Summary
Integrato chip microfluidica termoplastico è stato sviluppato per l'utilizzo come diagnostica molecolare. Il chip esegue l'estrazione di acido nucleico, la trascrittasi inversa e PCR. Metodi per la fabbricazione e l'esecuzione del chip sono descritti.
Abstract
Diagnostica rapida ed efficace svolgono un ruolo importante nel controllo delle malattie infettive, consentendo la gestione efficace del paziente e del trattamento. Qui, presentiamo integrato chip microfluidica termoplastico con la capacità di amplificare virus in pazienti nasofaringei (NP) tamponi e aspirati. Una volta caricato il campione del paziente, il dispositivo microfluidico esegue sequenzialmente su-chip lisi cellulare, purificazione dell'RNA e concentrazione all'interno estrazione in fase solida (SPE), la trascrizione inversa (RT) e la reazione a catena della polimerasi (PCR) in RT-PCR camere, rispettivamente. End-point di rilevamento è effettuato con un off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Per le periferiche, abbiamo utilizzato una sola pompa siringa per guidare reagenti e campioni, mentre due riscaldatori a pellicola sottile sono stati utilizzati come sorgenti di calore per la PCR e RT camere. Il chip è progettato per essere a singolo strato e adatta per la produzione ad alto throughput per ridurre il fabricatiil tempo e il costo. Il chip microfluidico fornisce una piattaforma per analizzare una varietà di virus e batteri, limitato solo dalle variazioni di progettazione reagenti necessari per individuare nuovi agenti patogeni di interesse.
Introduction
Milioni di morti sono stati segnalati nel corso delle tre pandemie influenzali del 20 ° secolo 1. Inoltre, la pandemia influenzale più recente è stato dichiarato dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) 2 nel 2009, e dal 1 ° agosto 2010, 18.449 decessi sono stati segnalati dall'OMS 3. Questa pandemia dimostrato ancora una volta l'elevato onere delle malattie infettive, e la necessità di una rapida ed accurata di influenza per la conferma rapida della malattia, la risposta del caso la salute pubblica e un trattamento efficace 4.
Ci sono diversi metodi ampiamente utilizzati per la diagnosi di influenza, questi includono test immunologici rapidi, test antigene diretto (DFA) e metodi di coltura virale. Immunologici rapidi drammaticamente mancano sensibilità 5-8, mentre gli altri due metodi sono di manodopera e richiede tempo 9. Test molecolari offrono molteplici vantaggi tra cui un breve tempo di ritorno, SENsit altaivity e una maggiore specificità. Diversi enti commerciali hanno lavorato per veloci test molecolari (chiamato anche test di acidi nucleici o NAT) per le malattie infettive, e molti saggi hanno influenza nelle loro condotte. Tuttavia la maggior parte di essi richiedono off-chip preparazione del campione. Nessuno degli emendamenti Clinical Laboratory Improvement (CLIA) hanno rinunciato test molecolari integrare la preparazione del campione nella cartuccia dosaggio o il modulo.
Lab-on-a-chip svolge un ruolo importante nello sviluppo di point-of-care test. Dopo l'introduzione del primo chip PCR nel 1993 10, numerosi sforzi sono stati messi in sviluppo chip di test di acidi nucleici. Tuttavia, solo pochi di questi hanno integrato preparazione grezza campione con amplificazione a valle.
Abbiamo precedentemente dimostrato la miniaturizzazione di una colonna di estrazione in fase solida (SPE) in un chip di plastica microfluidico 11 e lo svilupposviluppo e ottimizzazione di un chip a flusso continuo PCR 12. Qui, si estende la precedente lavoro di integrare la SPE con RT e PCR passi in un unico chip per la diagnostica clinica e dimostrare la sua capacità di amplificare gli acidi nucleici da paziente nasofaringei (NP) tamponi e aspirati.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Chip Fabrication 12
- Fare due placche da Zeonex pellets 690R: distribuire 8-9 grammi pellets Zeonex uniformemente nel centro di una piastra metallica, preriscaldare il pressa riscaldata a 198 ° C per 5 min, e quindi applicare pressione lentamente a 2500 psi per altri 5 minuti. Per completare questo passaggio, abbiamo usato una pressa a caldo Carver.
