Summary
En integrerad mikroflödessystem termoplast chip har utvecklats för att användas som en molekylär diagnostik. Chipet utför nukleinsyra extraktion, omvänt transkriptas, och PCR. Metoder för att tillverka och driva chipet beskrivs.
Abstract
Snabba och effektiva diagnostik spelar en viktig roll i att kontrollera infektionssjukdomar genom att en effektiv behandling av patienten och behandling. Här presenterar vi ett integrerat mikroflödessystem termoplast chip med möjlighet att förstärka influensa A-virus i patientens nasofaryngeala (NP) kompresser och aspirat. Vid laddning av patientprovet, uppbär mikrofluidanordningen sekventiellt ut på chip cellys, RNA-rening och koncentrering inom fastfasextraktion (SPE), omvänd transkription (RT) och polymeraskedjereaktion (PCR) i RT-PCR-kammare, respektive. Slutpunkten detektering utförs med användning av en off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). För kringutrustning, använde vi en sprutpump att driva reagens och prover, medan två tunna film värmare användes som värmekällor för RT och PCR kamrarna. Chipet är utformad för att vara enda skikt och är lämplig för hög genomströmning tillverkning att minska fabricatii tid och kostnad. Den mikroflödessystem chip ger en plattform för att analysera en mängd olika virus och bakterier, begränsas endast av förändringar i reagens utformning som krävs för att upptäcka nya patogener av intresse.
Introduction
Miljontals dödsfall har rapporterats under de tre influensapandemier av 20-talet 1. Dessutom var den senaste influensapandemin som deklarerats av Världshälsoorganisationen (WHO) 2 i 2009, och från och med 1 augusti, 2010, var 18.449 dödsfall rapporterats av WHO 3. Denna pandemi visade återigen den höga bördan av infektionssjukdomar, och behovet av en snabb och säker detektion av influensa att möjliggöra snabb sjukdom bekräftelse lämplig folkhälsoåtgärder och effektiv behandling 4.
Det finns flera metoder ofta används för att diagnostisera influensa, dessa inkluderar snabba immunoanalyser, direkt fluorescerande antigen test (DFA) och viral odlingsmetoder. Snabba immunanalyser saknar dramatiskt känsligheten 5-8, medan de andra två metoderna arbetsintensiv och tidskrävande 9. Molekylära tester erbjuder flera fördelar inklusive en kort turn-around tid, hög sensitivity och högre specificitet. Flera kommersiella aktörer har arbetat för snabba molekylära tester (även kallad nukleinsyra tester eller NAT) för smittsamma sjukdomar och flera har influensa analyser i sina rörledningar. Men de flesta av dem kräver off-chip provberedning. Ingen av de kliniska ändringar Laboratory Improvement (CLIA) avstod molekylära tester införliva provberedning i analysen kassett eller modul.
Lab-on-a-chip-teknik spelar en viktig roll i utvecklingen av point-of-care testanordningar. Efter införandet av den första PCR-chip i 1993 10, har många ansträngningar lagts på att utveckla nuklein marker stålbad. Men bara ett fåtal av dessa har inbyggd rått provberedning med nedströms förstärkning.
Vi har tidigare visat att miniatyrisering av en fast fas-extraktionskolonn (SPE) i en plast mikrofluidisk brickan 11 och utvecklaning och optimering av ett kontinuerligt flöde PCR-chip 12. Här förlänger vi tidigare arbete att integrera SPE med RT och PCR steg i ett enda chip för klinisk diagnostik och visa sin förmåga att förstärka nukleinsyror från patientens nasofaryngeala (NP) kompresser och aspirat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Chip Fabrication 12
- Gör två plaketter från Zeonex 690R pellets: dela 8-9 gram Zeonex pellets jämnt i mitten av en metallplatta, förvärma den uppvärmda pressen vid 198 ° C i 5 minuter, och sedan använda trycket långsamt till 2.500 psi för en annan 5 minuter. För att slutföra det här steget har vi använt en Carver varmpress.
- Prägla mikroflödessystem kanalen i plack med en epoxi mögel. Detaljer om formen tillverkning beskrivs på annat håll 12 (kanal design i figur 2b): sätta en plakett på epoxi mögel, förvärmning dem på den uppvärmda pressen vid 157 ° C i 10 minuter och sedan använda trycket långsamt till 1.000 psi för en annan 10 minuter . Ta bort plack från formen för hand eller med hjälp av en tång innan den har svalnat. (Obs: använd termiska handskar under detta steg.)
- Borra hål i det präglade chipet vid inloppet, avfall porten och utlopp mikroflödessystem kanalen. Vi använde en 1,25 mm diamparametern borr för att göra de tre hålen.
