Summary
Een geïntegreerde microfluïdische thermoplastische chip is ontwikkeld voor gebruik als een moleculaire diagnostische. De chip voert nucleïnezuur extractie, reverse transcriptase, en PCR. Werkwijzen voor het vervaardigen en gebruiken van een chip worden beschreven.
Abstract
Snelle en effectieve diagnostiek spelen een belangrijke rol in het controleren van infectieziekten door deze in staat effectieve behandeling van de patiënt en de behandeling. Hier geven we een geïntegreerde microfluïdische chip thermoplastische de mogelijkheid om influenza A virus in nasofaryngeale patiënt (NP) uitstrijkjes en zuigt amplificeren. Bij het laden van het monster, de microfluïdische apparaat voert sequentieel op-chip cellyse RNA zuivering en concentratie in de vaste fase extractie (SPE), reverse transcriptie (RT) en polymerase kettingreactie (PCR) in RT-PCR kamers, respectievelijk. Eindpunt detectie wordt uitgevoerd met behulp van een off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Voor randapparatuur, gebruikten we een injectiespuit pomp reagens en monsters rijden, terwijl twee dunne film verwarmingstoestellen werden gebruikt als warmtebron voor de RT en PCR kamers. De chip is ontworpen voor een laag en geschikt voor high throughput productie naar de Fabricati te verminderenop tijd en kosten. De microfluïdische chip biedt een platform voor allerlei virussen en bacteriën, alleen beperkt door veranderingen in ontwerp reagens om nieuwe pathogenen plaats detecteren analyseren.
Introduction
Miljoenen doden zijn gemeld tijdens de drie grieppandemieën van de 20e eeuw 1. Bovendien werd de meest recente grieppandemie uitgeroepen door de World Health Organization (WHO) 2 in 2009, en vanaf 1 augustus 2010, 18.449 sterfgevallen werden gemeld door de WHO 3. Deze pandemie toonde nogmaals de hoge belasting van besmettelijke ziekten, en de behoefte aan snelle en accurate detectie van influenza te vasten ziekte bevestiging, geschikt voor de volksgezondheid respons en effectieve behandeling 4 mogelijk te maken.
Er zijn verschillende methoden voor de diagnose gebruikte influenza, omvatten snelle immunoassays, direct fluorescent antigen testen (DFA) en virale kweekmethoden. Rapid immunoassays dramatisch niet gevoelig 5-8, terwijl de andere twee methoden zijn arbeidsintensief en tijdrovend 9. Moleculaire tests bieden meerdere voordelen, waaronder een korte doorlooptijd, hoge Sensitivity en hogere specificiteit. Verschillende commerciële entiteiten hebben gewerkt in de richting van een snelle moleculaire tests (ook wel nucleïnezuur tests of NAT) voor infectieziekten, en een aantal hebben influenza testen in hun pijpleidingen. Maar de meeste van hen vereisen off-chip monstervoorbereiding. Geen van de Clinical Laboratory Improvement Wijzigingen (CLIA) afgezien moleculaire tests monstervoorbereiding te nemen in de test cartridge of module.
Lab-on-a-chip technologie speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van point-of-care tests. Na de introductie van de eerste PCR chip in 1993 10 zijn talrijke inspanningen aan het ontwikkelen nucleïnezuur test chips. Echter, slechts een paar van deze zijn geïntegreerd ruwe monstervoorbereiding met downstream versterking.
We hebben eerder aangetoond miniaturisatie van een vaste fase extractiekolom (SPE) in een plastic microfluïdische chip 11 en de ontwikkelingment en optimalisatie van een continue stroom PCR chip 12. Hier breiden we het eerdere werk van de SPE te integreren met RT-en PCR-stappen in een enkele chip voor klinische diagnostiek en blijk geven van haar vermogen om nucleïnezuren van de patiënt nasofaryngeale (NP) swabs en zuigt versterken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Chip Fabrication 12
- Maak twee platen van Zeonex 690R pellets: verdelen 8-9 gram Zeonex pellets in het midden van een metaalplaat Verwarm de verwarmde pers bij 198 ° C gedurende 5 min, en vervolgens langzaam toe te passen druk tot 2500 psi nog 5 min. Om deze stap te voltooien, hebben we gebruik gemaakt van een Carver warme pers.