- Rilievo il canale microfluidica nella placca con uno stampo epossidica. Dettagli sulla fabbricazione dello stampo sono descritte altrove 12 (disegno del canale in Figura 2b): posizionare una placca sullo stampo epossidico; preriscaldare loro sulla pressa riscaldata a 157 ° C per 10 minuti e quindi applicare pressione lentamente a 1000 psi per 10 min . Rimuovere la placca dallo stampo a mano o con una pinza prima che si raffreddi. (Nota: indossare guanti termici durante questa fase.)
- Forare il chip goffrato in ingresso, porta rifiuti, e l'uscita del canale microfluidico. Abbiamo usato a 1.25 mm diameter punta da trapano per fare i tre fori.
- Legame del chip goffrato con un'altra placca (in alto): Lavare i chip con IPA, RNAse via e acqua deionizzata in sequenza; aria secca e preriscaldare loro sulla pressa riscaldata a 131 ° C per 10 min e poi premere a 350 psi per un'altra 10 min.
- Fissare Nanoports all'ingresso, i rifiuti, e le porte di uscita separatamente utilizzando JB Weld epossidico; cura per 15 a 24 ore secondo le istruzioni del produttore.
- Sciacquare il canale SPE con 50 microlitri RNasi Away, seguita con 100 microlitri di acqua priva di nucleasi.
- Caricare il canale SPE con 4 ml di soluzione di innesto (metilmetacrilato con 3% w / v benzofenone) e quindi reticolare il metacrilato incubando per 10 minuti in un forno sotto UV di lunghezza d'onda UV 365 nm e 2000 mJ / cm 2. Rimuovere la soluzione residua innesto con vuoto. Abbiamo utilizzato il vuoto muro. Per i migliori risultati, una soluzione fresca dovrebbe essere usato. Di solito è accettabile, tuttavia, per memorizzare unsoluzione preparata a 4 ° C per un massimo di una settimana.
- Rendono la soluzione SPE colonna (tutti v / v%): dimetacrilato di etilene 16%, 24% di metacrilato di butile, 42% 1-dodecanolo, 18% cicloesanolo, e aggiungere 1% 2-dimetilammino-4-(metil-fenilammino)-fenolo come la foto-iniziatore.
- Estrarre lo stesso volume di soluzione di microsfere di silice come la soluzione colonna SPE (per fare una miscela 1:1), ed asciugare completamente a 70 ° C per una notte in un forno sotto vuoto. Suddividere il pellet toccando il tubo con il coperchio chiuso. Aggiungere la soluzione di SPE colonna nel tubo di microsfere di silice essiccata e agitare per miscelare.
- Caricare 4 microlitri della soluzione SPE nello stesso canale e quindi reticolare tramite irradiazione UV per 2,5 min. Quindi, capovolgere il chip più e irradiare per un altro min 2.5. La colonna SPE polimerizzato deve essere un solido bianco opaco.
- Lavare il canale con 500 ml di metanolo 100% per risciacquare via reagenti in eccesso. Questo lavaggio rimuove anche intra-polimero posolventi rogenic, creando così la struttura a pori aperti della colonna SPE quando essiccato in condizioni ambientali.
- Fissare due film sottile riscaldatori al fondo del chip con nastro termoconduttivo. I lati dei riscaldatori devono essere allineati con il bordo dei canali larghi per la denaturazione e annealing separatamente (vedi Figura 1).
- Inserire cinque termocoppie nel chip tramite i morti finito canali laterali aperti di ogni chip (vedi figura 2b). Le termocoppie restare in questi canali tramite press-fit. Nastro è stato utilizzato per fissare ulteriormente la posizione delle termocoppie.
