Summary
שבב microfluidic תרמופלסטיים משולב פותח לשימוש כאבחון מולקולרי. השבב מבצע חילוץ חומצות גרעין, transcriptase ההפוכה, וה-PCR. שיטות לבודה והפעלת השבב מתוארות.
Abstract
אבחון מהיר ויעיל, לשחק תפקיד חשוב בשליטה על מחלה זיהומית ומאפשר ניהול יעיל מטופל וטיפול. כאן, אנו מציגים שבב microfluidic תרמופלסטיים משולב עם היכולת להגביר שפעת וירוס במטליות מטופל אף ולוע (NP) וaspirates. בעקבות טעינת מדגם המטופלים, מכשיר microfluidic רצף מבצע תמוגה על שבב תא, טיהור רנ"א וצעדים בתוך ריכוז המיצוי המוצק השלב (SPE), שעתוק לאחור (RT) ותגובת שרשרת פולימרז (PCR) בRT-PCR תאים, בהתאמה. איתור נקודת סיום מתבצע באמצעות Bioanalyzer את השבב (Agilent Technologies, סנט קלרה, קליפורניה). עבור ציוד היקפי, השתמש משאבת מזרק יחידה לנהוג מגיבים ודגימות, בעוד שני תנורי סרט דקים שמשו את המקורות החומים לRT-PCR והתאים. השבב נועד להיות שכבה אחת ומתאימה לייצור תפוקה גבוהה, כדי לצמצם את fabricatiעל זמן ועלות. שבב microfluidic מספק פלטפורמה לניתוח מגוון רחב של וירוסים וחיידקים, מוגבלים רק על ידי שינויים בעיצוב מגיב הדרושים כדי לזהות פתוגנים עניין חדשים.
Introduction
מיליוני מקרי מוות דווחו בשלוש מגיפות השפעת של המאה ה -20 1. יתר על כן, מגיפת השפעת האחרונה הוכרזה על ידי ארגון הבריאות העולמית (WHO) 2 בשנת 2009, והחל מיום 1 באוגוסט 2010, 18449 מקרי מוות שדווח על ידי ארגון בריאות עולמית 3. מגיפה זו הוכיחה שוב את הניטל הגבוה של מחלות זיהומיות, ואת הצורך בזיהוי מהיר ומדויק של שפעת כדי לאפשר אישור מהיר מחלה, תגובה לבריאות הציבור מתאימה וטיפול יעיל 4.
ישנן מספר שיטות נפוצות לאבחון שפעת, אלה כוללים immunoassays מהיר, בדיקת האנטיגן ניאון ישירה (DFA) ושיטות תרבות ויראליות. immunoassays ראפיד דרמטי חסר רגישות 5-8, בעוד שתי שיטות האחרות הן עתירות עבודה וזמן רבים 9. בדיקות מולקולריות להציע יתרונות רבים, כולל תפנית הזמן sensit קצר, גבוהלקוחים, וסגולי גבוהים יותר. כמה גופים מסחריים כבר עובדים לקראת בדיקות מולקולריות מהירות (הנקרא גם בדיקות או NATS חומצות גרעין) למחל זיהומיות, וכמה יש מבחני שפעת בצינורות שלהם. עם זאת רובם דורשים הכנת מדגם את השבב. אף אחד מתיקוני הרפואה ו( CLIA) ייתרו בדיקות מולקולריות לשלב הכנת מדגם לתוך מחסנית assay או מודול.
טכנולוגיית מעבדה על השבב משחקת תפקיד חשוב בפיתוח של מכשירי בדיקת נקודה של טיפול. לאחר המבוא של שבב ה-PCR לראשונה בשנת 1993 10, מאמצים רבים שהושקעו בפיתוח שבבי בדיקת חומצות גרעין. עם זאת, רק מעטים מהם יש הכנת מדגם גולמית משולבת עם הגברה במורד זרם.
אנחנו הוכחנו בעבר את המזעור של עמודת מיצוי שלב מוצקה (SPE) לתוך שבב microfluidic פלסטיק 11 ולפתחment ואופטימיזציה של שבב ה-PCR זרימה רציפה 12. כאן, אנו מרחיבים את העבודה הקודמת לשלב SPE בצעדי PCR RT ולתוך שבב יחיד לאבחון קליני ולהפגין את יכולתה להגביר חומצות גרעין ממטליות מטופל אף ולוע (NP) וaspirates.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ייצור שבבים 12
- להפוך את שני לוחות מכדורי Zeonex 690R: להפיץ 8-9 כדורי Zeonex גרם באופן שווה במרכז לוחית מתכת, מחממים על העיתונות המחוממת בעמ '198 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן להחיל את לחץ לאט לאט ל2,500 psi למשך 5 דקות נוספות. כדי להשלים שלב זה, השתמש עיתונות חמה קארבר.