- Binda präglade chip med en annan plack (överst): Tvätta flisen med IPA, RNAs Away och avjoniserat vatten i sekvens, lufttorka och förvärma dem på upphettad press vid 131 ° C under 10 minuter och sedan trycka på 350 psi för en annan 10 minuter.
- Fäst Nanoports vid inloppet, avfall och utloppsportarna separat med JB Weld Epoxy, härda i 15 till 24 timmar enligt tillverkarens anvisningar.
- Skölj SPE kanalen med 50 ul RNAse Away, följde med 100 ^ nukleas fritt vatten.
- Ladda SPE kanalen med 4 pl av ymplösningen (metylmetakrylat med 3% vikt / volym bensofenon) och sedan tvärbinda metakrylat genom inkubation under 10 min i en UV-ugn under 365 nm UV-våglängd och 2.000 mj / cm 2. Avlägsna kvarvarande ympningslösningen med vakuum. Vi använde väggen vakuum. För bästa resultat bör en ny lösning användas. Det är oftast acceptabelt dock att lagra enberedd lösning vid 4 ° C under upp till en vecka.
- Gör SPE kolonn lösningen (alla volym / volym%): 16% etylendimetakrylat, 24% butylmetakrylat, 42% 1-dodekanol, 18% cyklohexanol, och tillsätt 1% 2-dimetylamino-4-(metyl-fenylamino)-fenol som fotoinitiator.
- Ta ut samma volym av kiseldioxid-mikrosfärer lösning som SPE kolonn lösningen (för att göra en 1:1 blandning), och fullständigt torka den vid 70 ° C över natten i en vakuumugn. Bryt upp pelleten genom att trycka på röret med locket stängt. Lägg SPE kolumnen lösningen i den torkade kiseldioxid mikrosfär röret och vortexa att blanda.
- Ladda 4 pl av SPE lösningen i samma kanal och därefter tvärbinda den genom UV-bestrålning under 2,5 minuter. Sedan vänder chip över och bestråla en annan 2,5 minuter. Den polymeriserade SPE-kolonn ska vara ett opakt vitt fastämne.
- Tvätta kanalen med 500 pl av 100% metanol för att skölja bort överskott reaktanter. Denna tvättning avlägsnar även inom polymer-porogenic lösningsmedel, varigenom den öppna porstrukturen hos SPE kolonn efter torkning under omgivningsförhållanden.
- Fäst två tunnfilms-värmare till botten av chipset med värmeledande tejp. Sidorna på värmarna behöver ligga i linje med kanten på de breda kanalerna för denaturering och annealing separat (se figur 1).
- Placera fem termoelement i chipet genom den döda slutade öppna sidokanalerna av varje chip (se figur 2b). Termoelementen bo i dessa kanaler via presspassning. Tejp användes för att ytterligare fastställa läget av termoelement.
2. Fastfasextraktion Metod
- Bered 96 pl 70% etanol med DEPC-behandlat och autoklaveras vatten (avjoniserat eller Millipore-filtrerade).
- Lägg 4 il 25x RNA Säkra till 96 ul 70% etanol i en tub och duplicera samma blandning med 100% etanol i ett separat rör.
- Förbered 300il kanalens buffert genom att blanda följande: 75 | il 6 M guanidintiocyanat (GuSCN), 150 pl av 2-propanol, 63 pl nukleasfritt vatten, och 12 pl 25x RNA Säkra.
- Bered 312 pl lysbuffert genom blandning: 100 pl 6 M GuSCN, 200 pl 2-propanol och 12 pl 25x RNA Säkra.
- Värm 70% etanol, 100% etanol, kanal buffert och buffertar lys vid 60 ° C under 10-20 min för att aktivera RNA-Secure.
- Att jämvikta mikroflödessystem kanalen, kör kanalbuffert genom SPE kanalen vid en flödeshastighet av 0,8 ml / timme.
- Snabb-tina provet i VTM vid 37 ° C i vattenbad, och avlägsna provet omedelbart från vattenbad så snart den tinas.
- Centrifugera provet vid 13.000 rpm under 10 minuter, och överför 100 pl av supernatanten till 300 ul av lyseringsbuffert. Slutföra blandningen genom tillsats av 6 pl av 1 pg / pl RNA bärare.
- Vortex att blanda, och efter centrifugering för5 sekunder, ladda hela lysatet till en Luer-Lok 1 cc spruta.
- Kör lysat genom SPE kanalen vid en flödeshastighet av 0,8 ml / timme.
