Summary
एक एकीकृत microfluidic थर्माप्लास्टिक चिप एक आणविक निदान के रूप में उपयोग के लिए विकसित किया गया है. चिप न्यूक्लिक एसिड निकासी, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस, और पीसीआर करता है. Fabricating और चिप चलाने के लिए तरीके वर्णित हैं.
Abstract
तेजी से और प्रभावी निदान प्रभावी रोगी प्रबंधन और उपचार को सक्षम करने से संक्रामक रोग को नियंत्रित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. यहाँ, हम रोगी nasopharyngeal (एनपी) swabs और रेस्पायरेट्रस में इन्फ्लूएंजा ए वायरस बढ़ाना करने की क्षमता के साथ एक एकीकृत microfluidic थर्माप्लास्टिक चिप उपस्थित थे. रोगी नमूना लोड पर, microfluidic डिवाइस sequentially पर चिप सेल, आरएनए शोधन और ठोस चरण निष्कर्षण (SPE), रिवर्स प्रतिलेखन (आर टी) और RT-पीसीआर कक्षों में पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के भीतर एकाग्रता कदम किया जाता है, क्रमशः. अंत बिंदु का पता लगाने दूर एक चिप Bioanalyzer (टेक्नोलॉजीज, सांता क्लारा, CA) का उपयोग किया जाता है. बाह्य उपकरणों के लिए, हम एक ही सिरिंज पंप का इस्तेमाल किया अभिकर्मक और नमूने ड्राइव, जबकि दो पतली फिल्म heaters आरटी पीसीआर और कक्षों के लिए गर्मी के स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया. चिप के लिए एक परत और उच्च throughput विनिर्माण के लिए करने के लिए उपयुक्त fabricati को कम करने के लिए बनाया गया हैसमय और लागत पर. microfluidic चिप एक वायरस और बैक्टीरिया की एक विस्तृत विविधता, अभिकर्मक डिजाइन में परिवर्तन करने के लिए ब्याज की नई रोगज़नक़ों का पता लगाने की जरूरत द्वारा ही सीमित का विश्लेषण करने के लिए एक मंच प्रदान करता है.
Introduction
20 सदी के 1 तीन इन्फ्लूएंजा महामारियां के दौरान होने वाली मौतों की लाखों सूचित किया गया है. इसके अलावा, 2009 में विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) द्वारा 2 सबसे हाल ही में फ्लू महामारी घोषित किया गया था, और 1 अगस्त, 2010 के रूप में, 18,449 लोगों की मृत्यु तीन डब्ल्यूएचओ द्वारा सूचित किया गया है. यह महामारी फिर संक्रामक रोग के उच्च बोझ है, और इन्फ्लूएंजा तेजी से और सही पता लगाने के लिए तेजी से रोग की पुष्टि, उपयुक्त सार्वजनिक स्वास्थ्य प्रतिक्रिया और प्रभावी उपचार 4 सक्षम के लिए की जरूरत का प्रदर्शन किया.
वहाँ कई तरीके हैं इन्फ्लूएंजा के निदान के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया, इन तेजी immunoassays, प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट प्रतिजन परीक्षण (DFA) और वायरल संस्कृति के तरीके शामिल हैं. रैपिड immunoassays नाटकीय रूप से 5-8 संवेदनशीलता की कमी है, जबकि अन्य दो तरीकों श्रम प्रधान और समय लेने वाली 9. आणविक परीक्षणों बारी के आसपास समय, उच्च Sensit सहित कई फायदे की पेशकशivity और उच्च विशिष्टता. कई वाणिज्यिक संस्थाओं संक्रामक रोगों के लिए किया गया है तेजी से आणविक परीक्षण (भी बुलाया न्यूक्लिक अम्ल परीक्षण या NATs) की दिशा में काम कर रहा है, और उनके पाइपलाइनों में कई इन्फ्लूएंजा assays है. हालांकि उनमें से ज्यादातर बंद चिप नमूना तैयार करने की आवश्यकता है. नैदानिक प्रयोगशाला सुधार (CLIA) संशोधन माफ आणविक परीक्षण परख कारतूस या मॉड्यूल नमूना तैयार करने में शामिल में से कोई भी.