- בלטת microfluidic הערוץ בשלט עם עובש אפוקסי. פרטים על ייצור העובש מתוארים במקום אחר 12 (עיצוב ערוץ באיור 2b): לשים שלט אחד על עובש אפוקסי; מחמם אותם בעיתונות המחוממת ב157 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן להחיל את לחץ לאט לאט לpsi 1000 למשך 10 דקות נוספות . הסרת הפלאק מהעובש ביד או באמצעות מלקחיים לפני שהיא מתקררת. (שים לב: ללבוש כפפות תרמיות בשלב זה).
- לקדוח חורים בשבב הבולט בכניסה, יציאת פסולת, והיציאה של ערוץ microfluidic. אנחנו השתמשנו בקוטר 1.25 מ"מeter מקדח להפוך את השלושה חורים.
- ונד שבב המובלט עם שלט אחר (על גבי): לשטוף את השבבים עם IPA, RNAse הרחק ובמי deionized ברצף; אוויר יבש ומחמם אותם בעיתונות המחוממת ב131 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן קש על 350 psi לעוד 10 דקות.
- צרף Nanoports בכניסה, הפסולת, ואת היציאות לשקע בנפרד באמצעות JB הוולד אפוקסי; לרפא במשך 15 עד 24 שעות לפי הוראות היצרן.
- שטוף את ערוץ SPE עם 50 RNAse חוץ μl, אחריו עם מי nuclease חופשיים μl 100.
- טען את ערוץ SPE עם 4 μl של פתרון ההשתלה (methacrylate תיל עם 3% w / v benzophenone) ולאחר מכן Crosslink methacrylate ידי דוגר למשך 10 דקות בתנור UV תחת אורך גל 365 nm UV ו2000 mJ / 2 סנטימטר. הסר את פתרון השתלת שיירים עם ואקום. אנחנו נצלנו את חלל הריק הקיר. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, פתרון טרי צריך להיות בשימוש. זה בדרך כלל מקובל, עם זאת, כדי לאחסןפתרון מוכן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
- הפוך פתרון SPE העמודה (כל% v / v): 16% dimethacrylate אתילן, 24% methacrylate וטיל, 42% 1-dodecanol, 18% cyclohexanol, ולהוסיף 1% -2 dimethylamino-4-(מתיל phenylamino)-פנול כצילום יוזם.
- קח את אותו הנפח של תמיסת microspheres סיליקה כפתרון עמודת SPE (כדי להפוך תערובת ביחס 1:1), ולייבש אותו לחלוטין ב 70 מעלות צלזיוס למשך לילה בתנור ואקום. לשבור את הכדור על ידי קשה על הצינור עם המכסה הסגור. הוסף פתרון עמודת SPE לתוך הצינור המיובש סיליקה microsphere והמערבולת לערבב.
- טען 4 μl של פתרון SPE לאותו ערוץ ולאחר מכן Crosslink זה על ידי הקרנת UV במשך 2.5 דקות. ואז, להפוך את השבב מעל ולהקרין תמורת 2.5 דקות נוספות. טור SPE polymerized צריך להיות מוצק לבנה אטומה.
- לשטוף את הערוץ עם 500 μl של מתנול 100% לשטוף מעל מגיבים עודפים. לשטוף זה גם מסיר תוך פולימר פוממסי rogenic, ובכך ליצור מבנה הנקבובי הפתוח של עמודת SPE כאשר התייבשו בתנאי הסביבה.
- צרף שני תנורים, סרט דק לחלק התחתון של השבב עם קלטת מוליכי תרמית. את הצדדים של תנורי החימום צריכים להיות מיושרים עם הקצה של הערוצים הרחבים לdenaturation וחישול בנפרד (ראה תרשים 1).
- 5 צמדים תרמיים מקום לשבב דרך מת הסתיימו ערוצי צד פתוחים של כל שבב (ראה איור 2b). את הצמדים התרמיים להישאר בערוצים אלה באמצעות התאמת עיתונות. קלטת שמשה כדי לתקן את המיקום של צמדים תרמיים נוסף.
