Summary
一个集成的微流体热塑性芯片已被开发用于作为一种分子诊断。该芯片进行核酸提取，逆转录和PCR。用于制造和运行芯片的方法中描述。
Abstract
快速和有效的诊断中发挥了重要作用，实现有效的病人管理和治疗，在控制传染病。在这里，我们提供了一个完整的微热塑性芯片的能力放大A型流感病毒在患者鼻咽部拭子和吸出物（NP）。当加载的患者样本，微流器件依次进行的片上的细胞裂解，RNA的纯化和浓缩步骤的固相萃取（SPE），反转录（RT）和聚合酶链反应（PCR），在RT-PCR室内，分别。终点检测使用片外生物分析仪（安捷伦科技，圣克拉拉，CA）。用于外围设备，我们使用一个单一的注射器泵进行驱动的试剂和样本，而两个薄膜加热器用作热源的RT和PCR室。该芯片被设计成单一的层和适合高吞吐量制造减少fabricati的时间和成本。微流控芯片分析各种病毒和细菌，只限于需要发现新的病原体的试剂设计提供了一个平台。
Introduction
据报道，在20世纪的三次流感大流行的数以百万计的人死亡。此外，最近的流感大流行是在2009年由世界卫生组织（WHO）宣布，截至2010年8月1日报道了世界卫生组织3，18,449人死亡。再次证明了这一流行病的高负担的传染性疾病，需要进行流感快速，准确的检测，实现快速疾病的确认，适当的公共卫生反应和有效的治疗方法4。
广泛用于诊断流感的方法有好几种，包括快速免疫测定，直接荧光抗原测试（DFA）和病毒培养方法。快速免疫显着缺乏敏感性5-8，而其他两种方法是劳动密集和耗时9。分子检测提供了多种优势，包括短匝左右的时间，高SENSITivity，和较高的特异性。的一些商业机构已着手对快速分子检测（也称为核酸检测或NAT）的传染性疾病，和一些有流感检测管线。但他们中的大多数需要关闭芯片的样品制备。没有放弃的分子测试将样品制备到试验盒或模块的临床实验室改进修正案（CLIA）。
实验室上的一个芯片技术点医疗检测设备的发展起着重要的作用。出台后的第一个PCR芯片在1993年10，无数的努力，已投入开发核酸检测芯片。然而，只有少数的这些集成的粗样品制备与下游扩增。
之前我们已经证实成塑料微流体芯片11的小型化的固相萃取柱（SPE）和开发和优化的连续流PCR芯片12。在这里，我们扩展了以前的工作整合到一个芯片上，为临床诊断和SPE与RT和PCR步骤展示其能力，从病人鼻咽部拭子和吸出物（NP）核酸扩增。
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Protocol
1。芯片制造12
- 车型两个斑块从ZEONEX 690R粒料：8-9克ZEONEX粒料均匀地分配在中心上的金属板，预热5分钟，在198℃下加热的压榨，然后慢慢地施加压力2500 psi的另外5分钟。要完成这一步，我们使用了卡弗热压。
- 浮雕微流体通道中的牌匾用环氧模。在模具上制造的详情概述别处12（在图2b中的通道设计）：把一个斑块上的环氧模;预热他们的热压机上，在157℃下进行10分钟，然后慢慢地施加压力至1,000 psi另一个10分钟的。从模具用手工或用钳子冷却下来之前删除的牌匾。 （ 注意：在此步骤中，戴上隔热手套）。
- 钻孔，在入口处，废弃口，和微流体通道的出口的压花芯片。我们使用的1.25毫米直径ETER钻头的三个孔。
- 债券压花芯片与另一斑块（顶部）：洗净芯片用IPA，RNA酶客和去离子水的顺序;空气干燥和预热它们在131℃的热压机上10分钟，并然后按在350 psi的另一个10分钟。
- 附加NanoPorts是在入口处，浪费，而且出油口，分别用JB焊接环氧治愈15至24小时，每制造商的说明。
- 冲洗SPE通道与50μLRNA酶客场，然后用100μl无核酸酶的水。
- 装入SPE 4微升的的接枝溶液（3％w / v的二苯甲酮与甲基丙烯酸甲酯）的信道，然后通过在UV烘箱中在365nm的紫外线的波长和2000毫焦/厘米2下孵育10分钟，交联的甲基丙烯酸酯。与真空除去残余的接枝溶液。我们使用的壁真空。为了获得最佳结果，应使用新鲜溶液。它通常是可以接受的，然而，存储制备的溶液中，在4℃达一周。
- 使SPE柱溶液（所有的v / v％的）：16％的乙二醇二甲基丙烯酸酯，24％甲基丙烯酸丁酯，42％的1 - 十二烷醇，18％环己醇中，并添加1％，2 - 二甲基氨基-4 - （甲基 - 苯基氨基） - 苯酚作为光引发剂。
- 取出硅胶微球溶液相同体积的溶液（作出的1:1混合物）作为固相萃取柱，并完全干燥，在70℃下在真空烘箱中过夜。分手的沉淀攻管盖上盖子。添加到干燥的二氧化硅微球管和旋涡混合固相萃取柱的解决方案。
- 4微升的SPE溶液装入到相同的信道，然后交联，通过UV照射2.5分钟。然后，翻转芯片和照射为2.5分钟。聚合固相萃取柱应该是白色不透明的固体。
- 洗净用500μl的100％甲醇中洗去过量的反应物的通道。洗也消除内聚合物宝rogenic溶剂，从而创造了开放的孔隙结构在环境条件下干燥时的固相萃取柱。
- 将两个薄膜加热器的芯片与导热胶带的底部。加热器的两侧，需要对齐的变性和退火分开（参见图1）的边缘的宽的通道。
- 止地点5成的芯片通过死的热电偶的每个芯片的开口侧通道（参见图2b）。留在这些渠道，通过压合的热电偶。磁带被用于进一步固定的位置的热电偶。
2。固相萃取法
- 准备96μl的70％乙醇，用DEPC处理过的和高压灭菌的水（去离子或Millipore过滤）。
- 加入4微升25X核糖核酸安全的96μl的70％乙醇，在一个管中，并重复相同的混合物用100％乙醇在一个单独的管。