लैब-on-a-चिप प्रौद्योगिकी बिंदु का ध्यान परीक्षण उपकरणों के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. १९९३ 10 में पहली पीसीआर चिप के परिचय के बाद, कई प्रयासों न्यूक्लिक एसिड परीक्षण चिप्स के विकास में डाल दिया गया. हालांकि, इनमें से केवल कुछ बहाव के प्रवर्धन के साथ एकीकृत कच्चे नमूना तैयार करने है.
हम पहले एक प्लास्टिक microfluidic 11 चिप में एक ठोस चरण निष्कर्षण स्तंभ (SPE) के miniaturization का प्रदर्शन किया और विकसितजाहिर है और एक सतत प्रवाह पीसीआर 12 चिप के अनुकूलन. यहाँ, हम पिछले आरटी और पीसीआर चरणों का नैदानिक निदान के लिए एक सिंगल चिप में SPE और एकीकृत इसके लिए रोगी nasopharyngeal (एनपी) swabs और रेस्पायरेट्रस से न्यूक्लिक एसिड बढ़ाना क्षमता प्रदर्शित करने का काम करता हूं.
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Protocol
1. चिप 12 फैब्रिकेशन
- दो सजीले टुकड़े Zeonex 690R छर्रों से: 8-9 ग्राम Zeonex छर्रों गर्म प्रेस पर एक धातु की थाली, पहले से गरम के 5 मिनट के लिए 198 डिग्री सेल्सियस पर केंद्र में समान रूप से वितरित करने के लिए और फिर दबाव एक और 5 मिनट के लिए 2,500 साई के लिए धीरे धीरे लागू. इस चरण को पूरा करने के लिए, हम एक Carver गर्म प्रेस का इस्तेमाल किया.
- एम्बॉसफ़िल्टर microfluidic चैनल एक epoxy आचारण के साथ पट्टिका में. मोल्ड निर्माण पर विवरण रेखांकित कर रहे हैं 12 (चित्रा 2b में चैनल डिजाइन) कहीं: epoxy ढालना पर एक पट्टिका लगा, उन्हें गर्म प्रेस पर 157 ° पहले से गरम 10 मिनट के लिए सी और फिर एक और 10 मिनट के लिए दबाव 1,000 साई धीरे धीरे लागू . हाथ से ढालना से पट्टिका निकालें या एक चिमटे का उपयोग करने से पहले यह नीचे ठंडा. (नोट: इस चरण के दौरान थर्मल दस्ताने पहनते हैं.)
- इनलेट, बेकार, बंदरगाह, और microfluidic चैनल की दुकान पर उभरा चिप में छेद ड्रिल. हम एक 1.25 मिमी diamड्रिल बिट eter तीन छेद कर.
- बॉण्ड आइपीए, RNase दूर और अनुक्रम में विआयनीकृत पानी के साथ एक और शीर्ष पर पट्टिका के साथ उभरा चिप: चिप्स धो, 131 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्रेस पर एयर सूखी और उन्हें पहले से गरम 10 मिनट के लिए और फिर किसी अन्य के लिए 350 साई पर प्रेस 10 मिनट.
- इनलेट, बेकार, और आउटलेट अलग जेबी वेल्ड Epoxy का उपयोग बंदरगाहों पर Nanoports संलग्न, निर्माता के निर्देशों के अनुसार 15 से 24 घंटे के लिए इलाज.
- 50 μl RNase दूर के साथ SPE चैनल, 100 μl nuclease मुफ्त पानी के साथ बाद कुल्ला.
- ग्राफ्टिंग समाधान (3% w / v Benzophenone के साथ मिथाइल methacrylate) के 4 μl के साथ SPE चैनल लोड और फिर 365 एनएम यूवी तरंगदैर्य और 2000 / MJ सेमी 2 के तहत एक यूवी ओवन में 10 मिनट के लिए incubating द्वारा methacrylate Crosslink. निर्वात साथ अवशिष्ट ग्राफ्टिंग समाधान निकालें. हम दीवार निर्वात इस्तेमाल किया. सर्वोत्तम परिणामों के लिए, एक ताजा समाधान किया जाना चाहिए. यह आम तौर पर स्वीकार्य है, तथापि, एक स्टोर करने के लिए4 डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह तक के लिए तैयार समाधान.
