Summary
통합 마이크로 열가소성 칩은 분자 진단으로 사용하기 위해 개발되었습니다. 이 칩은 핵산 추출, 역 transcriptase 및 PCR을 수행합니다. 제조 및 칩을 실행하기위한 방법은 설명되어 있습니다.
Abstract
빠르고 효과적인 진단은 효과적인 환자 관리 및 치료를함으로써 전염병을 제어하는 데 중요한 역할을한다. 여기, 우리는 환자 nasopharyngeal (NP) 면봉과 aspirates의 인플루엔자 바이러스를 증폭 할 수있는 능력을 통합 마이크로 열가소성 칩을 제시한다. 환자 샘플을로드하면, 마이크로 유체 장치는 순차적으로, 온칩 세포 용해, RNA 정화 및 고체 위상 추출 (SPE), 역 전사 (RT) 및 RT-PCR 챔버에서 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 농도 단계를 수행 각각. 엔드 포인트 검출은 오프 칩 Bioanalyzer을 (애질런트 테크놀로지스, 산타 클라라, CA)를 사용하여 수행됩니다. 이 박막 히터는 RT와 PCR 챔버의 열원으로 사용하는 동안 주변 기기를 들어, 우리는 시약 및 샘플을 늘리기 위해 하나의 주사기 펌프를 사용했습니다. 이 칩은 fabricati을 줄이기 위해 높은 처리량 제조를위한 단일 레이어와 적합하도록 설계되어시간과 비용 있습니다. 마이크로 칩은 관심의 새로운 병원균을 감지하는 데 필요한 시약 디자인의 변화 만 제한 바이러스와 박테리아의 다양한 분석 할 수있는 플랫폼을 제공합니다.
Introduction
수백만 명의 죽음은 20 세기 1 세 인플루엔자 전염병 동안보고되었습니다. 또한, 가장 최근의 인플루엔자 유행은 2009 년에 세계 보건기구 (WHO) 2로 선언되었고, 같은 2010년 8월 1일의, 18,449 사망자는 WHO 3보고되었다. 이 유행은 다시 전염성 질병의 높은 부담, 및 빠른 질병 확인, 적절한 공중 보건 대응하고 효과적인 치료 4 활성화 인플루엔자의 신속하고 정확한 탐지의 필요성을 보여 주었다.
널리 독감을 진단에 사용되는 여러 가지 방법이 있습니다, 이들은 빠른 immunoassays 직접 형광 항원 검사 (DFA) 및 바이러스 성 문화 방법이 포함되어 있습니다. 다른 두 방법은 노동 집약적 인 9 소비 시간이있는 동안 급속한 immunoassays은 극적으로, 감도 5-8가 부족합니다. 분자 테스트는 짧은 턴 - 주위에 시간, 높은 sensit 등의 여러 장점을 제공합니다ivity, 높은 특이성. 여러 상업 기관은 전염병에 대한 빠른 분자 테스트 (또한 핵산 검사 또는 NATs이라고도 함)으로 작업되었으며, 몇은 파이프 라인에서 인플루엔자 assays 있습니다. 그러나 대부분은 오프 칩 샘플 준비가 필요합니다. 분자 검사 검정 카트리지 나 모듈에 샘플 준비를 통합 면제 임상 실험실 개선 개정 (CLIA)의 없음.
랩 - 온 - 어 - 칩 기술은 포인트의 케어 테스트 장치의 개발에 중요한 역할을한다. 1993 10 첫 번째 PCR 칩의 도입 후, 많은 노력 핵산 테스트 칩을 개발에 투입되었습니다. 그러나, 이들의 몇은 하류 증폭과 통합 원유 샘플 준비되어 있습니다.
우리는 이전에 플라스틱 마이크로 칩 11으로 견고한 위상 추출 컬럼 (SPE)의 소형화을 입증하고 개발 한연속 흐름 PCR 칩 12 ment 및 최적화. 여기, 우리는 임상 진단을위한 단일 칩에 RT와 PCR 단계로 SPE를 통합하고 환자 nasopharyngeal (NP) 면봉과 aspirates에서 핵산을 증폭하기위한 능력을 평가하는 이전 작업을 확장합니다.