2. Metodo di estrazione in fase solida
- Preparare 96 ml di etanolo al 70% con acqua trattata con DEPC e autoclavato (deionizzata o Millipore filtrata).
- Aggiungere 4 pl di RNA 25X Fissare a 96 pl di etanolo al 70% in una provetta, e duplicare la stessa miscela di etanolo al 100% in un tubo separato.
- Preparare 300pl di tampone canale miscelando il seguente: 75 pl di 6 M guanidina tiocianato (GuSCN), 150 ml di 2-propanolo, 63 microlitri di acqua priva di nucleasi, e 12 pl di RNA 25X sicuri.
- Preparare 312 ml di tampone di lisi mescolando: 100 pl di GuSCN 6 M, 200 ml di 2-propanolo, e 12 pl di RNA 25X sicuri.
- Riscaldare l'etanolo 70%, 100% etanolo, tampone canale e tamponi di lisi a 60 ° C per 10-20 min per attivare la sicura RNA.
- Per equilibrare il canale microfluidico, eseguire il buffer canale attraverso il canale SPE ad una portata di 0,8 ml / hr.
- Quick-scongelare il campione in VTM a 37 ° C in bagno d'acqua, e rimuovere il campione immediatamente dal bagnomaria appena lo scongelamento.
- Centrifugare campione a 13.000 rpm per 10 min, e trasferire 100 pl del supernatante in 300 pl di tampone di lisi. Completare l'impasto aggiungendo 6 microlitri di 1 mg / RNA carrier pl.
- Vortex per mescolare, e dopo la centrifuga per5 secondi, caricare il lisato intero in un Luer-Lok 1 siringa cc.
- Eseguire il lisato attraverso il canale SPE ad una portata di 0,8 ml / hr.
- Lavare il canale SPE con 100 ml di etanolo al 70%, seguito da etanolo al 100 microlitri of100% a 1 ml / hr. (C'è un volume di 50 microlitri morto nella punta della siringa che non verrà spinto fuori, quindi in realtà solo 50 pl sta attraversando il canale.)
- Posizionare una siringa vuota alla tacca 0,5 ml e spingere aria attraverso il canale di asciugare a 1 ml / hr.
- Run 67,5 ml di acqua priva di nucleasi attraverso il canale per eluire gli acidi nucleici legati a 0,5 ml / h, e raccogliere 13,5 microlitri dal nanoport al porto rifiuti. (La perdita di fluido è dovuto al volume di 54 microlitri morto nella siringa e il canale SPE.)
3. RT-PCR
- Preparare 36,5 microlitri della RT-PCR Master Mix durante la fase di aria secca (2.12) utilizzando i reagenti in un Qiagen OneStep RT-PCR kit.
- Caricare RT-PCR reagente nel nanoport al porto dei rifiuti, e mescolare con l'RNA per ottenere il seguente 50 microlitri RT-PCR reazione: 13,5 pl RNA eluiti in acqua priva di nucleasi, 4 microlitri RT-PCR mix enzima, 10 ul di soluzione Q, 10 μl1X uno passo tampone, 2 microlitri 25 mM MgCl2, 1 pl 50 pm in avanti fondo 5'-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3 ', 1 ml 50 microns di primer inverso 5'-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3 ', 2 microlitri dNTP, 0,75 microlitri 1,0% w / v BSA, 0,73 microlitri PEG8000 e 5.02 microlitri di acqua priva di nucleasi.
- Caricare il RT-PCR miscela nel canale RT da vuoto gentile (abbiamo usato il vuoto parete) e sigillare il Nanoport con un raccordo chiuso.
- Applicare 35 V al riscaldatore 1. Mantenere i reagenti nel canale RT per 30 minuti dopo il riscaldatore 1 equilibra a 50 ° C. Mantenere i reagenti nel canale RT per 15 minuti dopo il 1 equilibra riscaldamento a 95 ° C.