- Ethylene dimethacrylate 16%, 24% butyl methacrylate, 42% 1-dodecanol, 18% cyclohexanol, और 1% 2-dimethylamino 4 (मिथाइल-phenylamino)-phenol जोड़ें: SPE स्तंभ (सभी% v / v) समाधान करें तस्वीर सर्जक के रूप में.
- सिलिका microspheres SPE स्तंभ समाधान (एक 1:1 मिश्रण बनाने के लिए) के रूप में समाधान का एक ही मात्रा ले लो, और यह पूरी तरह से 70 डिग्री सेल्सियस पर एक निर्वात ओवन में सूखी रातोंरात. बंद कर दिया ढक्कन के साथ ट्यूब पर दोहन द्वारा गोली तोड़. सूखे सिलिका microsphere ट्यूब और मिश्रण के भंवर में SPE स्तंभ समाधान जोड़ें.
- एक ही चैनल में SPE समाधान के 4 μl लोड और फिर 2.5 मिनट के लिए पराबैंगनी विकिरण से यह Crosslink. फिर, पर चिप फ्लिप और एक और 2.5 मिनट के लिए प्रकाशित. polymerized SPE स्तंभ एक अपारदर्शी सफेद ठोस होना चाहिए.
- धोने के 100% दूर अतिरिक्त reactants कुल्ला मेथनॉल की 500 μl चैनल के साथ. यह धोने भी अंतर बहुलक पो को हटाrogenic सॉल्वैंट्स, जिससे SPE स्तंभ के खुला ताकना संरचना बनाने जब परिवेश की स्थिति में सूख.
- Thermally प्रवाहकीय टेप के साथ चिप के नीचे करने के लिए दो पतली फिल्म heaters संलग्न. heaters के पक्ष विकृतीकरण और अलग annealing (चित्रा 1 देखें) के लिए विस्तृत चैनलों की बढ़त के साथ गठबंधन करने की आवश्यकता है.
- मृत के माध्यम से चिप में पाँच thermocouples प्रत्येक चिप के खुले पक्ष चैनल (चित्रा 2b देखें) समाप्त हो गया. thermocouples प्रेस फिट के माध्यम से इन चैनलों में रहते हैं. टेप आगे thermocouples का स्थान तय करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
2. ठोस चरण निकालना विधि
- DEPC का इलाज और autoclaved पानी (विआयनीकृत या Millipore फ़िल्टर्ड) के साथ 70% इथेनॉल के 96 μl तैयार.
- जोड़ें 25x शाही सेना के 4 μl एक ट्यूब में 70% इथेनॉल के 96 μl के लिए सुरक्षित है, और एक अलग ट्यूब में 100% इथेनॉल के साथ एक ही मिश्रण डुप्लिकेट.
- 300 तैयार करेंचैनल बफर के निम्न मिश्रण से μl 6 एम guanidine (GuSCN) thiocyanate, 2-propanol के 150 μl nuclease मुक्त पानी की 63 μl, और 25x सुरक्षित शाही सेना की 12 μl 75 μl.
- तैयार 6 एम GuSCN, 2-propanol के 200 μl, और 12 μl 25x सुरक्षित शाही सेना के 100 μl: मिश्रण lysis बफर के 312 μl.
- गर्मी 70% इथेनॉल 100% इथेनॉल, चैनल बफर और 10-20 मिनट के लिए शाही सेना सुरक्षित सक्रिय lysis buffers 60 डिग्री सेल्सियस.
- Microfluidic चैनल समभार बनाना, 0.8 मिलीग्राम / घंटा की एक प्रवाह दर पर SPE चैनल के माध्यम से चैनल बफर चलाने.
- नहाने के पानी में 37 डिग्री सेल्सियस पर VTM में परीक्षण के नमूने, त्वरित पिघलना और नमूना तुरंत पानी से स्नान के रूप में जल्द ही के रूप में यह thawed है दूर.
- 10 मिनट के लिए 13,000 rpm पर नमूना अपकेंद्रित्र, और lysis बफर के 300 μl में सतह पर तैरनेवाला के 100 μl हस्तांतरण. 1 ग्राम / μl वाहक शाही सेना की 6 μl जोड़कर मिश्रण को पूरा करें.
