Summary
En integreret microfluidic termoplastisk chip er udviklet til brug som en molekylær diagnostisk. Chippen udfører nukleinsyre ekstraktion, revers transkriptase og PCR. Fremgangsmåder til fremstilling og drift chippen er beskrevet.
Abstract
Hurtig og effektiv diagnostik spiller en vigtig rolle i at kontrollere smitsomme sygdomme ved at aktivere en effektiv patient håndtering og behandling. Her præsenteres en integreret mikrofluid termoplastisk chip med evnen til at amplificere influenza A-virus i patientens nasopharynx (NP) podninger og aspirater. Ved indlæsning af patientprøven, sekventielt den mikrofluid enhed udfører on-chip cellelyse, RNA-oprensning og koncentrering i fastfase-ekstraktion (SPE), revers transkription (RT) og polymerasekædereaktionen (PCR) i RT-PCR kamre, hhv. Slutpunkt detektering udføres med en off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Efter enheder, anvendte vi en enkelt sprøjtepumpe at drive reagens og prøver, mens to tyndfilm varmeapparater blev anvendt som varmekilder til RT og PCR kamre. Chippen er designet til at være enkelt lag og egnet til high throughput fremstilling at reducere fabricatipå tid og omkostninger. Den mikrofluid chip er en platform til at analysere en lang række virus og bakterier, kun begrænset af ændringer i reagens design nødvendige for at detektere nye patogener af interesse.
Introduction
Millioner af dødsfald er rapporteret i løbet af de tre influenzapandemier i det 20. århundrede 1. Desuden blev den seneste influenzapandemi anmeldt af World Health Organization (WHO) 2 i 2009, og som 1. august 2010 blev 18.449 dødsfald rapporteret af WHO 3. Denne pandemi demonstreret den store byrde af smitsomme sygdomme, og behovet for hurtig og nøjagtig påvisning af influenza, så hurtigt sygdom bekræftelse, passende folkesundhedsmæssig reaktion og effektiv behandling 4.
Der findes flere metoder i vid udstrækning anvendes til diagnosticering af influenza, disse omfatter hurtige immunoassays, direkte fluorescerende antigen test (DFA) og virale dyrkningsmetoder. Rapid immunoassays dramatisk mangler følsomhed 5-8, mens de to andre metoder er arbejdskrævende og tidskrævende 9. Molekylære test tilbyder flere fordele, herunder en kort turn-around tid, høj SENSITivity, og højere specificitet. Adskillige kommercielle foretagender har arbejdet hen imod hurtige molekylære test (også kaldet nukleinsyre-test eller NAT) for smitsomme sygdomme, og flere har influenza assays i deres rørledninger. Men de fleste af dem kræver off-chip prøveforberedelse. Ingen af det kliniske laboratorium Improvement Ændringer (cLIA) afkald molekylære test inkorporere prøveforberedelse i analysen patron eller modul.
Lab-on-a-chip teknologi spiller en vigtig rolle i udviklingen af point-of-care testanordninger. Efter indførelsen af den første PCR-chip i 1993 10, er mange bestræbelser blevet bragt i udviklingen af nucleinsyre-test chips. Det er dog kun et fåtal af disse har integreret råt prøveforberedelse med downstream forstærkning.
Vi har tidligere demonstreret miniaturisering af et fastfaseekstraktionskolonne (SPE) i en plast mikrofluid chip 11 og den udviklerling og optimering af en kontinuerlig strøm PCR chip 12. Her vil vi udvide det hidtidige arbejde for at integrere SPE med RT og PCR trin i en enkelt chip til klinisk diagnostik og vise sin evne til at forstærke nukleinsyrer fra patientens nasopharynx (NP) podninger og aspirater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Chip Fabrication 12
- Lav to plaques fra Zeonex 690R pellets: distribuere 8-9 g Zeonex pellets jævnt i centrum af en metalplade, forvarmning på den opvarmede presse ved 198 ° C i 5 minutter, og derefter anvende trykket langsomt til 2.500 psi i yderligere 5 min. For at fuldføre dette trin, vi brugte en Carver varm presse.
- Præge mikrofluid kanal i plakken med en epoxy støbeform. Oplysninger om formen fremstilling er beskrevet andetsteds 12 (kanal design i figur 2b): sætte en plaque på epoxy formen, forvarme dem på den opvarmede presse ved 157 ° C i 10 minutter og derefter anvende trykket langsomt til 1.000 psi i yderligere 10 minutter . Fjern plak fra formen med hånden eller ved hjælp af en tang, før det køler ned. (Bemærk: slid termiske handsker under dette trin.)
- Bore huller i den prægede chip ved indløbet, affald port, og udløbet fra mikrofluid kanal. Vi brugte en 1,25 mm diameter bor til at foretage de tre huller.
