Summary
Une puce microfluidique intégré thermoplastique a été mis au point pour une utilisation comme diagnostic moléculaire. La puce effectue l'extraction d'acide nucléique, la transcriptase inverse et la PCR. Des procédés de fabrication et le fonctionnement de la puce sont décrits.
Abstract
Diagnostics rapides et efficaces jouent un rôle important dans le contrôle des maladies infectieuses en permettant une gestion efficace des patients et le traitement. Ici, nous présentons une puce microfluidique intégré thermoplastique avec la capacité d'amplifier le virus grippal A dans les patients nasopharyngé (NP) des tampons et des ponctions. Lors du chargement de l'échantillon du patient, le dispositif microfluidique porte successivement sur la lyse des cellules sur puce, la purification de l'ARN et des étapes de concentration au sein de l'extraction en phase solide (SPE), la transcription inverse (RT) et la réaction en chaîne par polymérase (PCR) en RT-PCR chambres, respectivement. Point final de détection est réalisée à l'aide d'un Bioanalyzer hors puce (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Pour les périphériques, nous avons utilisé une pompe à seringue unique à conduire des réactifs et des échantillons, tandis que deux appareils de chauffage à couches minces ont été utilisés comme source de chaleur pour la RT et la PCR chambres. La puce est conçue pour être simple couche et adaptée pour la fabrication à haut débit pour réduire la fabricatile temps et le coût. La puce microfluidique offre une plateforme pour analyser une grande variété de virus et de bactéries, limitée seulement par des changements dans la conception des réactifs nécessaires à la détection de nouveaux agents pathogènes d'intérêt.
Introduction
Des millions de décès ont été rapportés au cours des trois pandémies de grippe du 20e siècle 1. En outre, la pandémie de grippe la plus récente a été déclarée par l'Organisation mondiale de la Santé (OMS) 2 en 2009, et à partir de Août 1, 2010, 18 449 décès ont été signalés par l'OMS 3. Cette pandémie a démontré encore une fois la forte charge de maladies infectieuses, et la nécessité d'une détection rapide et précise de la grippe pour permettre la confirmation des maladies rapide, appropriée réponse de santé publique et un traitement efficace 4.
Il existe plusieurs méthodes couramment utilisées pour le diagnostic de la grippe, il s'agit notamment de tests immunologiques rapides et directs tests immunofluorescence (DFAE) et les méthodes de culture virale. Immunoessais rapides considérablement manquent de sensibilité 5-8, tandis que les deux autres méthodes sont de main-d'œuvre et de temps 9. Les tests moléculaires offrent de multiples avantages, y compris un demi-tour peu de temps, SENSIT hauteivité, et une plus grande spécificité. Plusieurs entités commerciales ont travaillé à des tests moléculaires rapides (également appelés tests des acides nucléiques ou des NAT) pour les maladies infectieuses, et plusieurs ont des tests de la grippe dans leurs pipelines. Cependant, la plupart d'entre eux nécessitent la préparation d'échantillons hors puce. Aucun des amendements Clinical Laboratory Improvement (CLIA) a renoncé à des tests moléculaires incorporer la préparation des échantillons d'essai dans la cartouche ou module.
Lab-on-a-chip technologie joue un rôle important dans le développement de dispositifs de contrôle de point de soins. Après l'introduction de la première puce PCR en 1993 10, de nombreux efforts ont été consacrés au développement nucléiques puces de test d'acide. Cependant, seuls quelques-uns d'entre eux ont intégré la préparation des échantillons brut avec une amplification en aval.
Nous avons précédemment démontré la miniaturisation d'une colonne d'extraction en phase solide (SPE) dans une puce microfluidique en plastique 11 et la mise au pointment et l'optimisation d'une puce PCR à flux continu 12. Ici, nous étendons les travaux antérieurs d'intégrer la SPE avec RT et la PCR en une seule puce pour les diagnostics cliniques et démontrer sa capacité à amplifier les acides nucléiques de patients nasopharyngé (NP) des tampons et des ponctions.
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Protocol
1. 12 Fabrication puce
- Faites deux plaques de pastilles 690R Zeonex: distribuer des pastilles de 8-9 grammes Zeonex uniformément dans le centre d'une plaque de métal, préchauffer à la presse chauffée à 198 ° C pendant 5 min, puis appliquer une pression lentement à 2.500 psi pour encore 5 min. Pour compléter cette étape, nous avons utilisé une presse Carver chaude.
- Gaufrer le canal microfluidique dans la plaque de moule avec une résine époxy. Détails sur le moule de fabrication sont décrites ailleurs 12 (canal de la conception à la figure 2b): mettez une plaque sur le moule époxy; préchauffer sur la presse chauffée à 157 ° C pendant 10 minutes, puis appliquer lentement la pression à 1.000 psi pendant 10 min . Retirer la plaque du moule à la main ou à l'aide d'une pince avant qu'il ne refroidisse. (Remarque: portez des gants thermiques au cours de cette étape.)