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Protocol
1. 칩 제조 12
- Zeonex 690R 알약에서 두 액자 만들기 : 5 분에 198 ° C에서 가열 언론에 금속 플레이트, 예열의 중심에 균일하게 8~9g Zeonex 알약을 배포 한 다음 다른 5 분에 2,500 PSI로 천천히 압력을 적용 할 수 있습니다. 이 단계를 완료하려면, 우리는 카버 핫 프레스를 사용했습니다.
- 에폭시 몰드와 상패의 마이크로 유체 채널을 양각. 금형 제조에 대한 자세한 내용은 다른 곳에서 12 일 (그림 2B의 채널 디자인) 설명되어 있습니다 : 에폭시 몰드에 한 플라크를 넣어 한 후 157에있는 온수 보도에 앞서 열을 가하다 그 ° 10 분에 C와 다른 10 분 동안 천천히 1,000 PSI에 압력을 적용 . 손으로 금형에서 플라크를 제거하거나 아래로 냉각하기 전에 집게를 사용합니다. (참고 :이 단계에서 열 장갑을 착용하십시오.)
- 입구, 폐기물 포트, 그리고 마이크로 유체 채널의 출구에서 양각 칩에 구멍을 뚫는다. 우리는 1.25 mm의 diam를 사용세 구멍을 만들기 위해 드릴 비트를 eter.
- 본드 다른 플라크 (상단)과 양각 칩은 :; 또 다른 350 PSI에 한 다음 Enter 키를 누릅니다 10 분 동안 131 ° C에서 가열 언론에 공기 건조하고 예열을하고 IPA, RNAse 거리에 있으며 순서에 탈 이온수로 칩을 씻으십시오 10 분.
- 입구, 폐기물 및 별도 JB 용접 에폭시를 사용하여 콘센트 포트에 Nanoports를 첨부, 제조업체의 지시 사항에 따라 15-24 시간에 대한 치료.
- 100 μl nuclease 무료 물 다음에 50 μl RNAse 멀리있는 SPE 채널을 씻어.
- 접목 솔루션 (3 % w / v를 benzophenone과 메틸 메타 크릴 레이트) 4 μl와 SPE 채널을로드 한 다음 365 나노 미터 UV 파장과 2,000 MJ / cm 2 이하 UV 오븐에 10 분 동안 잠복기로 메타 크릴 레이트를 crosslink. 진공과 잔류 접목 솔루션을 제거합니다. 우리는 벽 진공을 사용했습니다. 최상의 결과를 얻으려면 신선한 솔루션을 사용해야합니다. 그것은 일반적으로 수용하지만,를 저장할최대 일주일 4 ° C에서 준비한 솔루션입니다.
- 16 % 에틸렌 dimethacrylate, 24% 부틸 메타 크릴 레이트, 42 % 1-dodecanol, 18 %의 cyclohexanol, 1 % 2 - 디메틸 아미노 -4 - (메틸 phenylamino) 페놀을 추가 SPE 열 솔루션을 (모든 V / V %) 확인 사진 기자로.
- SPE 열 솔루션 (1:1 혼합물을하는)와 같은 실리카 마이크로 솔루션의 동일한 볼륨을 가지고, 완전히 ° C 하룻밤 진공 오븐에 70에서 건조. 폐쇄 뚜껑과 함께 튜브에 활용하여 펠릿을 해봐. 건조 실리카 microsphere 튜브와 혼합 할 소용돌이에 SPE 열 솔루션을 추가합니다.
- 동일한 채널에 SPE 솔루션 4 μl를로드 한 다음 2.5 분 동안 UV 조사하여 crosslink. 그런 다음 위에 칩을 뒤집어 다른 2.5 분에 비추다. polymerized의 SPE 항목은 불투명 한 흰색 고체해야합니다.
- 초과 반응물을 멀리 씻어하기 위해 100 % 메탄올 500 μl와 채널을 씻으십시오. 이 페인트는 내부 폴리머 PO를 제거주위 조건에서 건조 할 때 rogenic 용매는이를 SPE 칼럼의 열린 기공 구조를 만드는 두 가지 방법이 있습니다.
- 열 전도성 테이프 칩의 맨 아래에 두 개의 박막 히터를 부착합니다. 히터의 측면은 변성 및 (그림 1 참조) 별도로 어닐링을위한 다양한 채널의 가장자리를 정렬해야합니다.