- Applicare 27 V, le resistenze del 1 e 50 V a riscaldatore 2, attendere circa tre minuti o fino a riscaldatore 1 equilibra a 60 & deg; C e riscaldatore 2 equilibra a 95 ° C.
- Spingere i reagenti nel canale PCR a 0,5 microlitri / min. Dovrebbe prendere circa 20 min per i reagenti di fluire attraverso il canale a serpentina.
- Quando il campione rende alla fine del canale a serpentina, raccogliere i prodotti di PCR a presa utilizzando un pipettatore opportunamente dimensionato e punta.
4. Prodotti PCR Detection
- Usiamo un test del DNA ad alta Agilent sensibilità per individuare i prodotti. Per eseguire questo test vengono eseguiti fuori l'Alto Agilent Kit DNA Sensibilità dal frigorifero 30 minuti prima del test.
- Accendere il Bioanalyzer e aprire il 2100 del software Expert.
- Caricare il 1 pl di prodotti di PCR nella sperimentazione e seguire il protocollo Agilent ( 20Manual.pdf http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent% ).
- Analizzare e registrare i dati.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un tipico risultato è mostrato in Figura 3 per un influenza A esemplare infetto lavaggio nasofaringeo. A causa delle diverse quantità di virus dell'influenza in ogni campione, la concentrazione finale del prodotto di PCR varierà. Un buon risultato deve avere basso rumore, due picchi scaletta chiari (35 e 10.380 bp) e un picco singolo prodotto con le dimensioni prodotto progettato (107 bp) per il campione positivo. Mentre il picco prodotto teoricamente dovrebbe essere assente per i controlli negativi, abbiamo fatto osservare picchi spuri PCR vicino l'influenza specifico locus di primer-dimeri di formazione in alcuni campioni. Picchi di prodotti più riflettere la potenziale contaminazione del test. In questo caso, un'altra aliquota del campione dovrebbero essere riesaminati. Elettroforesi su gel può essere usato per ulteriore verifica dei risultati della prova 13.
in "fo: src =" / files/ftp_upload/50325/50325fig1highres.jpg "/>
Figura 1. Semplificata top down schematica chip. I contorni rosso mostrano la disposizione delle resistenze di contatto sul fondo del chip.
Figura 2. Il flusso di test microfluidica 13. (A) Immagine di due chip microfluidici con annesso riscaldatori a film sottile e due botte pompa siringa. Siringhe di vetro sono stati collegati a ciascun chip con tubo flessibile per caricare reagenti e campioni. Tre porte stati incollati alle bocche di canale SPE e l'attacco dello scarico, e l'uscita del canale di PCR (b) progettazione Canale con tre sezioni:. Preparazione del campione (SPE), RT camera e continuo flusso PCR canale. Due riscaldatori a resistenza fissi sono collegati tramite nastro termico per la parte inferiore del chip. Flusso di fluido tra i canali è laminare, e variazioni di resistenza del fluido consentita per valvola-less funzionamento. La profondità è di 500 micron per SPE RT e canali, e il canale di PCR è di 100 micron di profondità. Le larghezze sono 500 micron per la colonna SPE, 1 mm per la camera di RT, e variano 200-400 micron per le sezioni larghe e strette del canale di flusso continuo PCR. Il chip è di 70 mm in lunghezza, 25 mm di larghezza e 1,4 mm di altezza. (C) test Microfluidic flusso di processo. Il campione del rinofaringe è mescolato con tampone di lisi, applicata al chip, il chip viene eseguito, ed i prodotti di PCR vengono letti utilizzando un chip commerciale elettroforesi capillare 13. Clicca qui per ingrandire la figura .
