Summary
Интегрированный чип микрофлюидных термопластичных была разработана для использования в качестве молекулярной диагностики. Чип выполняет выделения нуклеиновых кислот, обратной транскриптазы, и ПЦР. Методы изготовления и запуска чипа описаны.
Abstract
Быстрая и эффективная диагностика играет важную роль в борьбе с инфекционными заболеваниями, позволяя пациенту эффективное управление и лечения. Здесь мы представляем интегрированное микрофлюидных термопластичных чип с возможностью усиливать вируса гриппа А в больной носоглотки (NP) тампоны и аспирации. При загрузке образца пациента, микрофлюидных устройство последовательно выполняет на кристалле лизиса клеток, РНК очистки и концентрирования шаги в твердофазной экстракции (SPE), обратной транскрипции (RT) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) в RT-PCR камер, соответственно. Конечные точки обнаружение осуществляется с помощью внешней памяти Bioanalyzer (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния). Для периферийных устройств, мы использовали один насос шприца ездить реагентов и образцов, в то время как два тонких нагреватели фильма были использованы в качестве источников тепла для РТ и ПЦР-камер. Чип предназначен для однослойных и подходит для высоких производственных пропускной способности для уменьшения fabricatiпо времени и стоимости. Микрофлюидный чип обеспечивает платформу для анализа широкого спектра вирусов и бактерий, ограничивается только изменениями в дизайне реагента, необходимого для обнаружения новых патогенов интерес.
Introduction
Миллионы смертей были зарегистрированы в течение трех пандемий гриппа 20-го века 1. Кроме того, самые последние пандемии гриппа была объявлена Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) 2 в 2009 году, и по состоянию на 1 августа 2010 года, 18 449 смертей были зарегистрированы ВОЗ 3. Эта пандемия вновь продемонстрировали высокое бремя инфекционных заболеваний, а также необходимость быстрого и точного обнаружения гриппа для быстрого подтверждения заболевания, соответствующего реагирования общественного здравоохранения и эффективное лечение 4.
Есть несколько методов, широко используется для диагностики гриппа, к ним относятся быстрое иммунологических, прямые флуоресцентные тест на антиген (DFA) и вирусные методы культуры. Быстрое иммунологических резко не хватает чувствительности 5-8, в то время как два других метода являются трудоемкими и отнимает много времени 9. Молекулярные тесты предлагают несколько преимуществ, включая короткое время оборота, высокой СЕНСИТivity, и более высокую специфичность. Несколько коммерческих структур работают над быстрых молекулярных тестов (также называемые нуклеиновые кислоты или тестов NAT) для инфекционных заболеваний, а некоторые из них имеют гриппа анализы в своих трубопроводах. Однако большинство из них требуют вне чипа подготовки образца. Ни один из клинической лаборатории Улучшение Поправки (CLIA) отказался молекулярные тесты включают образцы препарата в картридже анализа или модуля.
Лаборатория-на-чипе технология играет важную роль в развитии точка-санитарной помощи устройства тестирования. После введения первого чипа ПЦР в 1993 10, многочисленные усилия были вложены в разработку чипов нуклеиновых кислот тест. Тем не менее, лишь немногие из них имеют интегрированный сырой подготовки образца с выходным усилением.
Ранее мы показали миниатюризации твердых колонке экстракции (SPE) в пластиковый микрофлюидных чипов 11 и развиватьсяния и оптимизации непрерывного потока ПЦР чип 12. Здесь мы расширим предыдущую работу по интеграции SPE с RT и ПЦР шагов в одном чипе для клинической диагностики и продемонстрировать свою способность усиливать нуклеиновых кислот от пациента носоглотки (NP) тампоны и аспирации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Чип изготовление 12
- Сделайте две мемориальные доски из Zeonex гранулы 690R: распространять 8-9 граммов Zeonex гранулы равномерно в центре металлической пластины, разогрейте на нагретом прессе при 198 ° C в течение 5 мин, а затем применить давление медленно до 2500 фунтов на квадратный дюйм в течение еще 5 мин. Чтобы выполнить этот шаг, мы использовали пресс Carver горячей.
- Барельеф микрофлюидных канала в мемориальная доска с эпоксидной плесени. Подробная информация о форме изготовления изложены в другом месте 12 (канал дизайна в рис. 2б): положить одну доску на эпоксидной плесени; разогрейте их на нагретом прессе при 157 ° C в течение 10 мин, а затем применить давление медленно до 1000 фунтов на квадратный дюйм в течение еще 10 мин . Удалить налет из формы вручную или с помощью щипцов, прежде чем она остынет. (Обратите внимание: износ тепловых перчатки во время этого шага.)