- मिश्रण करने के लिए, और भंवर के लिए स्पिन के बाद5 सेकंड, एक Luer लोक 1 सीसी सिरिंज में पूरे lysate लोड.
- 0.8 की एक प्रवाह दर पर SPE चैनल के माध्यम से भागो lysate मिलीग्राम / घंटा.
- 70% इथेनॉल के 100 μl के साथ SPE चैनल, 100 1 मिलीग्राम / घंटा μl of100% इथेनॉल के द्वारा पीछा धो लें. (वहाँ एक सिरिंज टिप है कि बाहर नहीं धक्का दिया जाएगा में 50 μl मृत मात्रा है, तो वास्तव में केवल 50 μl चैनल के माध्यम से जा रहा है.)
- स्थिति 0.5 मिलीलीटर निशान पर एक खाली सिरिंज हवा और चैनल के माध्यम से पुश करने के लिए यह 1 में सूखे मिलीग्राम / घंटा.
- चैनल के माध्यम से भागो nuclease मुफ्त पानी का 67.5 μl 0.5 पर बाध्य न्यूक्लिक एसिड elute मिलीग्राम / घंटा और अपशिष्ट बंदरगाह पर nanoport से 13.5 μl इकट्ठा. (द्रव नुकसान सिरिंज टिप और SPE चैनल में 54 μl मृत मात्रा की वजह से है.)
3. RT-पीसीआर
- शुष्क हवा (2.12) कदम एक Qiagen OneStep RT-पीसीआर किट में अभिकर्मकों का उपयोग के दौरान RT-पीसीआर मास्टर मिश्रण के 36.5 μl तैयार.
- RT-पीसी लोडअपशिष्ट बंदरगाह पर nanoport में आर अभिकर्मक, और शाही सेना के साथ मिश्रण करने के लिए निम्नलिखित 50 μl RT-पीसीआर प्रतिक्रिया मिल: nuclease मुफ्त पानी, 4 μl RT-पीसीआर एंजाइम मिश्रण, 10 μl क्यू समाधान, 10 एक μl1X में 13.5 μl eluted शाही सेना कदम बफर, 2 μl 25 मिमी 2 MgCl, 1 μl 50 आगे सुक्ष्ममापी 5'-GAC प्राइमर CRA टीसीसी TGT सीएसी सीटीसी TGA C-3, 1 μl 50 सुक्ष्ममापी रिवर्स प्राइमर 5'-AGG GCA TTY TGG एसीए AAK CGT CTA-3 ', 2 μl dNTP, 0.75 μl 1.0% w / v बीएसए, 0.73 PEG8000 μl और 5.02 μl nuclease मुफ्त पानी.
- RT-पीसीआर में मिश्रण लोड कोमल द्वारा वैक्यूम RT चैनल (हम दीवार वैक्यूम) का इस्तेमाल किया और एक बंद फिटिंग के साथ Nanoport सील.
- 1 हीटर 35 वी लागू. आर टी चैनल में अभिकर्मकों 30 मिनट के लिए रखें 1 हीटर के बाद 50 डिग्री सेल्सियस में equilibrates आरटी चैनल में हीटर 1 equilibrates के बाद 15 मिनट में 95 डिग्री सेल्सियस के लिए अभिकर्मकों रखें
- 1 हीटर और 2 हीटर के लिए 50 वी 27 वी लागू करने के लिए 60 और डी में तीन मिनट के बारे में या हीटर सभी 1 equilibrates जब तक इंतजारजी, सी और 95 पर 2 हीटर equilibrates डिग्री सेल्सियस
- 0.5 μl / मिनट में पीसीआर चैनल में अभिकर्मकों पुश. यह के बारे में 20 मिनट लेने के लिए अभिकर्मकों चक्करदार चैनल के माध्यम से प्रवाह के लिए करना चाहिए.
- के रूप में नमूना यह चक्करदार चैनल के अंत करने के लिए बनाता है, एक उचित आकार pipettor और टिप का उपयोग कर दुकान पर पीसीआर उत्पादों इकट्ठा.
4. पीसीआर उत्पादों डिटेक्शन
- हम एक Agilent उच्च संवेदनशीलता डीएनए परीक्षण करने के लिए उत्पादों का पता लगाने का उपयोग करें. चलाने के इस परीक्षण रेफ्रिजरेटर से बाहर Agilent उच्च संवेदनशीलता डीएनए परीक्षण से पहले 30 मिनट किट ले.