- 죽은 통해 칩에 장소 다섯 열전쌍은 각 칩의 열린 쪽 채널을 (그림 2B 참조) 종료했습니다. 열전대는 언론 운동을 통해이 채널에있어. 테이프는 더 열전대의 위치를 수정하는 데 사용되었다.
2. 고체 단계 추출 방법
- DEPC - 처리 및 autoclaved 물 (deionized 또는 Millipore-필터링)을 70 % 에탄올의 96 μl를 준비합니다.
- 25X RNA의 추가 4 μl 한 관에 70 % 에탄올의 96 μl를 확보하고, 별도의 관 100 % 에탄올과 같은 혼합물을 중복.
- 300 준비다음을 혼합하여 채널 버퍼의 μl : 6 M 구아니딘의 thiocyanate (GuSCN), 2 - 프로 파놀의 150 μl, nuclease 무료 물의 63 μl, 그리고 보안 25X RNA 12 μl의 75 μl.
- 6 M GuSCN, 2 - 프로 파놀 200 μl 및 보안 12 μl 25X RNA의 100 μl : 혼합하여 용해 버퍼의 312 μl를 준비합니다.
- RNA 보안을 활성화하려면 10-20 분을위한 60 ° C에서 70 %의 에탄올을 가열, 100 % 에탄올, 채널 버퍼와 용해 버퍼.
- 마이크로 유체 채널을 평형하려면, 0.8 ML / 시간의 유량에서 SPE 채널을 통해 채널 버퍼를 실행합니다.
- 물 욕조에서 37 ° C에서 VTM에 테스트 샘플을 빠른 해동하고, 가능한 한 빨리이 해동 될 때 물통에서 즉시 샘플을 제거합니다.
- 10 분에 13,000 rpm으로 샘플을 원심 분리기 및 용해 버퍼 300 μl로 표면에 뜨는 100 μl를 전송합니다. 1 μg / μl 캐리어 RNA의 6 μl를 추가하여 혼합을 완료합니다.
- 혼합 할 수 소용돌이, 그리고에 대한 스핀 후5 초는 Luer - 무사히 다녀 오게 한 CC의 주사기로 전체 lysate를로드합니다.
- 0.8의 유량에서 SPE 채널을 통해 lysate를 실행 ML / 시간.
- 1 ML / 시간 100 μl of100 %의 에탄올에 이어 70 %의 에탄올 100 μl와 SPE 채널을 씻으십시오. (내보냈되지 않습니다 주사기 팁에 50 μl 죽은 볼륨이 있으므로 실제로는 50 μl의 채널을 통해 진행됩니다.)
- 0.5 ML 마크의 빈 주사기를 위치 1에서 건조 할 채널을 통해 공기를 밀어 ML / 시간.주세요
- 0.5에서 바인딩 된 핵산을 elute ML / 시간 및 폐기물 포트에서 nanoport에서 13.5 μl를 수집하는 채널을 통해 nuclease - 무료 물 67.5 μl를 실행합니다. (유체 손실이 주사기 팁과 SPE 채널에 54 μl 죽은 볼륨 때문입니다.)
3. RT-PCR
- Qiagen OneStep RT-PCR 키트의 시약을 사용하여 공기 건조 단계 (2.12) 동안 RT-PCR 마스터 믹스의 36.5 μl를 준비합니다.
- RT-PC를로드R은 쓰레기 포트에서 nanoport의 시약 및 RNA와 혼합 다음 50 μl RT-PCR 반응을 얻을 수 : nuclease 무료 물, 4 μl RT-PCR 효소 혼합, 10 μl Q 솔루션, 10 μl1X 하나에 13.5 μl 용출 RNA를 단계 버퍼, 2 μl 25 MM MgCl 2, 1 μl 50 앞으로 μM 프라이머 5'-GAC 미쳤 (다고하더라도) TCC TGT CAC CTC TGA C-3 ', 1 μl 50 μM 역 프라이머 5'-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3 ', 2 μl dNTP, 0.75 μl 1.0 % w / V BSA, 0.73 μl PEG8000과 5.02 μl nuclease 무료 물.
- 부드러운 진공으로 RT 채널 (우리가 벽 진공을 사용)에 RT-PCR 혼합물을로드하고 폐쇄 피팅으로 Nanoport을 봉쇄.