- Просверлите отверстия в тиснением чип на входе, отходы порт и выходе из микрофлюидных каналов. Мы использовали 1,25 мм диаметрЭтер сверло, чтобы сделать три отверстия.
- Бонд тиснением чип с другой доски (сверху): Вымойте чипы с ПНД, РНКазы в гостях и деионизированной воды в определенной последовательности; Воздух сухой и разогрейте их на нагретом прессе при 131 ° С в течение 10 мин, а затем нажмите на 350 фунтов на квадратный дюйм для другого 10 мин.
- Прикрепить Nanoports на входе, отходов и выходное отверстия отдельно, используя JB Weld эпоксидная; вылечить в течение 15 до 24 часов в соответствии с инструкциями производителя.
- Промойте SPE канала с 50 мкл РНКазы в гостях, а затем с 100 мкл нуклеазы свободной воды.
- Загрузите SPE канала с 4 мкл прививки решение (метилметакрилат с 3% м / бензофенон), а затем сшивание метакрилата путем инкубации в течение 10 мин в духовке при УФ длиной волны 365 нм УФ и 2000 мДж / см 2. Удалить остаточные прививки решение с вакуумом. Мы использовали стены вакууме. Для достижения наилучших результатов, свежий раствор должен быть использован. Как правило, приемлемы, однако, для храненияПриготовленный раствор при 4 ° С в течение одной недели.
- Сделать SPE решение колонке (все о /%): 16% этилена диметакрилата, 24% бутилметакрилат, 42% 1-додеканол, 18% циклогексанола, и добавить 1% 2-диметиламино-4-(метил-фениламино)-фенол как фото-инициатор.
- Возьмите тот же объем раствора диоксида кремния микросфер, как SPE решения колонки (чтобы смесь 1:1), и полностью высушить при температуре 70 ° С в течение ночи в вакуумной печи. Разбейте гранул, нажав на трубе с закрытой крышкой. Добавить SPE решение колонку в высушенном трубки микросфер диоксида кремния и вихрь перемешать.
- Загрузите 4 мкл SPE решение в тот же канал, а затем сшивание ее УФ-облучения в течение 2,5 мин. Затем перевернуть на чипе и облучать еще 2,5 мин. Колонка полимеризованный SPE должна быть непрозрачной белого твердого вещества.
- Промойте канал с 500 мкл 100% метанола в смыть избыток реагентов. Это мыть также удаляет внутри полимера роrogenic растворителей, тем самым создавая открытую структуру пор SPE колонки при сушке в условиях окружающей среды.
- Прикрепите две тонкопленочных нагревателей в нижней части чипа с теплопроводной ленты. Стороны нагреватели должны быть приведены в соответствие с краю широкие каналы для денатурации и отжига отдельно (см. Рисунок 1).
- Место пять термопар в чип через мертвых закончилась открытым каналам стороне каждого чипа (см. рисунок 2б). Термопары остаться в этих каналах в пресс-форме. Лента была использована для дальнейшего исправить расположение термопар.
2. Твердые метод экстракции фазы
- Подготовьте 96 мкл 70% этанола с DEPC обращению и автоклавировать воды (деионизированной или Millipore фильтра).
- Добавить 4 мкл 25X РНК Закрепить до 96 мкл 70% этанола в одну трубку, и дублировать ту же смесь со 100% этанола в отдельной трубке.
- Подготовьте 300мкл буфера канала путем смешивания следующее: 75 мкл 6 М гуанидина тиоцианата (GuSCN), 150 мкл 2-пропанола, 63 мкл воды нуклеазы свободной, и 12 мкл 25X РНК-Secure.
- Подготовка 312 мкл буфера для лизиса путем смешивания: 100 мкл 6 М GuSCN, 200 мкл 2-пропанола и 12 мкл 25X РНК-Secure.
- Нагреть 70% этанола, 100% этанола, буфер канала и лизис буфера при 60 ° С в течение 10-20 мин для активации РНК-Secure.
- Чтобы уравновесить микрофлюидных каналов, запуск канала буфера через SPE канал со скоростью потока 0,8 мл / час.
- Быстрый таять образца в VTM при 37 ° С на водяной бане, и удалить образец непосредственно из водяной бани, как только оно растаяло.
- Центрифуга образца при 13000 оборотов в минуту в течение 10 мин, и перенести 100 мкл супернатанта в 300 мкл буфера для лизиса. Завершить смеси, добавляя 6 мкл 1 мкг / мкл РНК-носителя.
- Vortex перемешать, и после спина для5 сек, загрузить весь лизат в Луер-лок 1 мл шприца.
- Выполнить лизата через SPE канал со скоростью потока 0,8 мл / час.