- Binding det prægede chip med en anden plade (øverst): Vask chips med IPA, RNAse Away og deioniseret vand i rækkefølge; lufttørre og forvarme dem på den opvarmede presse ved 131 ° C i 10 minutter og tryk ved 350 psi i en anden 10 min.
- Vedhæft Nanoports ved indløbet, affald og udløbsportene separat bruger JB Weld Epoxy, hærde i 15 til 24 timer i henhold til fabrikantens anvisninger.
- Skyl SPE kanal med 50 ul RNAse Away, efterfulgt af 100 ul nukleasefrit vand.
- Indlæse SPE kanal med 4 pi af podeopløsningen (methylmethacrylat med 3% vægt / volumen benzophenon) og derefter tværbinde methacrylat ved inkubering i 10 minutter i en UV-ovn under 365 nm UV-bølgelængde og 2000 mJ / cm2. Fjerne resterende podeopløsningen med vakuum. Vi brugte væggen vakuum. For de bedste resultater, bør en frisk opløsning anvendes. Det er normalt acceptabelt, at lagre enfremstillet opløsning ved 4 ° C i op til en uge.
- Gøre SPE-søjle opløsning (alle vol / vol%): 16% ethylendimethacrylat, 24% butylmethacrylat, 42% 1-dodecanol, 18% cyclohexanol, og der tilsættes 1% 2-dimethylamino-4-(methyl-phenylamino)-phenol som fotoinitiator.
- Tegne det samme volumen af silicamikrosfærer opløsning som SPE-søjle opløsning (lave en 1:1-blanding), og fuldstændigt tørre den ved 70 ° C natten over i en vakuumovn. Bryd op pillen ved at trykke på røret med låget lukket. Tilføj SPE kolonne løsning i den tørrede silica mikrosfære glasset og vortex for at blande.
- Load 4 pi af SPE opløsning i den samme kanal, og derefter tværbinde det ved UV-bestråling i 2,5 minutter. Derefter vende chippen over og bestråle til en anden 2,5 min. Den polymeriserede SPE-søjle bør være et opakt hvidt fast stof.
- Vask kanalen med 500 pi 100% methanol for at skylle væk overskydende reaktanter. Denne vask fjerner også inden for polymer porogenic opløsningsmidler og dermed skabe den åbne porestrukturen af SPE-søjle, når den tørres under omgivelsesbetingelser.
- Fastgør to tynd-film varmeapparater til bunden af chippen med termisk ledende tape. Siderne af varmelegemerne skal tilpasses med kanten af de brede kanaler til denaturering og annealing separat (se figur 1).
- Sted fem termoelementer i chippen gennem de døde slut åbne side kanaler i hvert kredsløb (se figur 2b). Termoelementerne bliver i disse kanaler via prespasning. Båndet blev anvendt til yderligere at fastgøre placering af termoelementer.
2. Solid Phase Extraction Method
- Forbered 96 pi af 70% ethanol med DEPC-behandlet og autoklaveret vand (deioniseret eller Millipore-filtreret).
- Tilsættes 4 pi af 25X RNA Skaf til 96 pi af 70% ethanol i et rør, og duplikere den samme blanding med 100% ethanol i et separat rør.
- Forbered 300pi kanal buffer ved at blande følgende: 75 pi af 6 M guanidinthiocyanat (GuSCN), 150 gl af 2-propanol, 63 ul nukleasefrit vand, og 12 pi 25X RNA Sikker.
- Forbered 312 ul lysepuffer ved blanding af: 100 ul 6 M GuSCN, 200 pi 2-propanol, og 12 pi 25X RNA Sikker.
- Opvarm 70% ethanol, 100% ethanol, kanal-puffer og lyse-buffere ved 60 ° C i 10-20 min for at aktivere RNA Secure.
- Til ækvilibrering af mikrofluid kanal, køre kanalen pufferen gennem SPE kanal ved en strømningshastighed på 0,8 ml / time.
- Quick-tø prøven i VTM ved 37 ° C i vandbad, og fjern prøven straks fra vandbadet, så snart det er optøet.
- Centrifuger prøven ved 13.000 rpm i 10 min, og overføre 100 ul af supernatanten i 300 ul af lysisbuffer. Færdiggøre blandingen ved tilsætning af 6 pi 1 ug / ul bærer-RNA.
- Vortex at blande, og efter spin for5 sekunder, indlæse hele lysat i en Luer-lok 1 cc sprøjte.
- Kør lysat gennem SPE kanal ved en strømningshastighed på 0,8 ml / time.