- Bioanalyzer पर मुड़ें और 2100 विशेषज्ञ सॉफ्टवेयर खुला.
- परीक्षण में पीसीआर उत्पादों की 1 μl लोड और Agilent प्रोटोकॉल (अनुसरण http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent% 20Manual.pdf ).
- विश्लेषण और डेटा रिकॉर्ड.
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Representative Results
एक विशिष्ट परिणाम एक एक संक्रमित nasopharyngeal धोने नमूना के लिए इन्फ्लूएंजा चित्रा 3 में दिखाया गया है. प्रत्येक रोगी के नमूने में इन्फ्लूएंजा वायरस के विभिन्न मात्रा के कारण, पीसीआर उत्पाद के अंतिम एकाग्रता अलग अलग होंगे. एक अच्छा परिणाम कम शोर, दो स्पष्ट सीढ़ी चोटियों (35 और 10380 बीपी) और तैयार उत्पाद आकार (107 बीपी) पर सकारात्मक नमूने के लिए एक एकल उत्पाद पीक होना चाहिए. जबकि उत्पाद शिखर नकारात्मक नियंत्रण के लिए सैद्धांतिक रूप से अनुपस्थित होना चाहिए, हम कुछ नमूने में गठन प्राइमर dimers से बिन्दुपथ फ्लू विशिष्ट के पास नकली पीसीआर चोटियों का निरीक्षण किया. एकाधिक उत्पाद चोटियों परीक्षण के संभावित प्रदूषण को दर्शाते हैं. यदि ऐसा होता है, नमूना के एक और अशेष भाजक retested किया जाना चाहिए. जेल वैद्युतकणसंचलन परीक्षण 13 परिणामों के आगे सत्यापन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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चित्रा 1. चिप योजनाबद्ध नीचे शीर्ष सरलीकृत लाल रूपरेखा चिप के तल पर संपर्क heaters के स्थान दिखा.
चित्रा 2. microfluidic परख प्रवाह 13 (क) संलग्न पतली फिल्म heaters और दो बैरल सिरिंज पंप के साथ दो चिप्स microfluidic की छवि. ग्लास सीरिंज लचीला अभिकर्मकों और नमूने लोड टयूबिंग हर चिप के साथ जुड़े हुए थे. तीन बंदरगाहों SPE चैनल और अपशिष्ट बंदरगाह, और पीसीआर चैनल की दुकान की inlets पर चिपके थे, (ख) तीन वर्गों के साथ चैनल डिजाइन: नमूना तैयारी (SPE), आरटी कक्ष और सतत प्रवाह पीसीआर चैनल. दो निश्चित प्रतिरोध heaters के माध्यम से जुड़े होते हैं चिप के नीचे करने के लिए थर्मल टेप. चैनलों के बीच द्रव प्रवाह लामिना था, और द्रव प्रतिरोध में परिवर्तन वाल्व कम ऑपरेशन के लिए अनुमति दी. गहराई 500 सुक्ष्ममापी SPE और rt चैनलों के लिए है, और पीसीआर चैनल 100 सुक्ष्ममापी गहरी है. चौड़ाई SPE स्तंभ के लिए 500 सुक्ष्ममापी, आर टी कक्ष के लिए 1 मिमी, और सतत प्रवाह पीसीआर चैनल के व्यापक और संकीर्ण वर्गों के लिए 200 से 400 सुक्ष्ममापी से बदलती हैं. चिप लंबाई में 70 मिमी, चौड़ाई में 25 मिमी और ऊंचाई में 1.4 मिमी (ग) Microfluidic परख प्रक्रिया प्रवाह है. nasopharyngeal नमूना lysis बफर, चिप के लिए आवेदन के साथ मिलाया जाता है, चिप पर चलाने के लिए है और पीसीआर उत्पादों एक वाणिज्यिक केशिका electrophoresis चिप का उपयोग कर पढ़ रहे हैं 13. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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चित्रा 3. चिप अंत बिंदु नैदानिक परिणाम पर पीसीआर उत्पाद शिखर 107 बीपी के आकार में मध्यम शिखर है. (35 बीपी) बाएँ और दाएँ चोटियों (१०३८० बीपी) नियंत्रण सीढ़ी चोटियां हैं. प्रत्येक चोटी के उत्पादों की एकाग्रता वक्र के अंतर्गत क्षेत्र है. इन सारणीबद्ध. (क) बिना किसी शोर चोटी के सकारात्मक परिणाम (ख) 42 बीपी में प्राइमर dimers साथ सकारात्मक परिणाम. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
निदान पद्धति यहाँ प्रस्तुत उच्च विशिष्टता और एक कम सीमा का पता लगाने के साथ मरीज के नमूनों से इन्फ्लूएंजा ए शाही सेना को बढ़ाना एक एकीकृत microfluidic प्लास्टिक चिप की क्षमता का प्रदर्शन 13 हम ध्यान परीक्षण के संभावित बिंदु के लिए इस चिप डिजाइन: (क) तापमान और fluidic नियंत्रण सरलीकृत किया गया है, (ख) चिप कम लागत के और उच्च throughput इंजेक्शन मोल्डिंग का उपयोग निर्माण के लिए उपयुक्त है, और (ग) चिप डिस्पोजेबल और एक समय का उपयोग के उद्देश्य के लिए है, इस प्रकार नमूना पार संदूषण की चिंता को कम करने.