- 히터 1-35 V를 적용 할 수 있습니다. 히터 1 50 ° C.에 equilibrates 후 30 분 동안 RT 채널에 시약 보관 95에서 히터 하나 equilibrates 후 15 분 ° C.에 대한 RT 채널에 시약 보관
- 히터 1과 히터 2-50 V 27 V를 적용, 60 & 드에 3 분 정도 또는 히터 1 equilibrates 때까지 기다리g, C 및 히터 2 95에 equilibrates ° C.
- 0.5 μl / 분의 PCR 채널에 시약을 밀어 넣습니다. 시약은 굴곡 채널을 통해 유동하는 것은 약 20 분 정도 소요됩니다.
- 샘플 굴곡 채널의 끝 부분에 낸다으로 적절하게 크기 pipettor 및 팁을 사용하여 전원 콘센트에서 PCR 제품을 수집합니다.
4. PCR 제품 검색
- 우리는 제품을 감지 할 수있는 애질런트 높은 감도 DNA 검사를 사용합니다. 이 테스트는 냉장고에서 테스트하기 전에 30 분 애질런트 높은 감도 DNA 키트를 꺼내 실행하십시오.
- Bioanalyzer 전원을 켜고 2100 전문가 소프트웨어를 엽니 다.
- 테스트에 PCR 제품의 1 μl를로드하고 애질런트 프로토콜 (따라 http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent의 %의 20Manual.pdf을 ).
- 분석하고 데이터를 기록합니다.
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Representative Results
전형적인 결과는 인플루엔자에 감염된 nasopharyngeal 세척 표본에 대한 그림 3에 표시됩니다. 각 환자 표본에서 인플루엔자 바이러스의 서로 다른 양의로 인해, PCR 제품의 최종 농도는 달라질 수 있습니다. 좋은 결과는 낮은 노이즈, 두 명확 래더 봉우리 (35 10,380 BP)과 긍정적 인 샘플에 대한 설계 제품 사이즈 (107 BP)에서 하나의 제품 피크가 있어야합니다. 제품 피크는 이론적으로 부정적인 컨트롤 결석해야하지만, 우리는 샘플에 프라이머 - dimers 형성에서 독감 별 궤적 근처 가짜 PCR의 봉우리를 관찰 했어요. 여러 제품 봉우리는 시험의 잠재적 인 오염을 반영합니다. 이 경우 샘플의 또 다른 나누어지는이 필적한다. 젤 전기 영동은 시험 결과 13 자세한 확인을 위해 사용할 수 있습니다.
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1 그림. 칩의 구조도 다운 맨을 단순화. 빨간색 윤곽선은 칩의 하단에 연락처 히터의 위치를 보여줍니다.
그림 2. 마이크로 유체 분석의 흐름 13. 첨부 된 박막 히터와 두 개의 배럴 주사기 펌프 두 개의 마이크로 칩의 () 이미지. 유리 주사기는 시약 및 샘플을로드하는 유연한 튜브 각 칩에 연결되었습니다. 세 포트는 SPE 채널 및 폐기물 포트 및 PCR 채널의 콘센트 유입구에 접착 된 (B) 채널 디자인 세 부분으로 :. 샘플 준비 (SPE), RT 챔버와 지속적인 흐름 PCR 채널. 두 고정 저항 히터는을 통해 부착 칩의 맨 아래로 열 테이프. 채널 사이의 유체 흐름이 층류이었고, 유체 저항의 변화는 밸브없는 작업에 대해 허용됩니다. 깊이 SPE와 RT 채널 500 μm이며, PCR 채널은 100 μm 깊이입니다. 폭은 SPE 열 500 μm, RT 챔버에 1mm 있으며, 지속적인 흐름 PCR 채널의 폭이 좁은 섹션에 200-400 μm에서 다릅니다. 이 칩은 길이 70mm, 폭 25mm, 높이 1.4 mm입니다. (주) 마이크로 유체 분석 프로세스 흐름. nasopharyngeal 샘플 칩에 적용 용해 버퍼와 혼합되어 칩은 실행되고 PCR 제품은 상용 모세관 전기 영동 칩을 사용하여 읽을 수 있습니다. 13 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 3. 칩 도착지 진단 결과에. PCR 제품 피크가 107 BP의 크기에서 중간 피크입니다. 왼쪽 (35 BP)과 오른쪽 봉우리 (10,380 BP)는 제어 래더 봉우리입니다. 각 피크의 제품의 농도는 곡선 아래 영역입니다. 이러한 tabulated 있습니다. 모든 소음 피크가없는 (A) 긍정적 인 결과를 가져올 수도 있습니다. (B) 42 BP의 프라이머 - dimers과 긍정적 인 결과가. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
진단 방법은 높은 특이성과 낮은 검출 한계가있는 환자 표본에서 인플루엔자 RNA를 증폭 할 수있는 통합 마이크로 플라스틱 칩의 능력을 보여 여기에 제시된 13 우리는 케어 테스트의 잠재적 지점이 칩을 설계 :. (A) 온도와 유체 컨트롤이 간단했다, (b)는 칩은 낮은 비용과 사출 성형을 사용하여 높은 처리량 제조에 적합, 그리고 (c) 칩은 따라서 표본 교차 오염의 우려를 줄이고, 종이 및 한 번에 사용하기위한 것입니다.