- Vask SPE kanal med 100 ul 70% ethanol, efterfulgt af 100 pi of100% ethanol ved 1 ml / time. (Der er en 50 pi døde volumen i sprøjtespidsen, som ikke bliver skubbet ud, således faktisk kun 50 pi går igennem kanalen.)
- Placere en tom sprøjte på 0,5 ml mærket og skubbe luft gennem kanalen for at tørre det ved 1 ml / time.
- Kør 67,5 pi nuclease-frit vand gennem kanalen for at eluere de bundne nucleinsyrer ved 0,5 ml / time, og indsamle 13,5 pi fra nanoport i affaldet port. (Den flydende tab skyldes de 54 pi døde volumen i sprøjtens spids og SPE-kanalen.)
3. RT-PCR
- Forbered 36,5 ul af RT-PCR Master Mix under lufttørre trin (2,12) ved anvendelse af reagenserne i en Qiagen OneStep RT-PCR-kits.
- Indlæs RT-PCR reagens i nanoport i affaldet havn, og bland med RNA for at få følgende 50 pi RT-PCR reaktion: 13,5 ul eluerede RNA i nukleasefrit vand, 4 gl RT-PCR enzymblanding, 10 pi Q opløsning, 10 μl1X en trin buffer, 2 pl 25 mM MgCl2, 1 pi 50 pM forward primer 5'-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3 ', 1 pi 50 pM reverse primer 5'-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3 ', 2 pi dNTP, 0,75 pi 1,0% vægt / volumen BSA, 0,73 pi PEG8000 og 5,02 pi nukleasefrit vand.
- Indlæse RT-PCR blandingen i RT-kanalen ved forsigtig vakuum (vi bruges væggen vakuum) og forsegle Nanoport med en lukket fitting.
- Påfør 35 V til varmelegeme 1. Holde reagenserne i RT-kanalen i 30 minutter efter ovnen 1 ækvilibrerer ved 50 ° C. Holde reagenserne i RT-kanalen i 15 minutter, efter at varmerens 1 ækvilibrerer ved 95 ° C.
- Påfør 27 V til varmelegeme 1 og 50 V til varmelegeme 2, skal du vente omkring tre minutter, eller indtil varmelegeme 1 afbalanceres ved 60 & deg; C og varmelegeme 2 ækvilibrerer ved 95 ° C.
- Skubbe reagenserne til PCR-kanalen ved 0,5 ul / min. Det bør tage omkring 20 min for reagenserne til at strømme gennem den slangeformede kanal.
- Da prøven gør det til enden af den slangeformede kanal, indsamle de PCR-produkter ved udløbet under anvendelse af en hensigtsmæssigt dimensioneret pipettor og spids.
4. PCR-produkter Detektion
- Vi bruger en Agilent High Sensitivity DNA-test til påvisning af produkterne. Hvis du vil køre denne test tage ud Agilent Høj følsomhed DNA Kit fra køleskabet 30 minutter før testning.
- Tænd Bioanalyzer og åbn 2100 Expert software.
- Indlæse 1 pi af PCR-produkterne ind i afprøvning og følge Agilent protokol ( http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent% 20Manual.pdf ).
- Analysere og registrere data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et typisk resultat er vist i figur 3 for en influenza A inficeret nasopharyngeal vask prøve. På grund af de forskellige mængder af influenzavirus i hver patientprøve, vil den endelige koncentration af PCR-produkt variere. Et godt resultat skal have lav støj, to klare stige toppe (35 og 10.380 bp) og et enkelt produkt top ved designet produkt størrelse (107 bp) for den positive prøve. Mens produktet peak teoretisk skulle være fraværende i negative kontroller, vi har respekteret falske PCR toppe nær influenza-specifikke locus fra primer-dimerer formation i nogle prøver. Flere produkter toppe afspejler potentiel forurening af testen. Hvis dette sker, skal en anden portion af prøven testes igen. Gelelektroforese kan bruges til yderligere kontrol af testresultaterne 13.
i "fo: src =" / files/ftp_upload/50325/50325fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Forenklet top down chip skematisk. De røde omrids viser placeringen af kontakt varmeapparater på bunden af chippen.