- Вымойте SPE канала с 100 мкл 70% этанола, а затем 100 мкл of100% этанола на 1 мл / час. (Существует 50 мкл мертвый объем в шприце совет, который не будет выталкивается, поэтому на самом деле только 50 мкл проходит через канал.)
- Поместите пустой шприц на уровне 0,5 мл знак и нажмите воздух через канал, чтобы высушить его на 1 мл / час.
- Выполнить 67,5 мкл нуклеазы без воды через канал для элюирования связанного нуклеиновых кислот на уровне 0,5 мл / ч, и собирают 13,5 мкл из nanoport на отходы порт. (Потери жидкости связано с 54 мкл мертвого объема на кончике шприца и канал SPE).
3. RT-PCR
- Подготовка 36,5 мкл RT-PCR Mix Master во время сухой воздух шаг (2,12) использование реагентов в Qiagen OneStep RT-PCR наборы.
- Загрузите RT-PCR реагента в nanoport на отходы порт, и смешайте с РНК, чтобы получить следующие 50 мкл RT-PCR реакции: 13,5 мкл Элюированную РНК в нуклеазы свободной воды, 4 мкл ОТ-ПЦР фермент смесь, 10 мкл раствора Q, 10 μl1X один шаг буфера, 2 мкл 25 мМ MgCl 2, 1 мкл 50 мкМ прямой праймер 5'-GAC CRA ТСС TGT CAC СТС TGA C-3 ', 1 мкл 50 мкМ обратный праймер 5'-AGG GCA TTY TGG ACA АБК CGT CTA-3 , 2 мкл дНТФ, 0,75 мкл 1,0% вес / объем BSA, 0,73 мкл PEG8000 и 5,02 мкл нуклеазы свободной воды.
- Загрузите RT-PCR смеси в канал RT нежным вакуума (мы использовали стену вакуума) и запечатать Nanoport с закрытой арматуры.
- Применить 35 V для нагревателя 1. Хранить реагенты в РТ канала в течение 30 минут после того, как нагреватель 1 уравновешивается при 50 ° C. Хранить реагенты в РТ канала в течение 15 минут после того, как нагреватель 1 уравновешивается при 95 ° C.
- Применить 27 V для нагревателя 1 и 50 В для нагревателя 2, подождать около трех минут или до нагревателя 1 уравновешивается при 60 и де-г, C и нагреватель 2 уравновешивается при 95 ° C.
- Нажмите реагентов в канал ПЦР на 0,5 мкл / мин. Это должно занять около 20 минут для реагентов течь через змеевик канала.
- В качестве образца делает его до конца серпантина канала, собирать продукты ПЦР на выходе использованием соответствующего размера пипетки и чаевых.
4. ПЦР-продукты Detection
- Мы используем Agilent Высокая чувствительность теста ДНК для обнаружения продуктов. Для выполнения этого теста вынуть Agilent Высокая чувствительность Kit ДНК из холодильника за 30 минут до тестирования.
- Включите Bioanalyzer и открыть в 2100 Эксперт программного обеспечения.
- Загрузите 1 мкл ПЦР-продуктов в тестировании и последующей Agilent протокол ( http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent% 20Manual.pdf ).
- Анализ и записи данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Типичный результат показан на рисунке 3 для гриппа инфицированных носоглотки образца стирки. В связи с различным количеством вируса гриппа в каждый образец пациента, конечная концентрация продукта ПЦР будет меняться. Хороший результат должен иметь низкий уровень шума, два пика лестницы (35 и 10380 б.п.) и один пик продукта на продукт предназначен размере (107 б.п.) для положительных образцов. В то время как продукт пик теоретически должна отсутствовать отрицательные контроли, мы сделали наблюдать ложные пики ПЦР рядом с гриппом конкретного локуса от праймер-димеров формированию в некоторых образцах. Несколько пиков продукт отражает потенциальное загрязнение теста. Если это происходит, другой аликвоты образец должен быть повторно. Гель-электрофорез, могут быть использованы для дальнейшей проверки результатов испытаний 13.
В "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50325/50325fig1highres.jpg "/>
Рисунок 1. Упрощенная сверху вниз чип схеме. Красные контуры показывают размещение контакт нагревателей в нижней части чипа.