- Embos de microfluïdische kanaal in de plaquette met een epoxy mal. Details over de matrijs fabricage elders 12 (kanaalontwerp in Figuur 2b) beschreven: plaats een plaque op de epoxy matrijs; voorverwarmen ze op de verwarmde pers bij 157 ° C gedurende 10 min en vervolgens toepassen druk langzaam tot 1000 psi nog 10 minuten . Verwijder de plaque uit de mal met de hand of met behulp van een tang voordat het afkoelt. (Opmerking: draag thermische handschoenen tijdens deze stap.)
- Boorgaten in het reliëf chip bij de inlaat, afvoerpoort en de uitlaat van de microfluïdische kanaal. We gebruikten een 1,25 mm diameter boor de drie gaten te maken.
- Bond het reliëf chip met een andere plaque (boven): Was de chips met IPA, RNAse Away en gedeïoniseerd water in volgorde, droging en verwarm ze op de verwarmde pers bij 131 ° C gedurende 10 minuten en vervolgens op 350 psi nog eens 10 min.
- Bevestig Nanoports bij de inlaat, afval en de uitlaatpoorten afzonderlijk met JB Weld Epoxy; uitharden gedurende 15 tot 24 uur volgens de fabrikant.
- Spoel de SPE kanaal met 50 ul RNAse Away, gevolgd door 100 pi nuclease vrij water.
- Plaats de SPE kanaal met 4 pi van het enten oplossing (methylmethacrylaat met 3% w / v benzofenon) en vervolgens verknopen van het methacrylaat incuberen gedurende 10 min in een oven onder UV 365 nm UV golflengte en 2000 mJ / cm 2. Verwijder de resterende oplossing met vacuüm enten. We gebruikten de wand vacuum. Voor de beste resultaten moet een verse oplossing worden gebruikt. Het is meestal aanvaardbaar, maar naar een winkelbereide oplossing bij 4 ° C gedurende maximaal een week.
- De SPE kolom oplossing (alle v / v%): 16% ethyleendimethacrylaat, 24% butylmethacrylaat, 42% 1-dodecanol, 18% cyclohexanol en voeg 1% 2-dimethylamino-4-(methyl-fenylamino)-fenol als foto-initiator.
- Neem dezelfde hoeveelheid silica microsferen oplossing als de SPE kolom oplossing (een 1:1 mengsel te maken), en volledig droog bij 70 ° C overnacht in een vacuümoven. Breek de pellet door te tikken op de buis met gesloten deksel. Voeg de SPE kolom oplossing in de gedroogde silica microsferen buis en vortex om te mengen.
- Plaats 4 ui van de SPE oplossing in hetzelfde kanaal en vervolgens verknopen door UV bestraling gedurende 2,5 min. Vervolgens draait u de chip over en bestralen nog eens 2,5 minuten. De gepolymeriseerde SPE kolom een ondoorzichtige witte vaste stof zijn.
- Was het kanaal met 500 pi van 100% methanol spoelen overtollige reactanten. Deze wash verwijdert ook intra-polymeer porogenic oplosmiddelen, waardoor de open poriestructuur van de SPE kolom wanneer gedroogd omgevingsomstandigheden.
- Bevestig twee dunne-film verwarming aan de onderzijde van de chip met warmtegeleidende tape. De zijkanten van de verwarmers moeten worden gebracht met de rand van de brede kanalen voor denaturatie en annealing afzonderlijk (zie figuur 1).