2. שיטת חילוץ שלב מוצקה
- הכן 96 μl של אתנול 70% במים DEPC שטופל וautoclaved (deionized או Millipore בפילטר).
- 4 μl הוסף של רנ"א 25X Secure עד 96 μl של אתנול 70% בצינור אחד, ולשכפל את אותה תערובת עם אתנול 100% בצינור נפרד.
- הכן 300μl של חיץ ערוץ על ידי ערבוב הבא: 75 μl של thiocyanate ז 6 guanidine (GuSCN), 150 μl של 2-propanol, 63 μl מים חופשיים nuclease, ו12 μl של רנ"א Secure 25X.
- הכן 312 μl של חיץ תמוגה ידי ערבוב: 100 μl של 6 מ'GuSCN, 200 μl של 2-propanol, ו12 RNA 25X μl המאובטח.
- מחמם אתנול 70%, 100% אתנול, חיץ ערוץ ומאגרי תמוגה ב 60 מעלות צלזיוס במשך 10-20 דקות כדי להפעיל RNA המאובטח.
- כדי לאזן את ערוץ microfluidic, הפעל את חיץ הערוץ דרך ערוץ SPE בקצב זרימה של 0.8 מ"ל / שעה.
- מהיר להפשיר מדגם הבדיקה בVTM על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים, והסר את המדגם באופן מיידי מאמבט מים ברגע שהוא מופשר.
- צנטריפוגה המדגם ב 13000 סל"ד למשך 10 דקות, ולהעביר 100 μl של supernatant לתוך 300 μl של חיץ תמוגה. השלם את התערובת על ידי הוספת 6 μl של מיקרוגרם 1 / רנ"א המוביל μl.
- מערבולת לערבב, ואחרי סיבוב כבר5 שניות, טענו כל lysate לתוך מזרק סמ"ק luer-Lok 1.
- הפעל lysate דרך ערוץ SPE בקצב זרימה של 0.8 מ"ל / שעה.
- שטוף את ערוץ SPE עם 100 μl של אתנול 70%, ואחריו אתנול 100% μl of100 ב1 מ"ל / שעה. (יש נפח מת μl 50 שבקצה המזרק שלא ידחק אותי החוצה, ולכן למעשה רק 50 μl עובר ערוץ.)
- מקם מזרק ריק בסימן 0.5 המ"ל ולדחוף אוויר דרך הערוץ כדי לייבש אותו ב1 מ"ל / שעה.
- הפעל 67.5 μl מי nuclease חינם דרך הערוץ לelute את חומצות גרעין הקשורות ברמה של 0.5 מ"ל / שעה, ולאסוף μl 13.5 מnanoport בנמל הפסולת. (איבוד הנוזלים בשל הנפח המת μl 54 שבקצה המזרק וערוץ SPE).
3. RT-PCR
- הכן 36.5 μl של מיקס מאסטר RT-PCR במהלך השלב היבש האוויר (2.12) תוך שימוש בחומרים הכימיים בתוך ערכות OneStep Qiagen RT-PCR.
- טען RT-PCR מגיב בnanoport בנמל הפסולת, ולערבב עם רנ"א כדי לקבל את התגובה הבאה 50 μl RT-PCR: 13.5 רנ"א eluted μl במי nuclease חופשיים, 4 תמהיל האנזים μl RT-PCR, פתרון ש 10 μl, 10 μl1X 1 חיץ צעד, 2 25 מ"מ μl MgCl 2, 1 פריימר 5'-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3 '50 מיקרומטר μl קדימה, 1 מיקרומטר פריימר μl 50 הפוך 5'-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3 ', DNTP 2 μl, 1.0% μl 0.75 w / v BSA, 0.73 μl PEG8000 ומי nuclease חופשיים μl 5.02.
- טען את תערובת RT-PCR לתוך ערוץ RT ידי ואקום עדין (השתמשנו בואקום הקיר) ולאטום Nanoport עם הולם סגורה.
- החל 35 V לדוד 1. שמור את ריאגנטים בערוץ RT למשך 30 דקות לאחר החימום 1 equilibrates ב 50 ° C. שמור את ריאגנטים בערוץ RT במשך 15 דקות לאחר ש1 equilibrates הדוד ב 95 ° C.
