. (ب) نتيجة إيجابية مع dimers التمهيدي في 42-BP. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قدم طريقة التشخيص هنا أثبتت قدرة على شريحة متكاملة من البلاستيك ميكروفلويديك لتضخيم أنفلونزا A RNA من عينات المرضى مع خصوصية عالية وحد اكتشاف أدنى مستوى في 13 قمنا بتصميم هذه الشريحة لنقطة المحتملة للتجارب الرعاية: (أ) درجة الحرارة وfluidic تم تبسيط السيطرة، (ب) هو رقاقة منخفضة التكلفة ومناسبة لتصنيع إنتاجية عالية باستخدام حقن صب، و (ج) هي رقاقة يمكن التخلص منها والمعدة للاستخدام مرة واحدة، وبالتالي تقليل القلق من التلوث المتبادل العينة.
على الرغم من حالتنا الراهنة على رقاقة وقت التشغيل من 3 ساعة، ومنصة لدينا استخراج يحتوي مجالا واسعا لعملية التحسين. على سبيل المثال، يمكن أن يخفض غسيل جاف مرات والحق قبل شطف من خلال مزيج من زيادة معدل تدفق والحد من كميات الغسيل. وعلاوة على ذلك، يمكن خفض التكاليف عن طريق تبسيط عملية تصنيع الرقائق واستبدال مكلفة أو مرهقة شبهسوف pherals، مثل مضخات المحاقن، وإمدادات الطاقة، مع البدائل مثل مضخات حقن حقنة المتاح وحزم البطارية الصغيرة الانفتاح استخراج المرحلة الصلبة المسامية وهندسة العمود السماح لإجراء تخفيضات كبيرة في متطلبات المضخة. أيضا، مرة واحدة في تصميم رقاقة هو موحدة لتصنيع كميات كبيرة، وسوف يتم القضاء على الكثير من المزدوجات الحرارية المستخدمة في تطوير الجهاز.
أكثر من ذلك من العوامل الأخرى، ومتانة لدينا على رقاقة وحدة الكشف الأنفلونزا يعتمد على كل من التحكم في درجة الحرارة جيدة ومناسبة تسليم العينة. تعويض طفيف من درجة الحرارة على الرقاقة المطلوب، فضلا عن غير قصد متعددة تجميد ذوبان الجليد دورات للعينة الأنفلونزا، يمكن أن يقلل العائد PCR النهائي. وبصرف النظر عن هذه العوامل، يمكن أيضا الاختلافات في النتائج التي توصلنا PCR على رقاقة 13 من عينات المرضى المختلفة يمكن أن يعزى إلى: التغير في الحمل الفيروسي، ومستويات مختلفة من تلويث الخلايا البشرية و Blooد، وجود مثبطات PCR بعد استخراج الحمض النووي، وغير متوقعة 14،15 التفاعلات الكيميائية و / أو المادية بين العينات والكواشف أو اختبار الجهاز نفسه 16.
وباختصار، لقد أثبتنا جدوى لدينا رقاقة ميكروفلويديك لتضخيم الحمض النووي الريبي من فيروس الأنفلونزا A في عينات البلعوم طبيا ذات الصلة. رقاقة لديه القدرة على تطبيقها على الحمض النووي RNA أو أهداف أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد أعلن الكتاب لا المصالح المتنافسة المالية.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) منحة R01 EB008268.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G | |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G | |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML | |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml | |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 | |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 | |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML | |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 | |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 | |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 | |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 | |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 | |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 | |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 | |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 | |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V | |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML | |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 | |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 | |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 | |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A | |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 | |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
References
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- WHO | World now at the start of 2009 influenza pandemic. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/ (2009).
- WHO | Pandemic (H1N1) 2009 - update 112. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/csr/don/2010_08_06/en/ (2009).
- Wenzel, J. J., et al. Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).
- Chan, K. H., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1. Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).
- Ginocchio, C. C., et al. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. Journal of. 45, 191-195 (2009).
- Aeron, C. H., et al. Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses. Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).
- Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting. Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).
- Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. Transducer'93, seventh international conference on solid state sensors and actuators. , 924-926 (1993).
- Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics. Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).
- Cao, Q., Kim, M. -C., Klapperich, C. Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments. Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).
- Cao, Q., et al. Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens. PLoS ONE. 7, e33176 (2012).
- Rådström, P. Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit. J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).
- Andreasen, D., et al. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50, S6-S9 (2010).