- Plaats vijf thermokoppels in de chip door het dode einde open zijde kanalen van elke chip (zie figuur 2b). De thermokoppels blijven in deze kanalen via perspassing. Tape werd gebruikt om verder vaststellen van de locatie van thermokoppels.
2. Solid Phase Extraction Method
- Bereid 96 pl 70% ethanol met DEPC behandeld en geautoclaveerd water (gedeïoniseerd of Millipore).
- Voeg 4 pi 25X RNA Secure tot 96 pl 70% ethanol in een buis en dupliceren hetzelfde mengsel met 100% ethanol in een afzonderlijke buis.
- Bereid 300pi buffer kanaal door mengen van de volgende: 75 pi 6 M guanidine thiocyanaat (GuSCN), 150 pi 2-propanol, 63 ul nuclease-vrij water en 12 pi 25X RNA Secure.
- Bereid 312 ul lysis buffer door het mengen van: 100 pi 6 M GuSCN, 200 ui 2-propanol en 12 ui 25X RNA Secure.
- Verwarm de 70% ethanol, 100% ethanol, en lysis buffer kanaal buffers bij 60 ° C gedurende 10-20 min de RNA Secure activeren.
- Om de microfluïdische kanaal evenwicht, voert u het kanaal buffer door de SPE kanaal bij een debiet van 0,8 ml / uur.
- Quick-ontdooien Het monster wordt in VTM bij 37 ° C in een waterbad, en onmiddellijk verwijderen van de steekproef uit waterbad zodra het wordt ontdooid.
- Centrifugeer monster bij 13.000 rpm gedurende 10 min, en overdracht 100 ul van de supernatant in 300 pi van de lysis buffer. Voltooid werd het mengsel door toevoeging van 6 pl van 1 ug / ul RNA drager.
- Vortex te mengen, en na het centrifugeren voor5 sec, laadt u de hele lysaat in een Luer-lok 1 cc spuit.
- Lysaat lopen door de SPE kanaal met een stroomsnelheid van 0,8 ml / uur.
- Was de SPE kanaal met 100 pl 70% ethanol, gevolgd door 100 ul of100% ethanol per 1 ml / uur. (Er is een 50 ul dood volume in de spuit die niet zullen worden overgeheveld, dus eigenlijk alleen 50 pl gaat door het kanaal.)
- Plaats een lege injectiespuit in de 0,5 ml markering en druk lucht door het kanaal te drogen bij 1 ml / uur.
- Run 67,5 ul nuclease-vrij water door het kanaal om het gebonden nucleïnezuren elueren met 0,5 ml / uur en 13,5 ul van nanoport de afvoerpoort verzamelen. (De vloeistof te wijten is aan de 54 ul dode volume in de spuit en de SPE kanaal.)
3. RT-PCR
- Bereid 36,5 ul van het RT-PCR Master Mix in de lucht droog stap (2.12) met de reagentia in een Qiagen OneStep RT-PCR kits.
- Laad RT-pcR reagens in de nanoport bij het afval haven, en meng met RNA aan de volgende 50 pl RT-PCR-reactie te krijgen: 13,5 ul eluaat RNA in nuclease vrij water, 4 pi RT-PCR enzym mix, 10 pl Q-oplossing, 10 μl1X een stap buffer, 2 pl 25 mM MgCl2, 1 pi 50 pM forward primer 5'-GAC TCC TGT CAC CRA CTC TGA C-3 ', 1 pi 50 uM reverse primer 5'-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3 ', 2 pl dNTP, 0,75 ul 1,0% w / v BSA, 0,73 pl PEG8000 en 5,02 pi nuclease-vrij water.
- Plaats de RT-PCR mengsel in de RT kanaal zachte vacuum (gemaakt van de wand vacuüm) en sluit de Nanoport met een gesloten fitting.
- Breng 35 V op toestel 1. Bewaar de reagentia in de RT kanaal 30 min na de verwarming een evenwicht bereikt bij 50 ° C. Bewaar de reagentia in de RT kanaal 15 min na de verwarming een evenwicht bereikt bij 95 ° C.