- החל 27 V לתנור 1 ו 50 V לדוד 2, להמתין כשלוש דקות או עד 1 equilibrates דוד בגיל 60 ודהז; C ומחמם 2 equilibrates ב 95 ° C.
- דחף את ריאגנטים לערוץ ה-PCR על 0.5 μl / דקה. זה אמור לקחת 20 דקות לריאגנטים לזרום דרך התעלה המפותלת.
- כמדגם הופך אותו לסוף הערוץ המתפתל, לאסוף את מוצרי ה-PCR בשקע באמצעות pipettor וקצה בגודל המתאים.
4. איתור מוצרי PCR
- אנו משתמשים במבחן Agilent רגישות גבוהה DNA כדי לזהות את המוצרים. כדי להפעיל את המבחן הזה מוציא את ערכת DNA רגישות הגבוהה Agilent ממקרר 30 דקות לפני הבדיקה.
- הפעל Bioanalyzer ולפתוח את תוכנת המומחה 2100.
- טען μl 1 של מוצרי ה-PCR לבדיקות והמעקב Agilent הפרוטוקול (20Manual.pdf% http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent).
- לנתח ולתעד את הנתונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאה טיפוסית מוצגת באיור 3 לשפעת דגימת שטיפת אף ולוע נגועה. בשל כמויות השונות של נגיף שפעת בכל דגימת מטופל, הריכוז הסופי של מוצר PCR ישתנה. תוצאה טובה צריכה רעש נמוך, שני שיאי סולם ברורים (35 ו10380 נ"ב) ושיא מוצר אחד בגודל המוצר מיועד (107 נ"ב) למדגם החיובי. אמנם שיא המוצר צריך להיות באופן תיאורטי נעדר בקרות שליליות, עשה להתבונן פסגות PCR מזויפות ליד מוקד שפעת הספציפית מהיווצרות פריימר-הדימרים בכמה דוגמאות. פסגות מוצר מרובות משקפות אפשרות של זיהום במבחן. במקרה זה, aliquot נוסף של המדגם צריך הערכה מחדש. ג'ל אלקטרופורזה יכולה לשמש לאימות נוספת של תוצאות בדיקת 13.
ב" fo: src = "/ files/ftp_upload/50325/50325fig1highres.jpg" />
איור 1. פשוט מלמעלה למטה סכמטי שבב. קווי המתאר האדומים מראים את המיקום של תנורי המגע בתחתית של השבב.
איור 2. זרימת microfluidic assay 13. (א) התמונה של שני שבבי microfluidic עם תנורים מצורפים סרט דקים ומשאבת מזרק שתי חבית. מזרקי זכוכית הייתם מחוברים לכל שבב עם צינור גמיש כדי לטעון ריאגנטים ודגימות. שלוש יציאות היו מודבקות בפתחי הכניסה של ערוץ SPE ויציאת פסולת, והיציאה של ערוץ PCR (ב) עיצוב ערוץ עם שלושה חלקים:. הכנת מדגם (SPE), RT הקאמרי וזרימה רציף PCR ערוץ. שני תנורי התנגדות קבועים מצורפים באמצעות קלטת תרמית לחלק התחתון של השבב. זרימת נוזל בין הערוצים הייתה מינרית, ושינויים בהתנגדות נוזל אפשרו להפעלת שסתום פחות. העומק הוא 500 מיקרומטר עבור ערוצי RT SPE ו, וערוץ ה-PCR הוא עמוק 100 מיקרומטר. את הרוחב הוא 500 מיקרומטר לעמודת SPE, 1 מ"מ לRT הקאמרי, ולהשתנות 200-400 מיקרומטר לחלקים הרחבים וצרים של ערוץ PCR זרימה הרציפה. השבב הוא 70 מ"מ האורך, 25 מ"מ רוחב ו -1.4 מ"מ הגובה. (ג) זרימת תהליך בדיקת Microfluidic. מדגם האף והלוע הוא מעורב עם חיץ תמוגה, יחול על השבב, השבב הוא לרוץ, ואת מוצרי PCR נקראים באמצעות שבב אלקטרופורזה נימים מסחרית. 13 לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
n "fo: src =" / files/ftp_upload/50325/50325fig3highres.jpg "/>
איור 3. על תוצאת שבב נקודת סיום אבחון. שיא מוצר PCR הוא השיא הבינוני בגודל של 107 נ"ב. שמאל (35 נ"ב) וזכות פסגות (10380 נ"ב) הן פסגות סולם השליטה. הריכוז של המוצרים של כל שיא הוא השטח מתחת לעקומה. אלה tabulated. () תוצאה חיובית ללא כל שיא רעש. (ב) תוצאה חיובית עם פריימר-הדימרים ב42 נ"ב. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת האבחון שהוצגה כאן הדגימה את היכולת של שבב microfluidic פלסטיק משולב כדי להגביר שפעת RNA מן דגימות מטופל עם סגוליות גבוהות וגבול גילוי נמוך 13 עצבנו השבב הזה לנקודת פוטנציאל של בדיקות טיפול:. (א) את הטמפרטורה וfluidic השליטה הייתה פשוטה יותר, (ב) את השבב הוא עלות נמוכה ומתאימה לייצור תפוקה גבוהה באמצעות הזרקה, ו (ג) את השבב הוא חד פעמי ומיועד לשימוש חד פעמי, וכך להקטין את החשש לזיהום צולב דגימה.