- Tvätta SPE kanalen med 100 pl 70% etanol, följt av 100 | il of100% etanol vid 1 ml / timme. (Det finns en 50 ul död volym i sprutspetsen som inte kommer att få skjuts ut, så egentligen bara 50 ul går genom kanalen.)
- Placera en tom spruta vid 0,5 ml-märket och tryck luft genom kanalen för att torka den vid 1 ml / timme.
- Run 67,5 pl nukleasfritt vatten genom kanalen för att eluera de bundna nukleinsyrorna vid 0,5 ml / h, och samla 13,5 pl från nanoport vid avfallet porten. (Den vätskeförlust beror på 54 pl dödvolymen i sprutspetsen och SPE-kanalen.)
3. RT-PCR
- Bered 36,5 pl av RT-PCR-huvudblandning under luften torr steget (2,12) med användning av reagensen i ett Qiagen OneStep RT-PCR kit.
- Fyll RT-PCR reagenset i nanoport i avfallet hamnen, och blanda med RNA för att få följande 50 ul RT-PCR-reaktionen: 13,5 pl eluerade RNA i nukleasfritt vatten, 4 pl RT-PCR enzymblandning, 10 ul Q-lösning, 10 μl1X en steg buffert, 2 pl 25 mM MgCb 2, 1 pl 50 pM framåt 5'-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3 ', 1 pl 50 pM omvänd primer 5'-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3 ', 2 pl dNTP, 0,75 jil 1,0% vikt / volym BSA, 0,73 pl PEG8000 och 5,02 pl nukleasfritt vatten.
- Fyll RT-PCR-blandningen i RT-kanalen genom försiktig vakuum (vi använde väggen vakuum) och försegla Nanoport med en sluten koppling.
- Applicera 35 V till värmaren 1. Förvara reagensen i RT-kanalen för 30 min efter värmaren 1 jämvikt vid 50 ° C. Förvara reagensen i RT-kanalen under 15 minuter efter det att värmaren 1 jämvikt vid 95 ° C.
- Applicera 27 V till värmaren 1 och 50 V värmare 2, vänta ca tre minuter eller tills värmaren 1 jämvikt vid 60 & deg, C och värmaren 2 jämvikt vid 95 ° C.
- Skjut reagens i PCR kanalen vid 0,5 | il / min. Det bör ta cirka 20 min för reagensen att strömma genom den slingrande kanalen.
- Eftersom provet gör det till slutet av Serpentine kanalen samla PCR-produkterna vid utloppet med en lämplig storlek pipett och dricks.
4. PCR-produkter Detektion
- Vi använder en Agilent Hög testkänslighet-DNA för att detektera produkterna. För att köra detta test ta ut Agilent Hög Kit känslighet DNA från kylskåpet 30 minuter före testning.
- Slå på Bioanalyzer och öppna 2100 Expert programvara.
- Ladda 1 pl PCR produkter till test och följ Agilent protokollet ( http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent% 20Manual.pdf ).
- Analysera och registrera data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett typiskt resultat visas i figur 3 för en influensa A infekterade nasofaryngeal tvätt prov. På grund av de olika mängderna av influensavirus i varje patientprov, kommer den slutliga koncentrationen av PCR-produkten kan variera. Ett bra resultat bör ha lågt brus, två tydliga toppar stege (35 och 10.380 bp) och en enda produkt topp vid den utformade produkten storlek (107 bp) för den positiva provet. Medan produkten toppen bör teoretiskt vara frånvarande för negativa kontroller, vi observerar falska PCR toppar nära influensa-specifika lokus från primerdimerer bildas i vissa prover. Flera produkter toppar hänsyn till potentiell kontaminering av testet. Om detta inträffar bör en annan delmängd av provet testas. Gelelektrofores kan användas för ytterligare kontroll av testresultaten 13.
i "FO: src =" / files/ftp_upload/50325/50325fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Förenklad uppifrån chip schematisk. De röda konturer visar placeringen av kontaktytorna värmarna på undersidan av chipset.
Figur 2. Den mikroflödessystem analys flödet 13. (A) Bild av två mikroflödessystem marker med bifogade tunn film värmare och två-fat sprutpump. Glassprutor anslöts till varje chip med flexibel slang för att ladda reagens och prover. Tre portar limmades vid inloppen av SPE kanalen och avfallet porten, och utloppet av PCR-kanalen (b) Kanal konstruktion med tre sektioner:. Provberedning (SPE), RT kammare och kontinuerligt flöde PCR-kanal. Två fasta motståndsvärmare är fästa genom termisk tejp till botten av chipet. Fluidflöde mellan kanalerna var laminärt, och förändringar i strömningsmotstånd tillåts för ventil-mindre drift. Djupet är 500 um för SPE och RT-kanalerna, och PCR-kanalen är 100 um djup. Bredderna är 500 um för SPE-kolonn, 1 mm för RT kammaren, och varierar från 200 till 400 | im för de breda och smala delar av det kontinuerliga flödet PCR-kanal. Chipet är 70 mm i längd, 25 mm bred och 1,4 mm hög. (C) mikroflödessystem analys processflöde. Den nasofaryngeal Provet blandas med lyseringsbuffert, appliceras på chipet är chipet körs och PCR-produkterna läses med hjälp av en kommersiell kapillärelektrofores chip. 13 Klicka här för att se större bild .