- Breng 27 V tot verwarmer 1 en 50 V tot verwarming 2, wacht ongeveer drie minuten of tot verwarmingselement 1 evenwicht bereikt op 60 & deg; C en verwarmer 2 evenwicht bereikt bij 95 ° C.
- Druk de reagentia in de PCR kanaal 0,5 ul / min. Het duurt ongeveer 20 minuten voor de reagentia stromen door de serpentine kanaal.
- Het monster wordt tot het einde van het slangachtige kanaal verzamelen PCR-producten bij de uitlaat met een geschikt bemeten pipet en tip.
4. PCR producten Detectie
- We maken gebruik van een Agilent High Sensitivity DNA-test om de producten op te sporen. Voor het uitvoeren van deze test nemen de Agilent High Sensitivity DNA Kit uit de koelkast 30 min. voor het testen.
- Zet de Bioanalyzer en open de 2100 Expert-software.
- Plaats de 1 ul van het PCR producten in de test en volgt de Agilent protocol ( http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent% 20Manual.pdf ).
- Analyseer en noteer de data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een typisch resultaat is weergegeven in figuur 3 voor een influenza A geïnfecteerd nasofaryngeale wash specimen. Door de verschillende hoeveelheden influenzavirus in elke patiënt specimen, de eindconcentratie van PCR product variëren. Een goed resultaat moet een geringe ruis, twee duidelijke pieken ladder (35 en 10380 bp) en een productpiek bij de ontworpen product grootte (107 bp) voor het positief monster. Terwijl het product piek moet theoretisch afwezig zijn voor de negatieve controles, we wel valse PCR pieken in de buurt van de griep-specifieke locus van primer-dimeren vorming in sommige monsters. Meerdere product pieken weerspiegelen mogelijke besmetting van de test. Als dit gebeurt, moet een andere hoeveelheid van het monster opnieuw getest. Gel elektroforese kunnen worden gebruikt voor verder onderzoek van de testresultaten 13.
in "fo: src =" / files/ftp_upload/50325/50325fig1highres.jpg "/>
Figuur 1. Vereenvoudigde schematische bovenaf chip. De rode lijnen geven de plaats van het contact verwarming aan de onderzijde van de chip.
Figuur 2. De microfluïdische test stroom 13. (A) Afbeelding van twee microfluïdische chips met aangehechte dunne film kachels en twee-cylinder injectiepomp. Glazen spuiten werden met elkaar chip met flexibele slang aan reagentia en monsters laden. Drie havens werden gelijmd op de inlaten van SPE kanaal en het afval-poort, en de uitlaat van de PCR-kanaal (b) Kanaal ontwerp met drie secties:. Monstervoorbereiding (SPE), RT kamer en continue stroom PCR-kanaal. Twee vaste verwarmingselementen zijn verbonden via thermische tape aan de onderkant van de chip. Fluïdumstroming tussen de kanalen was laminaire en veranderingen in vloeistofweerstand toegestaan afsluiter werking zonder. De diepte 500 pm voor SPE en RT kanalen, en de PCR kanaal 100 pm diep. De breedtes 500 pm voor de SPE kolom 1 mm voor de RT kamer en variëren van 200 tot 400 urn voor de brede en smalle delen van de continue stroom PCR kanaal. De chip is 70 mm lang, 25 mm breed en 1,4 mm hoog. (C) Microfluidic assay processtroom. De nasofaryngeale monster wordt gemengd met lysis buffer, toegepast op de chip, wordt de chip draaien, en de PCR-producten worden gelezen met behulp van een commercieel capillaire elektroforese chip. 13 Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
n "fo: src =" / files/ftp_upload/50325/50325fig3highres.jpg "/>
Figuur 3. Op chip eindpunt diagnostische resultaat. Het PCR-product piek is de middelste piek bij de grootte van 107 bp. Linker (35 bp) en rechts pieken (10380 bp) zijn de controle ladder pieken. De concentratie van de producten van elke piek is het gebied onder de curve. Deze zijn in tabelvorm. (A) positief resultaat zonder ruis piek. (B) positief resultaat met primer-dimeren op 42 bp. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De diagnostische methode hier gepresenteerde aangetoond over het vermogen van een geïntegreerde microfluïdische plastic chip aan influenza A RNA versterken van patiënt monsters met hoge specificiteit en een lage detectielimiet 13 Wij ontwierpen deze chip voor potentiële point of care testen:. (A) de temperatuur en vloeibare controle werden vereenvoudigd, (b) de chip is goedkoop en geschikt voor high throughput fabricage met behulp van spuitgieten, en (c) de chip is disposable en bestemd voor eenmalig gebruik, waardoor de zorg van specimen kruisbesmetting.