Figur 2. Den mikrofluid assay flow 13. (A) Billede af to mikrofluid chips med vedhæftede tyndfilm vandvarmere og to-tønde sprøjtepumpe. Glassprøjter blev forbundet til hver chip med fleksible slange til at indlæse reagenser og prøver. Tre porte blev limet på indløbene af SPE kanal og affaldet port, og udløbet af PCR kanal (b) Channel design med tre sektioner:. Prøveforberedelse (SPE), RT kammer og kontinuerlig strøm PCR kanal. To faste modstandsvarmeelementer er bundet via termisk tape til bunden af chippen. Fluidstrømning mellem kanalerne var laminar, og ændringer i fluidmodstand tilladt for ventil-less operation. Dybden er 500 um for SPE-og RT-kanaler, og PCR-kanalen er 100 um dyb. Bredden er 500 um for SPE-søjle, 1 mm til RT kammeret, og varierer fra 200 til 400 um til de brede og smalle dele af den kontinuerlige strøm PCR kanal. Chippen er 70 mm lang, 25 mm i bredden og 1,4 mm i højden. (C) Mikrofluid assay procesforløbet. Den nasopharyngeal prøve blandes med lysebuffer, påført på chippen, er chippen køre, og PCR-produkterne er læst ved hjælp af et kommercielt kapillarelektroforese chip. 13 se større tal .
n "fo: src =" / files/ftp_upload/50325/50325fig3highres.jpg "/>
Figur 3. På chip slutpunkt diagnostiske resultat. PCR-produktet peak er den midterste top på størrelse med 107 bp. Venstre (35 bp) og højre toppe (10.380 bp) er kontrol-stigen toppe. Koncentrationen af produkterne fra hver top er arealet under kurven. Disse er anført. (A) positivt resultat uden støj højdepunkt. (B) positivt resultat med primer-dimerer ved 42 bp. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den diagnostiske metode præsenteret her viste evnen hos en integreret mikrofluid plastic chip at amplificere influenza A RNA fra patientprøver med høj specificitet og en lav påvisningsgrænse 13 Vi har designet denne chip for potentielle point of care test:. (A) temperaturen og strømningstekniske kontrol blev forenklet, (b) chippen er billigt og egnet til high throughput fremstilling ved hjælp af sprøjtestøbning, og (c) chippen er til engangsbrug og beregnet til engangsbrug, hvorved bekymring prøve krydskontaminering.
Selv om vores nuværende on-chip runtime på 3 timer, indeholder vores udvinding platform rigelig plads til procesoptimering. For eksempel kunne vaske og tørre gange lige før eluering reduceres ved en kombination af forøge strømningshastigheden og reducere vask mængder. Endvidere kan omkostningerne trimmes ved at strømline chip fabrikationsproces og erstatte dyre eller besværlige peripherals, såsom sprøjtepumper, strømforsyning, med alternativer som engangssprøjte infusionspumper og små batteripakker åbning af fastfaseekstraktionskolonne geometri og porøsitet vil give mulighed for betydelige reduktioner i pumpen krav. Også, når den chip design er standardiseret for høj volumen produktion, vil mange af de termoelementer, der anvendes i anordningen udvikling fjernes.
I højere grad end andre faktorer, afhænger robustheden af vores on-chip influenza detektions modulet på både god temperaturkontrol og passende stikprøve aflevering. Lille forskydning fra den ønskede on-chip temperatur, samt utilsigtede flere fryse-tø cykler af influenza prøven, kan både reducere den endelige PCR-udbyttet. Ud over disse faktorer, kan variationerne i vores on-chip PCR-resultaterne 13 fra forskellige patientprøver også tilskrives: Variation i viral load, forskellige niveauer af kontaminerende humane celler og Blood; tilstedeværelse af PCR-inhibitorer efter nukleinsyre ekstraktion, 14,15 og uventede kemiske og / eller fysiske reaktioner mellem enhederne og de testreagenser eller selve enheden 16.
Sammenfattende har vi vist, hvad vi mikrofluid chip at amplificere RNA fra influenza A virus i medicinsk relevante nasopharyngeale prøver. Chippen har potentialet til at blive anvendt til andre DNA-eller RNA-mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har erklæret ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud R01 EB008268.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G | |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G | |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML | |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml | |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 | |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 | |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML | |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 | |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 | |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 | |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 | |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 | |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 | |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 | |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 | |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V | |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML | |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 | |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 | |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 | |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A | |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 | |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
References
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- WHO | World now at the start of 2009 influenza pandemic. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/ (2009).
- WHO | Pandemic (H1N1) 2009 - update 112. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/csr/don/2010_08_06/en/ (2009).
- Wenzel, J. J., et al. Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).
- Chan, K. H., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1. Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).
- Ginocchio, C. C., et al. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. Journal of. 45, 191-195 (2009).
- Aeron, C. H., et al. Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses. Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).
- Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting. Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).
- Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. Transducer'93, seventh international conference on solid state sensors and actuators. , 924-926 (1993).
- Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics. Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).
- Cao, Q., Kim, M. -C., Klapperich, C. Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments. Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).
- Cao, Q., et al. Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens. PLoS ONE. 7, e33176 (2012).
- Rådström, P. Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit. J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).
- Andreasen, D., et al. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50, S6-S9 (2010).