हालांकि 3 घंटा की हमारी वर्तमान क्रम पर चिप, हमारे निष्कर्षण मंच अनुकूलन प्रक्रिया के लिए पर्याप्त कमरे शामिल हैं. उदाहरण के लिए, और क्षालन से पहले सही धोने सूखी बार प्रवाह की दर में वृद्धि और धोने के संस्करणों को कम करने का एक संयोजन के द्वारा कम किया जा सकता है. इसके अलावा, लागत चिप निर्माण की प्रक्रिया को व्यवस्थित बनाने और महंगा या बोझिल पेरी की जगह से छंटनी की जा सकती हैसिरिंज पंप, डिस्पोजेबल सिरिंज जलसेक पंप और छोटी बैटरी पैक ठोस चरण निष्कर्षण स्तंभ ज्यामिति और porosity खोलने जैसे विकल्प के साथ बिजली की आपूर्ति, के रूप में pherals, पंप आवश्यकताओं में महत्वपूर्ण कटौती के लिए अनुमति देगा. इसके अलावा, एक बार चिप डिजाइन उच्च मात्रा विनिर्माण के लिए मानकीकृत है, उपकरण के विकास में इस्तेमाल किया thermocouples के कई समाप्त हो जाएगा.
अन्य कारकों की तुलना में, हमारे इन्फ्लूएंजा पर चिप पहचान मॉड्यूल की मजबूती दोनों अच्छे तापमान नियंत्रण और उपयुक्त नमूना सौंपने पर निर्भर करता है. थोड़ा वांछित तापमान पर चिप, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इन्फ्लूएंजा नमूना के कई unintentional फ्रीज पिघलना चक्र से ऑफसेट, दोनों अंतिम पीसीआर उपज को कम कर सकता है. एक तरफ इन कारकों से, हमारे पर चिप अलग मरीज के नमूनों से पीसीआर 13 परिणाम में बदलाव भी करने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है: वायरल लोड में परिवर्तन, मानव कोशिकाओं और bloo contaminating के विभिन्न स्तरोंघ, न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण, 14,15 और नमूनों और परीक्षण अभिकर्मकों या डिवाइस ही 16 के बीच अप्रत्याशित रासायनिक और / या शारीरिक प्रतिक्रियाओं के बाद पीसीआर inhibitors की उपस्थिति.
सारांश में, हम हमारे microfluidic चिप की व्यवहार्यता इन्फ्लूएंजा चिकित्सकीय प्रासंगिक nasopharyngeal नमूनों में वायरस से शाही सेना बढ़ाना प्रदर्शन किया है. चिप अन्य डीएनए या शाही सेना लक्ष्य के लागू होने की संभावना है.
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा की है.
Acknowledgments
इस शोध के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) अनुदान EB008268 R01 द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G | |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G | |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML | |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml | |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 | |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 | |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML | |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 | |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 | |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 | |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 | |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 | |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 | |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 | |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 | |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V | |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML | |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 | |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 | |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 | |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A | |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 | |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
References
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