Рисунок 2. Микрофлюидных потока анализа 13. (А) Изображение двух микрофлюидных чипов с прикрепленными тонкие нагреватели фильм и два ствола шприцевой насос. Стеклянные шприцы были связаны друг с чип с гибкой трубкой для загрузки реагентов и образцов. Три порта были приклеены на входах SPE канала и отходов порта, и на выходе из канала ПЦР (б) Канал дизайн с трех разделов:. Пробоподготовки (SPE), RT камеры и непрерывный поток ПЦР канала. Две неподвижные нагреватели сопротивления, подключенные через термопленку в нижней части чипа. Течение жидкости между каналами был ламинарным, а также изменения в жидкости сопротивления позволили клапана меньше работы. Глубиной 500 мкм для SPE и РТ каналы и канал ПЦР составляет 100 мкм глубоко. Шириной не более 500 мкм для SPE колонка, 1 мм для RT камеру, и варьируются от 200 до 400 мкм для широких и узких участках непрерывного канала потока ПЦР. Чип составляет 70 мм в длину, 25 мм в ширину и 1,4 мм в высоту. (С) Микрофлюидных анализ технологического процесса. Носоглотки образца смешивали с буфером для лизиса, примененная к чип, чип бежать, и ПЦР-продуктов можно прочитать с помощью коммерческих капиллярного электрофореза чип 13. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
п "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50325/50325fig3highres.jpg "/>
Рисунок 3. На чипе конечной точке диагностического результата. Пик ПЦР продукт среднего пика в размере 107 базисных пунктов. Левая (35 б.п.) и правого пиков (10380 ВР) пики управления лестнице. Концентрация продуктов каждый пик площадь под кривой. Они сведены в таблицу. (А) положительный результат без шума пик. (Б) положительный результат с грунтовкой-димеров на 42 базисных пунктов. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод диагностики, представленные здесь продемонстрировали способность интегрированной микрофлюидных пластиковых чипов для усиления гриппа РНК из образцов пациентов с высокой специфичностью и низкий предел обнаружения 13 Мы разработали этот чип для потенциальной точкой ухода тестирования.: (А) температуры и жидкостный управления были упрощены, (б) чип является низкая стоимость и подходят для высокой пропускной способности, используя изготовления литьем под давлением, и (с) чип является одноразовым и предназначен для одноразового использования, тем самым уменьшая обеспокоенность образца перекрестного загрязнения.
Хотя наши текущие на-чипе время работы 3 часа, наша добыча платформа содержит широкие возможности для оптимизации процесса. Например, стирки и сушки раз прямо перед элюирования может быть снижен на сочетание увеличения скорости потока и уменьшения объемов стирки. Кроме того, стоимость может быть урезан за счет оптимизации процесса изготовления чипов и замены дорогих или громоздких периpherals, таких как шприцевые насосы, блок питания, с альтернативы, как одноразовые шприцы и инфузионные насосы небольших аккумуляторов Открытие стереометрии экстракции колонки и пористость позволит значительному сокращению насос требованиям. Кроме того, после чипа дизайн для стандартизированных высоким объемом производства, многие из термопары, используемые в разработке устройств будут устранены.
Больше, чем другие факторы, устойчивость наших встроенный модуль обнаружения гриппа зависит как от хорошего контроля температуры и соответствующие сдачи образца. Незначительное смещение от желаемого на-чипе температуры, а также непреднамеренное нескольких циклов замораживания-оттаивания на грипп образцов, может как уменьшить конечный выход ПЦР. Помимо этих факторов, изменения в нашем он-чип результатов ПЦР-13 из различных образцов пациента также может быть связано с: Изменение вирусной нагрузки, разные уровни загрязнения клетками человека и BlooD; присутствие ингибиторов ПЦР после выделения нуклеиновых кислот, 14,15 и неожиданные химические и / или физические реакции между образцы и реагенты или само устройство 16.
Таким образом, мы продемонстрировали возможности нашей микрофлюидных чипов для амплификации РНК вируса гриппа А в медицинской значимых носоглотки образцов. Чип имеет потенциал, чтобы быть применен к другим ДНК или РНК целей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявили, нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Национальным институтом здоровья (NIH), грант R01 EB008268.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G | |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G | |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML | |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml | |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 | |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 | |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML | |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 | |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 | |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 | |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 | |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 | |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 | |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 | |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 | |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V | |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML | |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 | |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 | |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 | |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A | |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 | |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
References
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- WHO | World now at the start of 2009 influenza pandemic. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/ (2009).
- WHO | Pandemic (H1N1) 2009 - update 112. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/csr/don/2010_08_06/en/ (2009).
- Wenzel, J. J., et al. Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).
- Chan, K. H., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1. Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).
- Ginocchio, C. C., et al. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. Journal of. 45, 191-195 (2009).
- Aeron, C. H., et al. Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses. Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).
- Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting. Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).
- Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. Transducer'93, seventh international conference on solid state sensors and actuators. , 924-926 (1993).
- Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics. Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).
- Cao, Q., Kim, M. -C., Klapperich, C. Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments. Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).
- Cao, Q., et al. Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens. PLoS ONE. 7, e33176 (2012).
- Rådström, P. Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit. J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).
- Andreasen, D., et al. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50, S6-S9 (2010).