- 准备300微升通过混合下列：75微升6M的硫氰酸胍（GuSCN），150μl的2 - 丙醇，63微升的无核酸酶的水，和12微升25X核糖核酸安全通道缓冲器。
- 准备312微升的裂解缓冲液通过混合：100微升6 M GuSCN，200μl的2 - 丙醇，和12μl25X核糖核酸安全。
- 热的70％乙醇，100％乙醇中，信道缓冲液和裂解缓冲液，在60℃下10-20分钟激活RNA安全。
- 要平衡的微流体通道，在0.8毫升/小时的流速通过SPE通道运行通道缓冲区。
- 快速解冻在VTM测试样品在37℃水浴中，并立刻从水浴中取出样品，只要它被解冻。
- 离心样品在13,000 rpm离心10分钟，并转移入300μl的裂解缓冲液中加入100μl的上清液。完成该混合物通过加入6微升1微克/微升的载体RNA。
- 涡混合，分割后为5秒，加载整个裂解成鲁尔乐1毫升注射器。
- 运行溶解物通过SPE通道在流速为0.8毫升/小时。
- 洗净SPE信道，然后用100μl的70％乙醇100微升of100％的乙醇中，在1毫升/小时。 （50μL死体积的注射器针头，不会延后，所以实际上只有50微升通过的通道）。
- 定位在0.5毫升标记一个空的注射器，并推动空气通过该信道，以干燥在1毫升/小时。
- 运行67.5微升的无核酸酶的水，通过该信道，以洗脱结合的核酸，以0.5毫升/小时，并收集13.5微升从nanoport在废物端口。 （流体损失是由于注射器尖端和SPE信道的54微升的死体积。）
3。 RT-PCR方法
- 准备36.5微升的RT-PCR主混合物在空气中干燥工序（2.12）中的Qiagen公司的一步法RT-PCR试剂盒中使用的试剂。
- 加载RT-PC在废弃口的nanoport，ŕ试剂和混合RNA得到以下50μLRT-PCR反应：13.5微升洗脱RNA在无核酸酶的水，4μLRT-PCR酶混合物，10微升Q的解决方案，10μl1X一步骤缓冲液，2μl的25mM的MgCl 2，1μl的50μM的正向引物5'-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3'，1微升50μM的反向引物5'-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3 '，2微升的dNTP，0.75微升1.0％w / v的BSA，0.73微升PEG8000和5.02微升无核酸酶的水。
- RT-PCR的混合物装入到的RT信道通过温和真空（我们使用的壁真空）和密封的Nanoport与一个封闭的拟合。
- 35 V加热器1。 RT中的信道保持试剂加热器1在50℃下平衡30分钟后保持的试剂中的RT信道为15分钟后，在95℃下的加热器1达到平衡
- 27 V加热器1和50 V加热器2，等待约3分钟或直到加热器1达到平衡，在60和德克，C和加热器2的平衡，在95℃下
- 推到PCR试剂0.5μl/ min的通道。这需要大约20分钟，试剂流经蛇形通道。
- 作为样品，使得它的蛇形通道的端部，收集的PCR产物的出口处使用一个适当大小的移液器和小费。
4。 PCR产品检测
- 我们使用的是安捷伦高灵敏度DNA测试，以检测产品。为了运行这个测试的安捷伦高灵敏度DNA试剂盒从冰箱中30分钟测试前。
- 生物分析仪打开并打开2100专家软件。
- 装入1微升的PCR产物进入测试和遵循安捷伦的协议（ http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent％20Manual.pdf ）。
- 分析，并记录数据。
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Representative Results
一个典型的结果显示在图3为A型流感感染的鼻咽冲洗标本。由于流感病毒的不同量的每个患者标本中，PCR产物的终浓度会有所不同。一个很好的结果应具有低噪声，两个明显的阶梯峰值（35和10380 bp的）和一个单一的产物峰，在所设计的产品的尺寸（107 bp）的阳性样品。虽然产物峰，理论上应该不存在为阴性对照，我们确实观察到虚假的PCR峰在一些样品中引物二聚体的形成附近的感特定的位点。多产物峰的测试反映了潜在的污染。如果发生这种情况，应该再另取的样品。凝胶电泳，可以用于进一步验证试验结果13。
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图1。简化自上而下芯片的原理图。红色的轮廓显示的位置的底部上的芯片的接触加热器。
图2。的微流体检测流13（a）图像的两个微流体芯片的连接的薄膜加热器和双针筒注射器泵。玻璃注射器被连接到每个芯片的与柔性管加载试剂和样品。三个端口被粘在SPE通道和废弃口，和出口的PCR信道的入口。（二）具有三个部分的通道设计：样品制备（SPE），RT室和连续流动式PCR通道。通过连接两个固定电阻炉热敏带芯片的底部。的通道之间的流体流动是层流，并允许操作阀的流体阻力的变化。的深度为500μm对SPE和RT通道，和PCR信道是100微米深。的宽度为500微米的固相萃取柱，1毫米的RT室，和从200到400微米的宽的和窄的部分的连续流动式PCR信道变化。该芯片是70毫米长，25毫米宽，1.4毫米的高度（三）微流体检测处理流程。鼻咽样本混合，用裂解缓冲液，适用于芯片，该芯片运行，商业毛细管电泳芯片的使用，对PCR产物进行阅读。 点击这里查看大图 。