Hoewel onze huidige on-chip looptijd van 3 uur, onze extractie platform bevat voldoende ruimte voor procesoptimalisatie. Zo zou het wassen en droogtijden vlak voor elutie worden gereduceerd door een combinatie van het verhogen van de stroomsnelheid en minder was volumes. Bovendien kunnen kosten worden getrimd door het stroomlijnen van de chip fabricageproces en het vervangen van dure of omslachtige peripherals, zoals de spuit pompen, voeding, met alternatieven zoals wegwerpspuit infuuspompen en kleine accu's De openstelling van de vaste fase extractie kolom geometrie en porositeit zal zorgen voor een significante reductie van de pomp eisen. Eens de chip ontwerp is gestandaardiseerd voor hoog volume productie, zullen veel van de thermokoppels gebruikt in het apparaat ontwikkeling worden geëlimineerd.
Meer nog dan andere factoren, de robuustheid van onze on-chip griep detectiemodule is afhankelijk van zowel goede temperatuurcontrole en passende steekproef overhandigen. Lichte opzichte van de gewenste on-chip temperatuur en onbedoelde meerdere vries-ontdooi cycli van influenza specimen zouden beide verminderen uiteindelijke PCR opbrengst. Naast deze factoren, kunnen de variaties in onze on-chip PCR resultaten 13 van verschillende patiëntenmonsters worden toegeschreven aan: Variatie in viral load, verschillende contaminerende menselijke cellen en blood, de aanwezigheid van remmers na PCR nucleïnezuur extractie, 14,15 en onverwachte chemische en / of fysische reacties tussen de monsters en de reagentia of het apparaat zelf 16.
Samengevat hebben we aangetoond dat het mogelijk onze microfluïdische chip aan RNA versterken van influenza A virus in medisch relevante nasofaryngeale monsters. De chip heeft het potentieel worden toegepast op andere DNA of RNA targets.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben verklaard geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidie R01 EB008268.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G | |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G | |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML | |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml | |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 | |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 | |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML | |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 | |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 | |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 | |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 | |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 | |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 | |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 | |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 | |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V | |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML | |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 | |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 | |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 | |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A | |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 | |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
References
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- WHO | World now at the start of 2009 influenza pandemic. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/ (2009).
- WHO | Pandemic (H1N1) 2009 - update 112. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/csr/don/2010_08_06/en/ (2009).
- Wenzel, J. J., et al. Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).
- Chan, K. H., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1. Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).
- Ginocchio, C. C., et al. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. Journal of. 45, 191-195 (2009).
- Aeron, C. H., et al. Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses. Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).
- Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting. Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).
- Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. Transducer'93, seventh international conference on solid state sensors and actuators. , 924-926 (1993).
- Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics. Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).
- Cao, Q., Kim, M. -C., Klapperich, C. Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments. Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).
- Cao, Q., et al. Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens. PLoS ONE. 7, e33176 (2012).
- Rådström, P. Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit. J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).
- Andreasen, D., et al. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50, S6-S9 (2010).