n "fo: src =" / files/ftp_upload/50325/50325fig3highres.jpg "/>
Figura 3. Il risultato di chip punto finale di diagnostica. Il picco prodotto di PCR è il picco medio alla dimensione di 107 bp. Picchi di sinistra (35 bp) e destro (10.380 bp) sono i picchi di controllo scala. La concentrazione dei prodotti di ciascun picco è l'area sotto la curva. Questi sono tabulati. (A) risultato positivo, senza alcun picco di rumore. (B) risultato positivo con-dimeri di primer a 42 bp. Clicca qui per ingrandire la figura .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il metodo diagnostico presentato qui dimostrato la capacità di un sistema integrato chip microfluidica plastica per amplificare influenzali RNA da campioni di pazienti con alta specificità e un limite di rilevabilità basso 13 Abbiamo progettato questo chip per potenziale punto di testing cura:. (A) la temperatura e fluidici controllo sono state semplificate, (b) il chip è a basso costo e adatto per fabbricazione ad alta con stampaggio ad iniezione, e (c), il chip è monouso e previsto per un solo uso, riducendo così la preoccupazione di contaminazione incrociata campione.
Anche se la nostra corrente on-chip di runtime di 3 ore, la nostra piattaforma di estrazione contiene un ampio spazio per l'ottimizzazione dei processi. Per esempio, il lavaggio e tempi di essiccazione destra prima eluizione potrebbe essere ridotto da una combinazione di aumentare la portata e la riduzione dei volumi di lavaggio. Inoltre, i costi possono essere tagliati semplificando il processo di fabbricazione di chip e sostituzione peri costose o ingombrantirecchi periferici, come le pompe a siringa, alimentazione, con alternative come pompe di infusione siringa usa e getta e batterie di piccole dimensioni di apertura la geometria solida estrazione fase colonna e porosità consentirà significative riduzioni nei requisiti della pompa. Inoltre, una volta che il design del chip è standardizzata per produzione ad alto volume, molte delle termocoppie utilizzate nello sviluppo del dispositivo saranno eliminati.
Più che di altri fattori, la solidità del nostro on-chip del modulo di rilevazione dell'influenza dipende sia il controllo della temperatura e consegna del campione. Leggero offset rispetto alla desiderata temperatura on-chip, così come non intenzionali di congelamento-scongelamento del campione influenza, potrebbe ridurre sia la resa finale PCR. Oltre a questi fattori, le variazioni nel nostro negozio on-chip risultati della PCR da 13 campioni di pazienti diversi potrebbe anche essere attribuito a: Variazione della carica virale, i diversi livelli di contaminanti cellule umane e Blood, la presenza di inibitori della PCR dopo estrazione degli acidi nucleici, 14,15 e imprevisti reazioni chimiche e / o fisiche tra i campioni ed i reagenti o dispositivo stesso 16.
In sintesi, abbiamo dimostrato la fattibilità del nostro chip microfluidica per amplificare l'RNA dal virus dell'influenza A in campioni nasofaringei medicalmente rilevanti. Il chip ha il potenziale di essere applicato a altro DNA o RNA target.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori hanno dichiarato alcun conflitto di interessi finanziari.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health (NIH) concessione R01 EB008268.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G | |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G | |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML | |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml | |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 | |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 | |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML | |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 | |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 | |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 | |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 | |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 | |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 | |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 | |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 | |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V | |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML | |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 | |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 | |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 | |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A | |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 | |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
References
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- WHO | World now at the start of 2009 influenza pandemic. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/ (2009).
- WHO | Pandemic (H1N1) 2009 - update 112. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/csr/don/2010_08_06/en/ (2009).
- Wenzel, J. J., et al. Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).
- Chan, K. H., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1. Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).
- Ginocchio, C. C., et al. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. Journal of. 45, 191-195 (2009).
- Aeron, C. H., et al. Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses. Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).
- Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting. Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).
- Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. Transducer'93, seventh international conference on solid state sensors and actuators. , 924-926 (1993).
- Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics. Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).
- Cao, Q., Kim, M. -C., Klapperich, C. Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments. Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).
- Cao, Q., et al. Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens. PLoS ONE. 7, e33176 (2012).
- Rådström, P. Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit. J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).
- Andreasen, D., et al. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50, S6-S9 (2010).