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图3。芯片的终点诊断结果。PCR产物峰，中峰的大小107个基点。左（35基点），右峰（10380 BP）是的控制梯形图峰。每个峰的产品的浓度的曲线下面积。这些表列。（一）积极的结果没有任何噪音峰值。（二）引物二聚体的阳性结果在42个基点。 点击此处查看大图 。
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Discussion
这里给出的诊断方法表现出的能力的集成微流控塑料芯片从患者标本放大A型流感RNA，具有较高的特异性和检出限低， 我们设计该芯片潜在照顾测试点：（一）温度和流体控制被简化，（b）该芯片是成本低，适合于高吞吐量的制造，使用注射成型，及（c）的芯片是一次性的，并且预期的一次性使用，从而降低样品的交叉污染的关注。
虽然我们目前的芯片上的运行时间3小时，我们的采油平台包含了充足的空间进行过程优化。例如，洗涤和干燥时间通过增加流速和减少洗涤卷的组合，可以减少之前洗脱。此外，成本可以精简的芯片制造工艺和更换昂贵或繁琐的周围修剪pherals，如注射泵，电源，用替代品，如一次性注射器输液泵和开放的固相萃取柱的几何形状和孔隙度小的电池组可以显着减少泵的要求。此外，一旦芯片设计是标准化的大批量生产，很多设备的开发中使用的热电偶将被淘汰。
更何况比等因素影响，鲁棒性的片上流感检测模块依赖于良好的温度控制和适当的样品交接的。轻微的偏移，可以从所希望的芯片上的温度，以及无意多个冻结 - 解冻周期流感试样既减少的PCR最终收率。除了 这些因素外，也可以在我们的片上13个不同的患者标本PCR结果的变化可以归结为：病毒载量的变化，不同程度的污染人体细胞和布卢天; PCR抑制剂的存在下，核酸提取后，14,15和未预料到的标本和测试试剂或设备本身16之间的化学和/或物理反应。
总之，我们已经证明我们的微流控芯片由A型流感病毒在医疗相关的鼻咽样本放大RNA的可行性。该芯片有可能被应用到其他的DNA或RNA靶的。
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Disclosures
作者声明没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
这项研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）的资助R01 EB008268。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G | |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G | |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML | |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml | |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 | |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 | |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML | |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 | |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 | |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 | |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 | |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 | |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 | |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 | |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 | |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V | |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML | |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 | |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 | |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 | |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A | |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 | |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
References
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