- Percer des trous dans la puce en relief à l'entrée, le port déchets, et la sortie du canal microfluidique. Nous avons utilisé un diam 1,25 mmEter foret de faire les trois trous.
- Bond de la puce en relief avec une autre plaque (en haut): Laver les copeaux avec de l'IPA, RNase Away et de l'eau déminéralisée en séquence; Air sec et préchauffer à la presse chauffée à 131 ° C pendant 10 min, puis appuyez à 350 psi pour un autre 10 min.
- Fixez Nanoports à l'entrée, les déchets et les orifices de sortie séparément à l'aide JB Weld époxy; durcir pendant 15 à 24 heures selon les instructions du fabricant.
- Rincer le canal SPE avec 50 pi loin RNAse, puis avec 100 pl d'eau nucléase libre.
- Charger le canal SPE avec 4 ul de la solution de greffage (méthacrylate de méthyle avec 3% p / v benzophénone), puis réticuler le méthacrylate par une incubation de 10 minutes dans un four UV sous UV de longueur d'onde nm et 365 2.000 mJ / cm 2. Retirer la solution résiduelle greffage avec vide. Nous avons utilisé le vide du mur. Pour de meilleurs résultats, une nouvelle solution doit être utilisée. Il est généralement acceptable, mais, pour enregistrer unsolution préparée à 4 ° C pendant une semaine.
- Rendre la solution colonne SPE (tous les% en volume / volume): diméthacrylate d'éthylène 16%, 24% de méthacrylate de butyle, 42% de 1-dodécanol, le cyclohexanol 18%, et à 1% de 2-diméthylamino-4-(méthyl-phénylamino)-phénol que le photo-initiateur.
- Sortez le même volume de solution de microsphères de silice comme la solution la colonne SPE (pour faire un mélange 1:1), et l'a complètement sécher à 70 ° C pendant la nuit dans un four sous vide. Brisez le culot en tapant sur le tube avec le couvercle fermé. Ajouter la solution de la colonne SPE dans le tube de microsphères de silice séchée et vortex pour mélanger.
- Chargez 4 pl de la solution SPE dans le même canal, puis réticuler par irradiation UV pendant 2,5 min. Ensuite, retournez sur la puce et d'irradier un autre min 2,5. La colonne SPE polymérisée doit être un solide blanc opaque.
- Laver la chaîne avec 500 ul de méthanol à 100% pour rincer réactifs en excès. Ce lavage élimine aussi intra-polymère porogenic solvants, créant ainsi la structure à pores ouverts de la colonne SPE quand on le sèche dans les conditions ambiantes.
- Fixer deux appareils de chauffage à film mince au fond de la puce avec un ruban conducteur de la chaleur. Les côtés des appareils de chauffage doit être aligné avec le bord des canaux larges de dénaturation et hybridation séparément (voir la figure 1).
- Placez les cinq thermocouples dans la puce à travers les morts clos canaux latéraux ouverts de chaque puce (voir figure 2b). Les thermocouples rester dans ces canaux via ajustement serré. Bande a été utilisé pour fixer en outre l'emplacement des thermocouples.
2. Méthode d'extraction en phase solide
- Préparer 96 ul d'éthanol à 70% avec de l'eau traitée au DEPC et autoclavés (déminéralisée ou filtrée Millipore).
- Ajouter 4 ul d'ARN 25X Fixer à 96 ul d'éthanol à 70% dans un tube, et de dupliquer le même mélange avec de l'éthanol à 100% dans un tube séparé.
- Préparez 300pl de tampon de canal en mélangeant ce qui suit: 75 pl de 6 M de thiocyanate de guanidine (GuSCN), 150 ul de 2-propanol, 63 pl de nucléase libre de l'eau, et 12 pl de l'ARN 25X sécurisés.
- Préparer 312 ul de tampon de lyse en mélangeant: 100 pl de 6 M GuSCN, 200 pl de 2-propanol et 12 ul d'ARN 25X sécurisés.
- Chauffer l'éthanol à 70%, 100% de tampon canal d'éthanol, et tampons de lyse à 60 ° C pendant 10-20 min pour activer le sécurisé ARN.
- Pour équilibrer le canal microfluidique, exécuter le tampon de canal par l'intermédiaire du canal de SPE à un débit de 0,8 ml / h.
- Quick-dégeler l'échantillon d'essai de VTM à 37 ° C au bain-marie, puis retirez immédiatement l'échantillon du bain d'eau dès qu'il est décongelé.