3 시간 우리의 현재 온 - 칩 런타임 있지만, 추출 플랫폼은 프로세스 최적화를위한 충분한 공간이 포함되어 있습니다. 예를 들어, 오른쪽 용출 전에 세척 및 건조 시간은 유량 증가 및 세탁 볼륨을 줄일 수의 조합에 의해 감소 될 수 있습니다. 또한, 비용은 칩 제조 공정을 능률화하고 값 비싼 또는 성가신 아름다운 요정을 대체하여 트리밍 할 수 있습니다이러한 일회용 주사기 주입 펌프와 고체 위상 추출 열 기하학과 다공성을 열기 작은 배터리 팩과 같은 대안과 주사기 펌프, 전원 공급 장치 등 pherals는 펌프 요구 사항을 크게 절감 할 수 있도록합니다. 또한, 한 번 칩 디자인은 대량 생산을위한 표준화되어, 장치 개발에 사용 된 열전대의 많은은 멸망하게 될 것이다.
더 있으므로 다른 요인보다, 우리의 온 칩 인플루엔자 검출 모듈의 견고성 좋은 온도 제어 및 적절한 샘플을 가져다 모두에 따라 달라집니다. 약간 원하는 온칩 온도뿐만 아니라 인플루엔자 표본의 의도 여러 냉동 해동 사이클에서 오프셋을 모두 최종 PCR 수율을 감소 수 있습니다. 이외에도 이러한 요소에서 다른 환자 표본에서의 온 - 칩 PCR 결과 13 변화도에 귀속 될 수 있습니다 : 바이러스 부하의 변동, 인간 세포와 bloo을 오염 서로 다른 수준의D, 핵산 추출, 14,15 및 표본 및 테스트 시약 또는 장치 자체 16 사이 예상치 못한 화학 및 / 또는 물리적 반응 후 PCR 억제제의 존재.
요약에서, 우리는 인플루엔자 의료 - 관련 nasopharyngeal 샘플에서 바이러스 RNA를 증폭하기위한 마이크로 유체 칩의 가능성을 보여주고 있습니다. 이 칩은 다른 DNA 또는 RNA 대상에 적용 할 수있는 가능성이 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 재정 이익을 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 건강의 국립 연구소 (NIH) 보조금 R01 EB008268에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G | |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G | |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML | |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml | |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 | |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 | |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML | |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 | |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 | |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 | |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 | |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 | |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 | |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 | |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 | |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V | |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML | |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 | |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 | |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 | |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A | |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 | |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
References
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- WHO | World now at the start of 2009 influenza pandemic. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/ (2009).
- WHO | Pandemic (H1N1) 2009 - update 112. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/csr/don/2010_08_06/en/ (2009).
- Wenzel, J. J., et al. Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).
- Chan, K. H., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1. Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).
- Ginocchio, C. C., et al. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. Journal of. 45, 191-195 (2009).
- Aeron, C. H., et al. Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses. Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).
- Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting. Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).
- Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. Transducer'93, seventh international conference on solid state sensors and actuators. , 924-926 (1993).
- Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics. Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).
- Cao, Q., Kim, M. -C., Klapperich, C. Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments. Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).
- Cao, Q., et al. Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens. PLoS ONE. 7, e33176 (2012).
- Rådström, P. Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit. J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).
- Andreasen, D., et al. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50, S6-S9 (2010).