n "FO: src =" / files/ftp_upload/50325/50325fig3highres.jpg "/>
Figur 3. På chip slutpunkt diagnostiskt resultat. PCR-produkten topp är den mellersta toppen på storleken på 107 bp. Vänster (35 bp) och höger toppar (10.380 bp) är kontroll stege topparna. Koncentrationen av produkterna från varje topp är arean under kurvan. Dessa är sammanställda. (A) positivt resultat utan buller topp. (B) positivt resultat med primerdimerer vid 42 bp. Klicka här för att se större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den diagnostiska metoden som presenteras här visar förmågan hos en integrerad mikroflödessystem plast chip för att förstärka influensa A RNA från patientprover med hög specificitet och låg detektionsgräns 13 Vi har utformat detta chip för potentiell vårdplatsen testning:. (A) temperatur och fluid kontroll förenklades, (b) chipet är låg kostnad och lämplig för hög kapacitet tillverkning med formsprutning, och (c) chipet är av engångstyp och avsedd för engångsbruk, vilket minskar den oro som provet korskontaminering.
Även vår nuvarande on-chip runtime av 3 timmar, innehåller vår utvinning plattform gott om utrymme för processoptimering. Till exempel, kan tvätt-och torktider rätt före eluering minskas genom en kombination av ökning av flödeshastigheten och minska tvätt volymerna. Dessutom kan kostnaderna skäras genom att effektivisera chip tillverkningsprocessen och ersätta dyr eller besvärliga peripherals, såsom sprutpumpar, strömförsörjning, med alternativ som disponibel pumpar spruta infusion och små batterisatser Öppna upp den fasta fasen geometri extraktionskolonn och porositet kommer att möjliggöra betydande minskningar av pumpens krav. Dessutom, när chip design är standardiserad för massproduktion, kommer många av termoelementen används i enhetens utveckling elimineras.
Mer så än andra faktorer, beror robustheten i vår on-chip influensa upptäckt modul på både god temperaturkontroll och lämpligt prov överlämnande. Lätt förskjutning från den önskade på-chip temperatur, liksom oavsiktliga multipla frysnings-upptiningscykler av influensa provet, kan både minska den slutliga PCR-utbytet. Bortsett från dessa faktorer kan variationerna i vår on-chip PCR-resultat 13 från olika patientprover också tillskrivas: Variation i virusmängd, olika nivåer av förorenande mänskliga celler och Blood, förekomsten av PCR-inhibitorer efter nukleinsyra extraktion, 14,15 och oväntade kemiska och / eller fysikaliska reaktioner mellan proverna och testreagenser eller själva enheten 16.
Sammanfattningsvis har vi visat möjligheten att vår mikroflödessystem chip för att förstärka RNA från influensa A-virus i medicinskt relevanta nasofarynxprov. Chipet har potential att tillämpas på andra DNA-eller RNA-mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har förklarat inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av National Institutes of Health (NIH) bevilja R01 EB008268.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G | |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G | |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML | |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml | |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 | |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 | |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML | |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 | |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 | |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 | |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 | |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 | |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 | |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 | |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 | |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V | |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML | |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 | |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 | |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 | |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 | |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A | |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 | |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
References
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- WHO | World now at the start of 2009 influenza pandemic. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/ (2009).
- WHO | Pandemic (H1N1) 2009 - update 112. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/csr/don/2010_08_06/en/ (2009).
- Wenzel, J. J., et al. Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).
- Chan, K. H., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1. Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).
- Ginocchio, C. C., et al. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. Journal of. 45, 191-195 (2009).
- Aeron, C. H., et al. Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses. Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).
- Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting. Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).
- Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. Transducer'93, seventh international conference on solid state sensors and actuators. , 924-926 (1993).
- Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics. Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).
- Cao, Q., Kim, M. -C., Klapperich, C. Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments. Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).
- Cao, Q., et al. Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens. PLoS ONE. 7, e33176 (2012).
- Rådström, P. Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit. J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).
- Andreasen, D., et al. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50, S6-S9 (2010).