- Centrifuger l'échantillon à 13000 rpm pendant 10 min, et transférer 100 ul de surnageant dans 300 ul de tampon de lyse. Remplissez le mélange en ajoutant 6 pi de 1 ug / ul ARN porteur.
- Vortex pour mélanger, et après de spin pour5 sec, chargez l'intégralité du lysat dans un Luer-lok 1 seringue cc.
- Exécuter lysat par la voie SPE à un débit de 0,8 ml / h.
- Laver le canal SPE avec 100 ul d'éthanol à 70%, suivie par l'éthanol à 100% of100 ul à 1 ml / h. (Il ya un volume de 50 ul morts dans l'embout de la seringue qui ne sera pas expulsé, donc en fait seulement 50 ul traverse le canal.)
- Positionner une seringue vide à la marque de 0,5 ml et pousser l'air à travers le canal pour le sécher à 1 ml / h.
- Exécuter 67,5 ul exempte de nucléase eau dans le canal pour éluer les acides nucléiques liés à raison de 0,5 ml / h, et de recueillir 13,5 ul de la nanoport au port déchets. (La perte de fluide est due à la 54 pl volume mort dans l'embout de seringue et le canal SPE.)
3. RT-PCR
- Préparer 36,5 ul du mélange de RT-PCR maître au cours de l'étape de l'air sec (2,12) en utilisant les réactifs dans un OneStep de Qiagen kits de RT-PCR.
- Chargez RT-PCR réactif dans le nanoport au port des déchets, et mélanger avec de l'ARN pour obtenir le suivant 50 pl RT-PCR: 13,5 ul d'ARN élués dans l'eau sans nucléase, 4 pl RT-PCR mélange d'enzymes, 10 ul de solution Q, 10 μl1X une tampon étape, 2 pl 25 mM MgCl 2, 1 pi 50 pM amorce 5'-GAC TCC ARC TGT CAC CTC TGA C-3 ', 1 uM d'amorce 50 pi inverse 5'-GCA ATS AGG TGG ACA AAK CGT CTA-3 ', 2 ul de dNTP, 0,75 ul 1,0% p / v de BSA, 0,73 et 5,02 ul PEG8000 eau nucléase ul libre.
- Chargez le mélange de RT-PCR dans le canal par RT léger vide (nous avons utilisé le vide du mur) et sceller le Nanoport avec un raccord fermé.
- Appliquer 35 V pour chauffage 1. Conserver les réactifs dans le canal température ambiante pendant 30 min après le chauffage 1 s'équilibre à 50 ° C. Conserver les réactifs dans le canal TA pendant 15 min après les 1 chauffe s'équilibre à 95 ° C.
- Appliquer 27 V pour chauffage 1 et 50 V pour chauffage 2, attendez environ trois minutes ou jusqu'à ce réchauffeur 1 s'équilibre à 60 et deg; C et chauffe 2 s'équilibre à 95 ° C.
- Poussez les réactifs dans le canal de PCR de 0,5 l / min. Il devrait prendre environ 20 minutes pour les réactifs de circuler à travers le canal en serpentin.
- Que l'échantillon qu'il apporte à l'extrémité du canal en serpentin, de recueillir les produits de la PCR à la sortie à l'aide d'une pipette à pointe et de taille appropriée.
4. PCR Détection Produits
- Nous utilisons un test de Agilent Haute Sensibilité ADN pour détecter les produits. Pour exécuter ce test sortir le kit Agilent ADN à haute sensibilité du réfrigérateur 30 min avant le test.
- Allumez le bioanalyseur et ouvrez le logiciel expert 2100.
- Chargez le pl 1 des produits de PCR dans le dépistage et le suivi du protocole d'Agilent ( 20Manual.pdf% http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent ).
- Analyser et enregistrer les données.
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Representative Results
Un résultat typique est illustré à la figure 3 pour une grippe A spécimen infecté lavage nasopharyngé. En raison des quantités différentes de virus de la grippe dans chaque échantillon de patient, la concentration finale du produit de PCR est variable. Un bon résultat devrait avoir un faible bruit, deux pics échelle claires (35 et 10380 pb) et un pic seul produit à la taille du produit conçu (107 pb) pour l'échantillon positif. Alors que le pic du produit devrait théoriquement être absent pour les témoins négatifs, nous avons observé des pics parasites PCR près du lieu de la grippe spécifique à partir d'amorces dimères formation dans certains échantillons. Plusieurs pics de produit refléter la contamination potentielle de l'essai. Dans ce cas, l'autre partie aliquote de l'échantillon doit être retesté. Électrophorèse sur gel peut être utilisé pour la vérification ultérieure des résultats du test 13.
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Figure 1. Simplifié de haut en bas schématique puce. Les contours rouges indiquent l'emplacement des appareils de chauffage de contact sur la partie inférieure de la puce.