למרות שזמן הריצה הנוכחי שלנו על השבב של 3 שעות, פלטפורמת ההפקה שלנו מכילה מספיק מקום לאופטימיזציה של תהליך. למשל, לשטוף ויבשות פעמים ממש לפני elution יכולים להיות מופחתות על ידי שילוב של הגדלת קצב הזרימה והפחתת נפחי השטיפה. יתר על כן, עלות יכולה להיות trimmed על ידי ייעול תהליך ייצור השבבים והחלפת פרי יקר או מסורבלpherals, כגון משאבות המזרק, ספק כוח, עם חלופות כמו משאבות אינפוזיה מזרק חד פעמיות ומארזי סוללות קטנים פותחים את הגיאומטריה המוצקה שלב חילוץ עמודה והנקבובית יאפשר הפחתה משמעותית בדרישות המשאבה. כמו כן, ברגע שתכנון השבבים הוא סטנדרטי לייצור בכמויות גדול, רב של הצמדים התרמיים המשמשים בפיתוח מכשיר יבוטל.
יותר מגורמים אחרים, על חוסנו של מודול זיהוי השפעת על השבב שלנו תלוי בשניהם שליטה בטמפרטורה טובה ומסירת דגימה מתאימה. קל לקזז מהטמפרטורה הרצויה על השבב, כמו גם מחזורים מרובים מכוונים הקפאת הפשרה של דגימת השפעת, יכול גם להפחית את תשואת PCR הסופית. מלבד גורמים אלה, את השינויים בתוצאות שלנו על שבב PCR 13 מדגימות מטופל שונות יכולים גם לייחס ל: וריאציה בעומס נגיפי, רמות שונות של תאי אדם ומזהם Blooד; הנוכחות של מעכבי PCR לאחר מיצוי חומצות גרעין, 14,15 ותגובות כימיות ו / או פיסיות בלתי צפויות בין הדגימות וריאגנטים הבדיקה או המכשיר עצמו 16.
לסיכום, יש לנו הוכחנו את הכדאיות של שבב microfluidic להגביר רנ"א משפעת וירוס בדגימות אף ולוע רפואי רלוונטיות-. השבב יש את הפוטנציאל להיות מיושם למטרות RNA DNA או אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים הכריזו אין אינטרסים כספיים מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מענק R01 EB008268.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G | |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G | |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML | |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml | |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 | |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 | |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML | |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 | |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 | |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 | |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 | |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 | |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 | |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 | |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 | |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V | |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML | |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 | |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 | |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 | |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A | |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 | |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
References
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- WHO | World now at the start of 2009 influenza pandemic. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/ (2009).
- WHO | Pandemic (H1N1) 2009 - update 112. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/csr/don/2010_08_06/en/ (2009).
- Wenzel, J. J., et al. Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).
- Chan, K. H., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1. Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).
- Ginocchio, C. C., et al. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. Journal of. 45, 191-195 (2009).
- Aeron, C. H., et al. Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses. Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).
- Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting. Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).
- Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. Transducer'93, seventh international conference on solid state sensors and actuators. , 924-926 (1993).
- Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics. Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).
- Cao, Q., Kim, M. -C., Klapperich, C. Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments. Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).
- Cao, Q., et al. Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens. PLoS ONE. 7, e33176 (2012).
- Rådström, P. Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit. J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).
- Andreasen, D., et al. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50, S6-S9 (2010).