Figure 2. Le flux de dosage microfluidique 13. (A) Image de deux puces microfluidiques avec joints minces chauffe et la pompe à seringue double corps. Les seringues en verre ont été connectés à chaque puce avec un tuyau flexible pour charger les réactifs et échantillons. Trois ports ont été collées au niveau des entrées de canal SPE et l'orifice d'évacuation, et la sortie du canal de PCR (b) Chaîne de conception avec trois sections:. Préparation de l'échantillon (SPE), et RT chambre d'écoulement continu PCR canal. Deux éléments chauffants à résistance fixe sont fixés par l'intermédiaire d' Ruban thermique de la partie inférieure de la puce. L'écoulement du fluide entre les canaux est laminaire, et les changements dans la résistance des fluides a permis de soupape inférieur opération. La profondeur est de 500 um SPE et RT canaux, et le canal de PCR est de 100 um de profondeur. Les largeurs sont 500 um pour la colonne SPE, 1 mm pour la chambre de RT, et varient de 200 à 400 um pour les sections larges et étroites du canal PCR à flux continu. La puce est de 70 mm de longueur, 25 mm de largeur et 1,4 mm de hauteur. (C) d'écoulement microfluidique procédé de dosage. Le prélèvement nasopharyngé est mélangé avec un tampon de lyse, appliquée à la puce, la puce est exécuté, et les produits de PCR sont lues à l'aide d'une puce d'électrophorèse capillaire commerciale 13. Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Figure 3. Le résultat final point de puce de diagnostic. Le pic produit de PCR est le pic du milieu à la taille de 107 pb. Pics de gauche (35 pb) et droite (10380 pb) sont les sommets de contrôle d'échelle. La concentration des produits de chaque pic est l'aire sous la courbe. Ceux-ci sont comptabilisés. (A) résultat positif sans aucun pic de bruit. (B) résultat positif avec amorces dimères à 42 pb. Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Discussion
La méthode de diagnostic présenté ici a démontré la capacité d'une puce microfluidique intégré en plastique pour amplifier l'ARN de la grippe A partir d'échantillons de patients avec une haute spécificité et une limite de détection plus bas depuis 13 Nous avons conçu cette puce pour le point de potentiel des tests précaution:. (A) la température et fluidique de contrôle ont été simplifiées, (b) la puce est peu coûteux et convenant à la fabrication à haut débit utilisant le moulage par injection, et (c) la puce est jetable et prévu pour un usage unique, réduisant ainsi la préoccupation de contamination croisée des échantillons.
Bien que notre actuel sur la puce d'exécution de 3 h, notre plate-forme d'extraction contient suffisamment d'espace pour l'optimisation des processus. Par exemple, le lavage et le temps de séchage juste avant l'élution peut être réduite grâce à une combinaison de l'augmentation du débit et de réduire les volumes de lavage. Par ailleurs, le coût peut être coupé en rationalisant le processus de fabrication de la puce et le remplacement péri coûteux ou encombrantspherals, tels que les pompes à seringues, alimentation, avec des alternatives comme les pompes à perfusion jetables seringue et blocs de batteries de petites ouvertures jusqu'à la géométrie extraction en phase solide colonne et la porosité de permettre des réductions significatives dans les exigences de la pompe. En outre, une fois que la conception de la puce est standardisée pour la fabrication de volume élevé, la plupart des thermocouples utilisés dans le développement d'appareils seront éliminés.
Plus que d'autres facteurs, la robustesse de notre on-chip module de détection de la grippe dépend à la fois contrôle de la température et une bonne remise d'échantillon appropriée. Léger décalage par rapport désiré sur la puce de température, ainsi que involontaires multiples cycles gel-dégel de l'échantillon de la grippe, pourrait à la fois réduire le rendement final de PCR. En dehors de ces facteurs, les variations dans nos résultats de la PCR sur puce 13 d'échantillons de patients différents peuvent également être attribuée à: Variation de la charge virale, les différents niveaux de contamination des cellules humaines et Blood; la présence d'inhibiteurs de PCR après extraction de l'acide nucléique, 14,15 et imprévus des réactions chimiques et / ou physiques entre les échantillons et les réactifs de test ou de l'appareil lui-même 16.
En résumé, nous avons démontré la faisabilité de notre puce microfluidique pour amplifier l'ARN du virus influenza A en médicalement pertinents prélèvements naso-pharyngés. La puce a le potentiel d'être appliquée à un autre ADN ou d'ARN cibles.
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Disclosures
Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts financiers.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par les Instituts nationaux de la santé (NIH) subvention R01 EB008268.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G | |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G | |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML | |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml | |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 | |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 | |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML | |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 | |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 | |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 | |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 | |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 | |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 | |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 | |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 | |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V | |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML | |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 | |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 | |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 | |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A | |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 | |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
References
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